趙慧男，鄭文靜，孫珊珊，王明棟，薛霞，王駿，祝建華，劉艷明*，張艷俠*

1(山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南，250101)2(山東省食品藥品安全檢測工程技術(shù)研究中心，山東 濟南，250101)

大黃魚中含有豐富的微量元素、蛋白質(zhì)和維生素[1-2]，備受消費者的喜愛和關(guān)注。因其保鮮期短、產(chǎn)量低、價格高，有不法商販向“偽黃魚”或品質(zhì)差的黃魚中添加硫代黃素等黃色化工染料冒充新鮮黃魚，“染色黃魚”問題經(jīng)常曝出。硫代黃素，又名堿性黃1和硫磺素T，為芳香胺類堿性工業(yè)染料，常用于生物組織學(xué)染色等工業(yè)領(lǐng)域?！妒称分锌赡苓`法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單(第五批)》[3]規(guī)定硫代黃素不能作為食品添加劑使用，指出其可能存在的食品種類為大黃魚，長期過量食用將對人體腎臟、肝臟造成損害甚至致癌。目前，大黃魚中硫代黃素的檢測無相關(guān)國家或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，硫代黃素的相關(guān)檢測方法鮮有報道，亦沒有大黃魚中硫代黃素LC-MS/MS的檢測方法，為了有效的監(jiān)控大黃魚中硫代黃素的非法添加，建立快速準(zhǔn)確的相關(guān)檢測方法尤為必要。

文獻(xiàn)報道中關(guān)于工業(yè)染料的檢測方法主要有分光光度法[4-5]、酶聯(lián)免疫吸附法[6-7]、液相色譜法[8-10]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11-13]等。其中分光光度法操作簡單，但在面對復(fù)雜基質(zhì)時需要繁瑣的前處理過程，且特異性低。酶聯(lián)免疫吸附法無需貴重儀器，檢測成本低，但目前制備高質(zhì)量特異性抗體比較困難，限制了其使用。液相色譜法能夠準(zhǔn)確定量，獲得廣泛應(yīng)用，但靈敏度低，且分析時間長，其僅采用保留時間進(jìn)行定性易產(chǎn)生假陽性結(jié)果；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法能夠在一定程度上排除基質(zhì)干擾，靈敏度高、選擇性好，很適合復(fù)雜基質(zhì)中目標(biāo)物的痕量檢測。大黃魚肉中含有大量的脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物等物質(zhì)，成分復(fù)雜，提取和凈化困難，常見前處理技術(shù)有液液萃取法[14]、固相萃取法[15-16]、QuEChERS方法[17-20]等，前2種方法存在前處理過程復(fù)雜、耗時長、效率低等問題。QuEChERS方法作為農(nóng)藥殘留檢測較為成熟的前處理方法，具有快速、簡單、高效、可靠和安全等優(yōu)點，已被廣泛用于獸藥殘留、非法添加等成分的檢測。

本研究采用改良的QuEChERS方法結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatography-MS/MS，UPLC-MS/MS)檢測大黃魚中硫代黃素含量。本方法凈化步驟簡單、快速高效、靈敏度高，填補了國內(nèi)UPLC-MS/MS法測定大黃魚中硫代黃素含量的技術(shù)空白，為水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)控提供了新的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent1290 InfinityⅡ液相色譜系統(tǒng)和Agilent 6470三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，美國Agilent公司；AB204-S型電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；SB-800DTD 型超聲波清洗器，中國寧波新芝生物科技股份有限公司；3-18K型冷凍離心機，德國Sigma公司；Milli-Q純水系統(tǒng)，美國Millipore公司；渦旋混合器，德國IKA公司。

