畢天然，黃鈞，張宿義，陳曉茹，陳蘇祺，母雨，蔡曉波，邱川峰，周榮清*

1(四川大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都，610065)2(瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州，646000)

濃香型白酒是復(fù)雜的微生物種屬協(xié)同作用的結(jié)果。在其漫長的重復(fù)生產(chǎn)過程中，環(huán)境脅迫作用驅(qū)動窖泥微生物群落的定向進(jìn)化是生產(chǎn)高質(zhì)量基酒的必要條件[1]，尤其是發(fā)酵后期，窖泥中棲息的功能菌群對獨特風(fēng)味的形成具有重要作用[2]。已完成的研究結(jié)果表明，窖池中所棲息的Clostridiaceae、Ruminococcaceae、Methanosaeta、Methanobacterium、Methanocorpusculum等功能菌群隨著窖齡的增長而增多，Lactobacillus則降低，小生境中氧、酸及乙醇脅迫作用是驅(qū)動其變化的主要因素[3-5]。窖池的不同位置窖泥菌群多樣性差異顯著，DING等[6]在窖壁泥中檢出Acinetobacter，而窖底泥未檢出，WANG等[7]報道Lactobacillus豐度隨窖池深度增加而減小，而Clostridium與之相反。近年來高通量測序技術(shù)已成為研究群落的重要工具之一，廣泛應(yīng)用于白酒的研究[5, 8]。熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)技術(shù)是細(xì)胞水平表征活細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)輪廓的有效手段之一，曾與PCR-DGGE組合，從分子和細(xì)胞水平表征濃香型白酒釀造過程的群落特征[9]。

本文基于Illumina Miseq測序等多相技術(shù)，探尋不同窖齡窖池窖壁和窖底泥微生物群落及主要代謝組分的差異，應(yīng)用生物信息學(xué)方法解析了群落中種屬間互作關(guān)系及其與主要代謝組分的相關(guān)性。旨在多尺度研究窖泥中核心功能菌群的代謝調(diào)控規(guī)律，為詮釋濃香白酒釀造過程微生態(tài)理論奠定基礎(chǔ)，為優(yōu)化生產(chǎn)過程提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品收集

樣品：窖泥樣取自瀘州老窖股份有限公司(四川瀘州)的30、100、200年窖齡窖池。參考DING等[3]所述方法分別從窖壁和窖底采樣，每樣取200 g，無菌PE袋密封后保存于-20 ℃冰箱。30、100、200年窖池的窖壁(JB)和窖底(JD)泥的編號分別是JB30、JD30、JB100、JD100、JB200和JD200。

1.2 主要理化性質(zhì)檢測

pH測量：參考HU等[8]所述方法，準(zhǔn)確稱取2.00 g窖泥，加6 mL超純水，渦旋振蕩5 min，超聲30 min，離心(12 000 r/min，4 ℃)10 min，上清液用于pH測量。

總酸和總酯測定：準(zhǔn)確稱取10.00 g窖泥，加入到100 mL 30%乙醇溶液中，渦旋振蕩5 min，超聲30 min，4 ℃過夜浸提，濾紙過濾，濾清液按照GB/T 10345—2007所述的方法測定總酸和總酯。

1.3 代謝組分分析

有機酸測定：準(zhǔn)確稱取5.00 g窖泥, 加20 mL 9 mmol/L H2SO4溶液，超聲60 min，其間每隔15 min渦旋振蕩5 min，離心(12 000 r/min，4 ℃)10 min收集上清液，上清液經(jīng)活化后的C18SPE小柱純化，再經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，濾液參考DUBER等[10]所述HPLC法檢測有機酸含量。以標(biāo)準(zhǔn)品乳酸、乙酸、丙酸、丁酸和己酸的保留時間確定樣品中有機酸種類，并通過外標(biāo)法計算含量。

色譜條件：色譜柱為Alltech OA-1000(300 mm×7.8 mm)有機酸柱，流動相為9 mmol/L H2SO4溶液，流速0.3 mL/min，紫外檢測器，檢測波長210 nm，柱溫75 ℃，進(jìn)樣量10 μL，Agilent 1260高效液相色譜儀(Agilent Technology，美國)。

