韓宇星，孟凡強，周立邦，陸兆新

(南京農(nóng)業(yè)大學 食品科學技術(shù)學院，江蘇 南京，210095)

血漿中不溶性纖維蛋白和血小板凝結(jié)形成的血栓導(dǎo)致多種心血管疾病[1]，嚴重威脅著人們的健康，逐漸成為致死率第一的疾病[2]。目前市場上主流的血栓治療藥物有纖維蛋白溶酶原激活劑(tissue-type plasminogenactivator，t-PA)、鏈激酶(streptokinase，SK)和尿激酶(urokinase，UK)等。但是上述藥物存在半衰期短，價格昂貴等缺點。納豆激酶是從納豆中提取的堿性絲氨酸蛋白酶[3]，它具有良好的溶血栓效果。與市場上的溶栓藥物相比，它具有半衰期較長、成本低廉、特異性強、無副作用、可口服、安全性高等優(yōu)勢，是一種優(yōu)良的溶栓藥物替代物。但是，納豆桿菌液體發(fā)酵時產(chǎn)生的聚谷氨酸(polygutamic acid，γ-PGA)升高了發(fā)酵液黏度，導(dǎo)致納豆激酶的分離純化困難。γ-PGA是由谷氨酸通過肽鍵聚合而成，分子質(zhì)量在10～1 000 kDa左右[4]，黏度很高，且?guī)в须x子狀態(tài)的羧基基團，使得菌體細胞帶有負電荷，使發(fā)酵液達到一種穩(wěn)定狀態(tài)。發(fā)酵液需要稀釋多倍才能通過離心或者絮凝的方法去除菌體，因此降低γ-PGA 產(chǎn)量和發(fā)酵液黏度是提高納豆激酶生產(chǎn)效率的關(guān)鍵[5]。

γ-PGA合成酶分為兩類，分別是cap和pgs[6]。如炭疽桿菌的cap基因合成的γ-PGA結(jié)合在細胞壁上，作為莢膜的主要成分。而芽孢桿菌中pgs合成的γ-PGA游離在微生物周圍的環(huán)境中。pgs基因簇包含3個基因：pgsB、pgsC、pgsA。ASHIUCHI等[7]將含有pgsB、pgsC、pgsA、pgsAB、pgsAC、pgsBC、pgsABC的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，發(fā)現(xiàn)只有完整pgsABC基因才能合成出γ-PGA。隨后該研究室構(gòu)建了pgsBCA基因缺失的枯草芽孢桿菌ISW1214(突變體MA41)[8]，結(jié)果表明該枯草芽孢桿菌不能產(chǎn)生γ-PGA[8]，因此pgsB、pgsC和pgsA是γ-PGA合成必要的基因[9]。為提高γ-PGA的產(chǎn)量，研究人員將pgsBCA基因?qū)胫疗渌乃拗骷毎磉_γ-PGA，如石峰等[10]、馬婕等[11]將枯草芽孢桿菌中的pgsBCA基因轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，重組的大腸桿菌也成功的合成出了γ-PGA。而在pgsBCA3個基因中，pgsB基因被認為是構(gòu)成γ-PGA 合成的最主要催化部分[12]。研究人員研究了對pgsB的蛋白序列，并將其蛋白序列與ATP 酶對比，發(fā)現(xiàn)二者的相似度極高，說明pgsB可能具有ATP酶的活性并且可以結(jié)合ATP[13]。而對pgsB單獨催化時發(fā)現(xiàn)，僅pgsB也可以聚合產(chǎn)生γ-PGA，不過前提是，pgsB的2種狀態(tài)需要同時存在[14]。

基于以上的研究，為了提高納豆激酶的分離純化效率，本文擬利用雙交換重組的方法敲除納豆桿菌中γ-PGA合成的關(guān)鍵基因pgsB，旨在減少發(fā)酵液的黏度，提高納豆激酶的分離純化效率，以期得到一種高效、簡便的納豆激酶工業(yè)化提純方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

Bacillusnatto400為本實驗室篩選的納豆激酶高產(chǎn)菌，來源于野生菌株B.natto；大腸桿菌JM109(EscherichiacoliJM109)，北京百斯凱公司；質(zhì)粒pCBS(溫度敏感型復(fù)制子、大腸桿菌中氨芐青霉素抗性、芽孢桿菌中紅霉素抗性)，為本實驗室保存；引物，南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司，引物序列如表1所示。