硫代黃素標(biāo)準(zhǔn)品(純度95.9%)，天津阿爾塔科技有限公司；甲醇、乙腈(HPLC級，純度>99.9%)，德國Merck公司；DisQuE凈化包[900 mg無水硫酸鎂(MgSO4)、150 mgN-丙基乙二胺吸附劑(primary secondary amine，PSA)、150 mg十八烷基鍵合硅膠吸附劑(C18)]，美國Waters公司；實驗所用大黃魚樣品，市售。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取硫代黃素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10.00 mg(精確至0.01 mg)，用乙腈溶解并定容至10 mL，配制成標(biāo)準(zhǔn)儲備液(1 mg/mL)，置于棕色玻璃瓶中，于冰箱-18 ℃冷凍保存。移取標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用乙腈稀釋至適當(dāng)濃度，得到標(biāo)準(zhǔn)工作液，于-18 ℃冷凍保存。

1.2.2 樣品前處理

提?。悍Q取2.000 g均勻樣品(準(zhǔn)確至0.001 g)，置于50 mL離心管中，加入10 mL 80%(體積分?jǐn)?shù))乙腈水溶液，渦旋2 min，超聲提取10 min，加入2 g NaCl渦旋，以8 000 r/min離心5 min,取上清液備用；用10 mL 80%乙腈水溶液(8∶2，體積比)重復(fù)提取1次，合并上清液，待凈化。

凈化：移取上清液4 mL，加入裝有200 mg無水硫酸鎂、50 mg PSA吸附劑、50 mg C18吸附劑的15 mL的離心管中，渦旋混合1 min，8 000 r/min離心5 min，上清液經(jīng)微孔濾膜過濾，待測。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Waters BEHC18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動相：0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液(A)和乙腈(B)；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：1 μL；流速：0.30 mL/min；梯度洗脫程序：0～0.5 min，5% B;0.5～3.5 min，5% B～90% B;3.5～5.0 min，保持90%B;5.0～5.1 min，90% B～5% B;5.1～6.0 min，保持5% B。

1.2.4 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源;離子化模式：正離子模式；監(jiān)測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring，MRM)；干燥氣溫度：250 ℃；干燥氣速度：5 L/min；鞘氣溫度：350 ℃；鞘氣流速：11 L/min；毛細(xì)管電壓：4 000 V；硫代黃素的定性離子對、定量離子對及其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 硫代黃素的質(zhì)譜參考條件Table 1 Optimized parameters of MS/MS for thioflavine T

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

分別采用Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)、Waters BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)、Waters HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)3種不同保留性能的色譜柱進(jìn)行測定。發(fā)現(xiàn)硫代黃素在3種色譜柱上均能有效分配和分離，HSS T3保留性能過強，硫代黃素峰型拖尾。色譜柱越長溶劑損耗越多，分析時間延長，綜合考慮分離效果和效率，2種50 mm C18色譜柱均能夠滿足分析，本研究采用Waters BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)完成實驗。

2.1.2 流動相的選擇

在優(yōu)化的質(zhì)譜條件下，考察不同流動相對目標(biāo)物質(zhì)譜信號的影響。分別考察甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.1%甲酸/乙酸銨等作為流動相對目標(biāo)物的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇、乙腈作為有機相，目標(biāo)物響應(yīng)相當(dāng)，但考慮乙腈為強洗脫溶劑，對消除非法染料在色譜體系的殘留較好，選擇乙腈作為有機相。純水作為流動相時，硫代黃素拖尾嚴(yán)重，峰型較差。在水相中加入0.1%甲酸后，峰形變好，且響應(yīng)增高，能夠滿足定量需求。此外，水相中加入乙酸銨后，目標(biāo)物響應(yīng)明顯降低，因此最終選擇乙腈-0.1%甲酸水作為流動相。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

A-二級質(zhì)譜圖；B-可能裂解途徑圖1 硫黃素T二級質(zhì)譜圖及可能裂解途徑Fig.1 The spectra of daughter ions scanning and fragmentation pathways of thioflavine T