揮發(fā)性組分測定：參考DING等[11]所述的頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(headspace solid phase microextraction combined with gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS)測定樣品的揮發(fā)性組分。準(zhǔn)確稱取0.50 g窖泥于頂空瓶中，加入10 μL 5.1 mg/L辛酸甲酯內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，60 ℃水浴中平衡15 min、50/30 μm DVB/CAR/PDMS纖維萃取頭吸附50 min，取出后插入進(jìn)樣口，250 ℃解離5 min進(jìn)行GC-MS分析。樣品質(zhì)譜數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)譜庫(NIST2005)比對，匹配度>800(最大為 1 000)的物質(zhì)予以報道，采用內(nèi)標(biāo)法對樣品中各檢出物質(zhì)進(jìn)行半定量。

色譜-質(zhì)譜條件：色譜柱為HP-INNOWAX毛細(xì)管色譜柱(30.0 m×0.32 mm×0.25 um， Agilent， USA)；升溫程序：40 ℃保持5 min，然后以 4 ℃/min 升至 100 ℃，再以6 ℃/min升至 230 ℃，保持10 min，進(jìn)樣口溫度250 ℃；高純氦作為載氣，流速 1.0 mL/min；離子源溫度和連接線溫度分別為230、250 ℃；EI 電子能量為70 eV；質(zhì)譜掃描范圍為 35～400 amu，Trace GC Ultra-DSQ II氣相色譜-單四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(Thermo Fisher Electron，美國)。

1.4 高通量測序檢測微生物群落組成

按照HE等[12]所述步驟，采用Fast DNA SPIN試劑盒(MP Biomedicals，Santa Ana，CA，USA)提取樣品DNA，NanoDrop ND-1000光度計(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)和1%瓊脂糖電泳檢測提取的DNA含量、純度和完整性。338F/806R和A RC787F/ARC1059R分別用于細(xì)菌和古菌16S rDNA 基因V3～V4高變區(qū)和ARC區(qū)的擴(kuò)增，而ITS5/ITS1擴(kuò)增真菌ITS1區(qū)。PCR流程參考LI等[13]，PCR產(chǎn)物切膠獲得目的片段并純化回收，分光光度計測定后，等分子質(zhì)量混合。通過試劑盒MiSeq ReagentKit v3構(gòu)建文庫后，送上海派森諾生物科技有限公司Illumina MiSeq平臺測序。

測序數(shù)據(jù)刪除堿基平均質(zhì)量≤Q20及模糊序列，F(xiàn)LASH 軟件(V1.2.7，http://ccb.jbu.edu/software/FLASH)拼接初步篩選的雙端序列(堿基重疊長度>10 bp，且無堿基錯配)，將拼接后的序列分配到相應(yīng)的樣本中，獲得有效序列。QIIME 軟件(Quantitative Insights Into Microbial Ecology，v1.8.0，http://qiime.org/)刪除低質(zhì)量序列(長度≤150 bp，5′端堿基錯配>1和相同堿基>8的序列)獲得高質(zhì)量序列。使用UCLUST把高質(zhì)量序列按照97%的序列相似度聚成不同的可操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)。分別采用Greengenes數(shù)據(jù)庫(Releasese 13.8，http://greengenes secondgenome.com/)和 UNIT 數(shù)據(jù)庫(Release 5.0，http://unite.ut.ee/)作為OTU分類鑒定的模板序列，獲得每個OTU的微生物分類信息?；诿總€ OTU在各樣本中所含序列數(shù)構(gòu)建OTU矩陣，確定微生物在各樣品中的相對豐度。

1.5 熒光原位雜交檢測群落組成輪廓

準(zhǔn)確稱取1.00 g窖泥，加25 mL 10 mmol/L PBS(pH 7.2)緩沖液，渦旋振蕩5 min，離心(800 r/min，4 ℃)10 min收集上清液，上清液離心(12 000 r/min，4 ℃)10 min收集沉淀，相同緩沖液重復(fù)3次，獲得的菌體沉淀為FISH檢測樣品，參照何翠容等[14]所述條件與步驟進(jìn)行FISH檢測，靶向探針見表1。

表1 熒光原位雜交靶向探針Table 1 Target probes of fluorescence in situ hybridization

1.6 數(shù)據(jù)處理

熱圖分析、非加權(quán)組平均聚類分析(unweighted pair-group method with arithmetic means, UPMGA)和冗余分析(redundancy analysis，RDA)使用R語言軟件(R x64 3.6.1，https://r-project.org/)完成。SPSS 19.0軟件(SPSS Inc.Chicago，IL，USA)用于Spearman′s相關(guān)系數(shù)分析和單因素顯著性分析，并根據(jù)Spearman′s相關(guān)系數(shù)繪制群落關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖。每組檢測重復(fù)3次，所得數(shù)值結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表征。