表1 敲除和鑒定pgsB基因的引物Table 1 Primers for deletion and identification of pgsB

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

TaqDNA聚合酶、高保真phanta酶、一步克隆試劑盒、DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，南京諾唯贊公司；氨芐青霉素、紅霉素，Sigma公司。

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10、酵母粉5、氯化鈉5；一級種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖10、蛋白胨10、酵母膏5、氯化鈉10；二級種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20、蛋白胨10、酵母膏5、氯化鈉10，pH 7.2。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖10、大豆粉40、磷酸氫二鉀1、硫酸鎂0.5、磷酸二氫鈉4、氯化鈣0.2、硫酸錳0.05、消泡劑1；發(fā)酵罐補料(g/L)：蔗糖500、葡萄糖50；硼砂緩沖液：50 mmol/L硼砂、150 mmol/L氯化鈉，pH 8.5；纖維蛋白原溶液：72 mg纖維蛋白原溶于硼砂緩沖液；凝血酶：溶于硼砂緩沖液，濃度1 000 U/mL，使用時用硼砂緩沖液稀釋到20 U/mL，-20 ℃保存。磷酸鹽緩沖液(g/L)：磷酸氫二鈉7.2，磷酸二氫鈉2.8，pH 7.2。

1.2 實驗方法

1.2.1 PCR擴增pgsB上游片段和下游片段

以B.natto400 DNA為模板，以pgsB-Up-F和pgsB-Up-R為引物，PCR擴增pgsB基因的上游片段(463 bp)。以pgsB-Dn-F和pgsB-Dn-R為引物，PCR擴增獲pgsB基因的下游片段(473 bp)。PCR的擴增條件為：預(yù)變性95 ℃、5 min；變性95 ℃、20 s，退火55 ℃、20 s，延伸72 ℃、30 s，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸2 min。膠回收PCR產(chǎn)物，得到分別帶有上下游同源臂的pgsB-up和pgsB-dn。

1.2.2 touchdown PCR 構(gòu)建pgsB缺失突變基因

采用touchdown PCR的方法將pgsB基因上下游同源臂連接到一起，得到pgsB的缺失突變基因ΔpgsB。以純化后的pgsB-up和pgsB-dn作為模板，以pgsB-Up-F和pgsB-dn-R為引物，進行touchdown PCR。擴增條件為：預(yù)變性95 ℃、2 min，變性95 ℃、15 s，退火60 ℃、15 s，延伸72 ℃、1 min；共5個循環(huán)，每次循環(huán)退火溫度降低1 ℃；隨后變性95 ℃、15 s，退火55 ℃、15 s，延伸72 ℃、1 min，共30個循環(huán)，最后72 ℃延伸2 min。膠回收PCR產(chǎn)物，得到帶有上下游同源臂的pgsB堿基缺失的基因片段ΔpgsB。

1.2.3 構(gòu)建同源重組雙交換的載體

使用諾唯贊質(zhì)粒提取試劑盒提取pCBS質(zhì)粒，并以其為模板，以CBS-BB-R和CBS-BB-F為引物反向PCR擴增獲得載體(8 098 bp)，擴增條件為：預(yù)變性95 ℃、1 min，變性95 ℃、20 s，退火55 ℃、20 s，延伸72 ℃、4.5 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min。膠回收PCR產(chǎn)物，得到pCBS載體。使用諾唯贊一步克隆試劑盒，將ΔpgsB與pCBS載體連接，并轉(zhuǎn)化至E.coliJM109感受態(tài)細胞。在含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子，PCR驗證陽性轉(zhuǎn)化子，測序驗證后獲得用于pgsB敲除的重組質(zhì)粒pCBS-ΔpgsB。

1.2.4 納豆桿菌轉(zhuǎn)化

參照李瑞芳等[15]制備枯草芽孢桿菌超級感受態(tài)的方法制備納豆桿菌感受態(tài)細胞，參照陸雁等[16]質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的方法，將15 μL質(zhì)粒pCBS-ΔpgsB加入到500 μL納豆桿菌感受態(tài)中，輕輕搖勻，30 ℃，100 r/min培養(yǎng)30 min，之后再加入600 μL含有5 μg/mL紅霉素的LB培養(yǎng)基，30 ℃，200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h，菌液10 000×g離心30 s，用100 μL上清液重懸菌體，涂布于含10 μg/mL紅霉素的LB固體平板，30 ℃靜置培養(yǎng)12 h。以check-F/R為引物，PCR驗證質(zhì)粒是否轉(zhuǎn)化進入納豆桿菌。

1.2.5 藍白斑篩選

將測序驗證后的陽性轉(zhuǎn)化子在42 ℃下轉(zhuǎn)接LB培養(yǎng)基培養(yǎng)2次，在含10 μg/mL紅霉素的固體LB平板上涂布40 μL質(zhì)量濃度為20 mg/mL的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside，X-Gal)溶液，再涂布100 μL的菌液。在42 ℃下培養(yǎng)12 h，4 ℃冷藏8 h后，挑取藍色菌落(單個同源臂重組)。在30 ℃培養(yǎng)12 h后涂布至含X-Gal的LB固體平板上，30 ℃培養(yǎng)12 h，4 ℃冷藏8 h后，挑取白色菌落(2個同源臂重組)，進行PCR驗證并測序。

1.2.6pgsB基因敲除菌株發(fā)酵生產(chǎn)納豆激酶

將測序驗證后的B.natto400ΔpgsB株在LB平板上劃線，37 ℃下培養(yǎng)12 h。將單菌落接種于一級種子培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min搖床中培養(yǎng)12 h。以5%接種量接種于二級種子液中，培養(yǎng)4 h(對數(shù)生長中期)。將50 L通氣攪拌式發(fā)酵罐滅菌，配制20 L的發(fā)酵培養(yǎng)基，采用火焰接種法接種二級種子液(5%接種量)。調(diào)節(jié)發(fā)酵參數(shù)：溫度37 ℃、通風比為1∶1、攪拌轉(zhuǎn)速400 r/min、溶解氧(dissolved oxygen，DO)>20%。通過氨水和10 %磷酸控制發(fā)酵液pH 7.2，通過連續(xù)補料(補料培養(yǎng)基)的方法控制培養(yǎng)基糖含量在0.5%～1.0%(質(zhì)量分數(shù))。在該條件下培養(yǎng)24 h之后放罐。

1.2.7 納豆激酶酶活力的測定

在1.4 mL硼砂緩沖液中加入0.4 mL纖維蛋白原溶液，37 ℃孵育5 min。再加入0.1 mL凝血酶，顛倒混勻，37 ℃水浴10 min，使纖維蛋白凝固(模擬血栓)。隨后加入0.1 mL離心后的發(fā)酵上清液，顛倒混勻，37 ℃水浴60 min，每20 min顛倒混勻幾次。最后加入0.2 mol/L三氯乙酸，顛倒混勻，終止反應(yīng)并靜置20 min。12 000×g離心10 min，上清液通過紫外分光光度計測定A275。對照樣品先加入三氯乙酸，再加入待測菌液，酶活力計算如公式(1)所示：

(1)

式中：Ar為待測樣品的吸光度，AC為對照樣品的吸光度，D為稀釋倍數(shù)。

1.2.8 γ-PGA含量的測定

發(fā)酵液10 000×g離心20 min，取上清液，加入等體積的無水乙醇，10 000×g離心10 min，棄上清液，烘干后稱量沉淀的重量，該重量即為γ-PGA產(chǎn)量。

1.2.9 發(fā)酵液黏度的測定

采用NDJ-9SB型旋轉(zhuǎn)黏度計對發(fā)酵液黏度進行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 ΔpgsB片段的構(gòu)建

以B.natto400的DNA為模板，以pgsB-Up-F、pgsB-Up-R、pgsB-Dn-F、pgsB-Dn-R為引物擴增pgsB上下游同源臂，凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1所示，在500 bp左右處出現(xiàn)特異性條帶，與理論長度463、473 bp相符。以純化后的上下游同源臂為模板，以pgsB-Up-F、pgsB-Dn-R為引物，采用touchdown PCR的方法構(gòu)建缺失突變的pgsB片段(ΔpgsB)，結(jié)果如圖2所示，在1 000 bp左右處出現(xiàn)特異性條帶，與理論長度918 bp相符，表明ΔpgsB片段構(gòu)建成功。

M-DS2000 marker；1-目的基因上游片段；2-目的基因下游片段圖1 pgsB上下游同源臂電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of homologous arms of pgsB