2 結(jié)果與分析

2.1 窖齡及位置對窖泥理化和主要代謝組分的影響

如表2所示，不同窖齡窖底泥pH和總酸差異不大，總酯的含量則是JD200>JD30>JD100。以不銹鋼蓋代替泥封窖的100年窖池，窖壁泥pH高于其余2種窖齡，總酸和總酯含量相反。窖底泥的總酸和總酯含量顯著高于窖壁泥，JB100的pH高于JD100，其余2種窖齡的窖底和窖壁泥pH略有差異，類似曾報道的結(jié)果[16]。

表2 理化及主要代謝組分的差異Table 2 Differences of physiochemical properties and main metabolic components

各樣品共檢出了5種有機酸和31種酯類成分，有機酸及10種優(yōu)勢酯類組分(豐度排名前10),含量如表2所示。窖底泥有機酸及這些酯類組分總含量顯著高于窖壁泥，窖底泥間有機酸含量略有差異，JD100酯類組分最低。JB100有機酸和酯類組分含量顯著低于JB30和JB200，后兩者間也略有差異。JB30中乳酸、乙酸和丁酸是優(yōu)勢有機酸，JB200乳酸是優(yōu)勢有機酸，乙酸和丁酸次之。JB100僅檢出己酸乙酯、辛酸乙酯、己酸己酯和己酸辛酯，其中己酸己酯的豐度是76.77%，JD100己酸己酯豐度是53.13%。30年和200年窖池泥中的己酸乙酯、辛酸乙酯、己酸已酯和己酸辛酯是優(yōu)勢組分，JB30中己酸乙酯和己酸己酯的豐度

2.2 窖齡及位置對微生物群落α-多樣性的影響

如表3所示，100年窖池的細(xì)菌α-多樣性指數(shù)中的Chao1及Observed species高于30年和200年窖池?？赡芤蚍饨逊绞讲煌龃罅思?xì)菌的物種數(shù)，且窖壁和窖底物種數(shù)量差異顯著。200年窖池中細(xì)菌物種數(shù)略低于30年窖池，無論是稀有還是豐富物種，30年和100年窖池細(xì)菌菌群易被外源物種擾動，尤其是100年窖池。30年和100年窖池泥中的古菌群的物種數(shù)量低于200年的，且隨著窖齡的增長，窖壁和窖底泥差異減小。真菌的物種數(shù)量僅略有差異。

表3 不同窖泥微生物群落α-多樣性的差異Table 3 Differences of microbial communities′ α-diversity among pit muds

基于Bray-Curtis距離的微生物群落UPMGA結(jié)果如圖1所示。JB200和JD200的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)類似，100年窖池的也僅略有差異，JB30和JD30差異顯著，類似DENG等[17]的結(jié)果。每個窖池古菌群落均未聚到一簇，與α-多樣性所呈現(xiàn)的規(guī)律一致。JB200真菌結(jié)構(gòu)與其余窖泥差異顯著。

a-細(xì)菌;b-古菌;c-真菌圖1 不同窖泥微生物群落聚類分析Fig.1 Cluster analysis of microbial communities in pit muds

2.3 窖齡及位置對微生物群落組成的影響

如圖2所示，群落中的優(yōu)勢種屬(相對豐度>1%)分別由44種細(xì)菌、10種古菌及13種真菌組成，相對豐度總和分別為88.4%～92.8%、98.8%～99.7%和92.1%～97.4%。優(yōu)勢細(xì)菌主要是ChristensenellaceaeR-7 group等12個種屬。熱圖分析表明Clostridiumsensustricto12、uncultured_Clostridiaceae1、Caproiciproducen、unclassified_Ruminococcaceae和ChristensenellaceaeR-7 group等5個種屬的豐度與窖齡呈正相關(guān)，類似WANG等[4]報道的結(jié)果。Clostridium和Caproiciproducens分別能將乙醇和乳酸轉(zhuǎn)化為己酸[18-19]等濃香型白酒呈香組分的前體物質(zhì)。窖底泥中ChristensenellaceaeR-7 、groupAminobacterium、Petrimonas和uncultured_Clostridiaceae1的豐度高于窖壁泥，可能與窖底厭氧程度有關(guān)[20-22]。7個隸屬于梭菌綱的屬豐度為36.4%，與窖齡有關(guān)，4個隸屬于梭菌綱、擬桿菌綱和互養(yǎng)菌綱的屬豐度為16.6%，與位置有關(guān)。30年和200年窖池中Lactobacillus的平均豐度(36.9%和8.8%)顯著高于100年窖池(0.9%)。