M-DS2000 marker；1-突變的pgsB片段圖2 pgsB缺失突變基因(ΔpgsB)電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of pgsB gene with deletion mutation (ΔpgsB)

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

ΔpgsB基因和載體pCBS通過一步克隆試劑盒連接到一起，隨后轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細胞中，涂布至含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，用引物check-F/R對氨芐青霉素平板上生長的菌落進行菌液PCR篩選，結(jié)果如圖3所示。

M-1 000 bp marker；1-重組質(zhì)粒PCR驗證 圖3 重組質(zhì)粒pCBS-ΔpgsB電泳圖Fig.3 Electrophoretogram of recombinant plasmid pCBS-ΔpgsB

2.3 同源重組雙交換

按照諾唯贊質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒pCBS-ΔpgsB。并將pCBS-ΔpgsB轉(zhuǎn)入納豆桿菌感受態(tài)細胞內(nèi)，在含紅霉素的LB固體培養(yǎng)基上篩選，PCR驗證條帶。接著按照1.2.5進行藍白斑篩選，將陽性轉(zhuǎn)化子在42 ℃條件下轉(zhuǎn)接2次，在含紅霉素的LB平板篩選藍色菌，在30 ℃培養(yǎng)后，挑取白色菌落，用引物check-F/R進行PCR驗證，結(jié)果如圖4所示。在1 000 bp左右處出現(xiàn)特異性條帶，說明ΔpgsB基因已經(jīng)成功整合到納豆桿菌基因組上，pgsB基因敲除完成。

M-DS2000 marker；1～2-陽性轉(zhuǎn)化子PCR驗證圖4 納豆桿菌ΔpgsB菌落PCR驗證Fig.4 Colony verification of B.natto ΔpgsB by PCR

2.4 pgsB基因的敲除對γ-PGA產(chǎn)量的影響

2.4.1 在錐形瓶中pgsB基因的敲除對γ-PGA產(chǎn)量及納豆激酶活力的影響

將ΔpgsB株與野生型菌株活化后在搖瓶中發(fā)酵，每隔2 h取出1瓶測定其黏度、OD600、γ-PGA含量以及發(fā)酵液酶活力。結(jié)果表明野生型菌株與ΔpgsB株均在培養(yǎng)10 h左右進入穩(wěn)定期(圖5-a)。野生型菌株發(fā)酵液的黏度在18 h前呈上升趨勢，在18 h左右達到頂峰，隨后快速下降。而ΔpgsB株發(fā)酵液的黏度在16 h前呈上升趨勢，在16 h左右達到頂峰，之后緩慢下降。在培養(yǎng)22 h之前，兩者的發(fā)酵液在黏度上存在顯著性差異(圖5-b)。野生型菌株發(fā)酵液中γ-PGA的含量均顯著的高于ΔpgsB株，在14 h左右野生型菌株γ-PGA的含量達到最大值，為28.536 g/L。而pgsB基因敲除后，γ-PGA含量顯著下降。在14 h 左右γ-PGA含量僅為5.157 g/L，是野生型的18.07%(圖5-c)。兩者的發(fā)酵液中納豆激酶活力在24 h之前沒有顯著的差異(圖5-d)。該結(jié)果說明，pgsB基因的敲除對菌體生長和納豆激酶的產(chǎn)生并沒有顯著影響，但是γ-PGA含量以及發(fā)酵液黏度顯著降低。

a-搖瓶發(fā)酵液菌體密度；b-搖瓶發(fā)酵液黏度；c-搖瓶發(fā)酵液γ-PGA含量；d-搖瓶發(fā)酵液酶活力圖5 搖瓶發(fā)酵相關(guān)參數(shù)測定Fig.5 Determination of fermentation parameters in shaking flask注：*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)(下同)

2.4.2 在50 L發(fā)酵罐中pgsB基因的敲除對γ-PGA產(chǎn)量及納豆激酶活力的影響

在50 L發(fā)酵罐中，野生型菌株在培養(yǎng)18 h時菌體密度達到最高(OD600=24)，隨后緩慢下降。而ΔpgsB株在10 h達到穩(wěn)定期(OD600=20)，生長速度顯著高于野生菌(圖6-a)。而從黏度曲線來看，ΔpgsB株的發(fā)酵液黏度顯著低于野生型菌株發(fā)酵液的黏度(圖6-b)。發(fā)酵罐中γ-PGA含量的變化趨勢與其在搖瓶中趨勢大致相同，野生型菌株的γ-PGA產(chǎn)量在14 h前不斷上升，在14 h達到最大值28.46 g/L，隨后緩慢下降，而ΔpgsB株的γ-PGA產(chǎn)量較低，在8 h達到最高值15 g/L。發(fā)酵24 h后，ΔpgsB株γ-PGA的產(chǎn)量為8.19 g/L，僅為野生型菌株的42.1%(圖6-c)。根據(jù)1.2.7的方法，測試ΔpgsB株及野生型納豆桿菌發(fā)酵24 h的酶活力，ΔpgsB株的酶活力為23.4 FU/mL，野生型菌株的酶活力為20.3 FU/mL，酶活力提高了15.2 %(圖6-d)，綜上所述，pgsB基因敲除后，納豆桿菌發(fā)酵液黏度降低，納豆激酶酶活力提高。

a-發(fā)酵罐發(fā)酵液菌體密度；b-發(fā)酵罐發(fā)酵液黏度；c-發(fā)酵罐發(fā)酵液γ-PGA含量；d-發(fā)酵罐發(fā)酵液酶活力圖6 發(fā)酵罐發(fā)酵相關(guān)參數(shù)測定Fig.6 Determination of fermentation parameters in fermentor.

2.5 pgsB基因的敲除對納豆激酶分離純化的影響

發(fā)酵液8 000×g離心20 min后獲得納豆激酶粗酶液，用30 kDa與10 kDa的超濾管對粗酶液超濾，超濾時間為30 min。由于野生型發(fā)酵液經(jīng)過離心后黏度仍然大于ΔpgsB株的發(fā)酵液，故超濾效率較低，野生型發(fā)酵液的超濾通量為0.1 mL/min，而ΔpgsB株的超濾通量為0.12 mL/min，較野生型提高了20%。此外，野生型經(jīng)超濾后，酶活力回收率為48.75%，而ΔpgsB株的酶活力回收率為58.97%，比野生株提高了10.22%。所以，pgsB基因的敲除提高了納豆激酶分離純化的效率。

3 討論

納豆激酶的分離純化方法包括超濾法[17]、雙水相分離[18]、柱層析柱[19]、反相膠束萃取法[20]、磁性微球吸附法[21]、集成化分離技術(shù)[22]等，但尚未有從分子層面減少發(fā)酵液黏度以提高納豆激酶分離效率的報道。本文利用雙交換基因重組技術(shù)，敲除了納豆桿菌中γ-PGA的合成基因pgsB。在50 L發(fā)酵罐發(fā)酵中，相對于野生型納豆芽孢桿菌，ΔpgsB株產(chǎn)生的γ-PGA顯著減少，在發(fā)酵24 h時，野生型菌株γ-PGA 的產(chǎn)量為19.46 g/L，而ΔpgsB株的產(chǎn)量僅為8.19 g/L，下降了57.9%。相應(yīng)的ΔpgsB株發(fā)酵液的整體黏度也低于野生型菌株，而納豆激酶酶活力相對于野生型菌株提高了3 FU/mL。原因可能是敲除pgsB基因后，發(fā)酵液黏度降低，改善了溶氧條件和營養(yǎng)物質(zhì)傳遞。此外發(fā)酵液黏度下降后，納豆激酶的分離純化也更加的便捷，降低了生產(chǎn)成本，提高了納豆激酶的分離純化效率。

納豆桿菌pgsB基因被敲除后，γ-PGA產(chǎn)量下降，但仍然有γ-PGA合成。研究表明，控制枯草芽孢桿菌合成γ-PGA的基因主要是pgsA、pgsB及pgsC。雖然pgsB的基因被敲除了，但pgsA和pgsC也可能合成γ-PGA。因此后續(xù)實驗中將敲除pgsA和pgsC，進一步降低γ-PGA的產(chǎn)量和發(fā)酵液的黏度。此外，除了pgsB、pgsA及pgsC，γ-PGA的產(chǎn)生也受多種基因的調(diào)控，研究表明在枯草芽孢桿菌中，高濃度磷酸化的DegU對pgsB、pgsC、pgsA的轉(zhuǎn)錄有促進作用[23]。除了DegU外，高濃度的DegQ也可以調(diào)節(jié)pgsB的轉(zhuǎn)錄[24]。所以，要減少γ-PGA的產(chǎn)生，提高分離純化效果，還需要進一步的研究。