圖2 不同窖泥屬水平優(yōu)勢微生物群落組成熱圖Fig.2 Heat map of dominant microbial communities in pit muds at genus level

Methanobacterium、Methanoculleus、Methanosarcina和unclassified_Nitrosopumilaceae是主要優(yōu)勢古菌，與位置有關(guān)。窖底泥甲烷菌及Methanobacterium的豐度較窖壁泥高，而Methanosarcina相反。unclassified_Nitrosopumilaceae是好氧菌[24]，在窖壁泥中的豐度高于窖底泥，此外在100年窖池中豐度最低。

Dipodascus、Candida、Apiotrichum、unclassified_Dipodascacea、unidentified_Dipodascaceae和unclassified_Saccharomycetales是主要優(yōu)勢真菌。隸屬于Dipodascaceae的3種屬在所有窖泥中均被檢出，豐度在24.9%～90.2%，Dipodascus在Dipodascaceae中的比例>52.2%。Candida在JB200中的豐度是53.6%，在其余5個窖泥中則< 5.4%。Candida能代謝乙醇和乳酸轉(zhuǎn)化為風(fēng)味組分[24]。

應(yīng)用FISH檢測3種不同窖齡窖泥中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)結(jié)果如表4所示。JB100真細(xì)菌的數(shù)量高于JB30的，JD100真細(xì)菌數(shù)量高于JD30和JD200的。梭菌屬的數(shù)量在窖底高于窖壁，且隨著窖齡延長而增高，100年窖池梭菌屬的比例略高于其余2種窖齡。產(chǎn)甲烷古菌的總量隨窖齡增長而增高，窖壁氫營養(yǎng)型古菌的比例隨窖齡增加而增高，窖底泥中則是乙酸營養(yǎng)型古菌的比例增高。值得注意的是FISH檢測的結(jié)果與高通量測序的結(jié)果顯著不同，前者檢出的甲烷桿菌目的比例>36%，而后者的結(jié)果<3%，主要是因為FISH是活細(xì)胞水平檢出，而后者在OTU水平，樣品既包括活細(xì)胞又有死亡細(xì)胞，引物和擴(kuò)增速率誤差等干擾也難避免。2種方法的趨勢相同則從細(xì)胞和分子水平反映窖齡及位置的影響規(guī)律。

表4 窖泥微生物群落的熒光原位雜交檢測結(jié)果 單位：109cell/g

綜合以上分析，窖池的環(huán)境，尤其是酸度/pH顯著影響群落結(jié)構(gòu)及代謝，群落及代謝又影響窖泥小生境，這些因素互作是窖泥群落定向進(jìn)化的關(guān)鍵環(huán)境脅迫作用[25]，封窖方式則可能是影響定向進(jìn)化另一個關(guān)鍵的環(huán)境脅迫因素。

2.4 優(yōu)勢菌的相關(guān)性分析

基于斯皮爾曼相關(guān)性 (|ρ|>0.6，P<0.05)分析豐度> 1.0%屬水平的微生物的結(jié)果如圖3所示。這些微生物包含54對共現(xiàn)、26對排斥關(guān)系。模塊化分析結(jié)果表明關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)主要由模塊內(nèi)和模塊間互作等2種關(guān)聯(lián)模式構(gòu)成。在模塊內(nèi)關(guān)聯(lián)的3個模塊中，module_1的Caproiciproducens和Clostridiumsensustricto12呈正相關(guān)，這2個屬隨窖齡的變化趨勢相同，它們是窖泥中主要的己酸菌，能夠通過逆向β-氧化合成乙酸、丁酸和己酸，其中乙酸和丁酸是己酸合成中的電子受體[26]，兩者的一些產(chǎn)物互為彼此的二次發(fā)酵底物。module_6則是Methanosarcina與Anaerocella呈正相關(guān)，豐度與位置的關(guān)系相同。module_3中Methanoculleus和Methanofollis呈正相關(guān)，它們同為甲烷微菌科古菌，生理特性和應(yīng)激能力相似，在窖池微環(huán)境變化的過程中具有相同的變化趨勢。這類網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)簡單，節(jié)點數(shù)較少，窖池微環(huán)境的變化如乳酸、含氧量等可能是引起微生物群落發(fā)生變化的主要因素。模塊間關(guān)聯(lián)共有4個模塊，又分為多對一和多對多的2類互作關(guān)系。在多對一的互作關(guān)系中，如module_7和module_8，Sedimentibacter和Syntrophomonas等為中心的共現(xiàn)群落與Lactobacillus和Candida共現(xiàn)對間呈負(fù)相關(guān)，而與Dipodascus呈正相關(guān)。在多對多的互作關(guān)系中，如module_4和module_5，Petrimonas與Methanobacterium等組成的共現(xiàn)群落與由unclassified_Nitrosopumilaceae等組成的共現(xiàn)群落以及由uncultured_Clostridiaceae1等組成的互作群落之間呈負(fù)相關(guān)。這類互作關(guān)系，除自身復(fù)雜外，群落豐度還與位置有關(guān)，可能是小生境脅迫與群落互作共同致其改變。Lactobacillus的產(chǎn)物乳酸的積累，降低了窖泥pH，可能改變?nèi)郝浣Y(jié)構(gòu)，Lactobacillus與Candida呈正相關(guān)可能是因為二者之間存在協(xié)同共生關(guān)系[27]。為了維持群落的動態(tài)平衡，種間氫轉(zhuǎn)移，與甲烷菌互養(yǎng)，提高碳利用率及促進(jìn)碳循環(huán)效率[21-22,28]是濃香型白酒窖池發(fā)酵重要調(diào)控機制。

圖3 窖泥微生物群落關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析Fig.3 Network analysis of microbial communities in pit mud

2.5 核心微生物與窖泥風(fēng)味之間的RDA

基于高通量測序所得窖泥核心菌群與主要風(fēng)味組分間的RDA結(jié)果見圖4。Lactobacillus與乙酸和丁酸呈正相關(guān)，但與乳酸和己酸呈負(fù)相關(guān)。發(fā)酵過程中乳酸隨黃水傳遞至窖底，窖底泥乳酸的含量高于窖壁，而乳酸菌豐度隨窖池的深度增加而降低[7]。Lactobacillus與己酸乙酯、己酸己酯和辛酸乙酯呈負(fù)相關(guān)。乳酸是Caproiciproducens和Clostridiumsensustricto12的底物[19]，與之正相關(guān)，乙酸、丁酸作為合成己酸的電子受體被轉(zhuǎn)化，所以呈負(fù)相關(guān)。己酸與醇縮合為己酸酯，雖然Caproiciproducens和Clostridiumsensustricto12與己酸僅是弱相關(guān)性，但與己酸酯正相關(guān)。Petrimonas等與乳酸、己酸和己酸乙酯呈正相關(guān)。Methanobacterium與己酸呈強烈的正相關(guān)，unclassified_Nitrosopumilaceae與己酸呈負(fù)相關(guān)，Methanoculleus與己酸酯呈正相關(guān)。Methanobacterium和Methanoculleus是氫營養(yǎng)型古菌[29]，能夠降低生物合成己酸過程中的生物氫氣[18]，促進(jìn)己酸和己酸酯的合成。自養(yǎng)型古菌Nitrosopumilaceae[23]和Clostridium[30]都以CO2作為底物，二者底物的競爭降低了己酸的合成速率。Dipodascus和Candida僅與丁酸和己酸己酯等相關(guān)。

a-細(xì)菌;b-古菌;c-真菌圖4 核心微生物與風(fēng)味之間的冗余分析Fig.4 Redundancy analysis between core microorganisms and flavor

3 結(jié)論

應(yīng)用高通量測序及FISH研究窖齡及位置對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，百年老窖泥的細(xì)菌群落中Caproiciproducens和Clostridiumsensustricto12的豐度高，窖壁和窖底的古菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著，前者Nitrosopumilaceae顯著高于后者的，產(chǎn)甲烷古菌的豐度則在后者中更高。除了窖齡和位置以外，封窖材料可能也對微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，不銹鋼蓋窖池中Lactobacillus和Nitrosopumilaceae的豐度顯著低于泥窖，其具體的影響機制還需要進(jìn)一步研究。群落結(jié)構(gòu)的差異導(dǎo)致理化性質(zhì)及酯代謝組分組成及含量差異顯著。RDA的結(jié)果表明Caproiciproducens和Clostridiumsensustricto12與乳酸和己酸酯呈正相關(guān)，產(chǎn)甲烷古菌與己酸和己酸酯呈正相關(guān)。FISH檢出的菌群輪廓差異與高通量測序檢測的結(jié)果是相似的。