2.3 前處理條件的優(yōu)化

2.3.1 提取條件的優(yōu)化

本實驗分別考察了乙腈、甲醇、純水作為提取溶劑對目標(biāo)物的提取效率，結(jié)果顯示純水作為提取溶劑，目標(biāo)物的回收率約為20%，且提取液渾濁，樣品凈化困難。甲醇與乙腈提取效率均能達(dá)到90%，考慮乙腈具有更好的沉淀蛋白質(zhì)的作用，并且其帶出的弱極性成分少，質(zhì)譜響應(yīng)高、基質(zhì)干擾小，因而選用乙腈作為主要提取溶劑。考慮到純乙腈易使蛋白質(zhì)快速凝結(jié)成團，提取液中加入一定比例水相會提高樣品分散程度，有利于樣品中目標(biāo)物的提取。因此本實驗比較了不同體積分?jǐn)?shù)乙腈水溶液的提取效果，結(jié)果如圖2所示，80%乙腈水溶液作為提取劑時目標(biāo)物的回收率最高，而提取溶劑為50%乙腈水溶液時回收率增幅開始下降。分析原因可能為隨水的比例增加，提取液變渾濁，基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect，ME)變大。經(jīng)80%乙腈水溶液提取后，蛋白沉淀效果好，提取液較澄清，回收率高，因此選擇80%乙腈水溶液作為提取溶劑。

圖2 不同體積分?jǐn)?shù)乙腈水溶液對提取效率的影響Fig.2 Effect of different proportions of acetonitrile aqueous solution on extraction efficiency

實驗進(jìn)一步對提取體積和次數(shù)進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示，提取溶劑體積為10、15、20 mL時三者回收率無顯著性差異。用10 mL乙腈水溶液提取2次時的回收率升高，繼續(xù)增加提取次數(shù)，回收率無明顯差異，因此選擇用10 mL提取溶劑對目標(biāo)物提取2次。

2.3.2 凈化方式的選擇

大黃魚作為優(yōu)質(zhì)水產(chǎn)品，基質(zhì)化學(xué)成分復(fù)雜，含有大量的脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物等，本實驗采用新型通過式固相萃取柱PRiME HLB和QuEChERs方法對目標(biāo)物進(jìn)行凈化，結(jié)果顯示，PRiME HLB對目標(biāo)物有一定的吸附作用，需要進(jìn)行進(jìn)一步的洗脫，而采取乙腈進(jìn)行洗脫會將色譜柱中保留的磷脂等干擾物重新洗脫下來，影響凈化效果，因此該方法不適用于目標(biāo)物的凈化。QuEChERs方法常用的吸附劑有PSA、C18、石墨化碳黑(graphitized carbon black，GCB)等，其中GCB易對色素成分有吸附，而PSA對大黃魚基質(zhì)中脂肪酸、碳水化合物以及甾醇等極性干擾物有凈化效果，C18可以去除脂肪和脂類等非極性干擾物。因此本實驗選擇PSA和C18作為優(yōu)化吸附劑，凈化過程中水分含量會影響PSA的凈化效果，選用無水硫酸鎂來除水。首先采用成品凈化包(PSA 150 mg+C18150 mg+無水MgSO4900 mg)對提取液進(jìn)行預(yù)實驗，結(jié)果回收率能夠滿足要求。為更好地提高凈化效果，進(jìn)一步對QuEChERS方法中吸附劑用量進(jìn)行優(yōu)化，首先對無水硫酸鎂用量進(jìn)行優(yōu)化。如圖3所示，吸附劑中無水硫酸鎂用量為200、500、900 mg時，回收率均在90%以上，200 mg時回收率最高，高于未加入時的數(shù)值。無水硫酸鎂用量超過200 mg后回收率有下降趨勢，當(dāng)無水硫酸鎂用量在1 500 mg時回收率明顯降低,原因可能為無水硫酸鎂過多吸附少量目標(biāo)物質(zhì)，且無水硫酸鎂用量越多所需待凈化溶劑越多。因此選擇在吸附劑中加入200 mg無水硫酸鎂。

圖3 無水硫酸鎂用量對回收率的影響Fig.3 Effect of anhydrous magnesium sulfate content on recovery rate

對PSA和C18用量進(jìn)行優(yōu)化，兩者用量設(shè)置相同，用量為50、100、150 mg時回收率均高于90%，用量為300 mg時回收率降低，如圖4所示。綜合考慮回收率和實驗成本，本方法選擇PSA和C18用量均為50 mg。

圖4 PSA和C18用量對回收率的影響Fig.4 Effect of PSA and C18 content on recovery rate

2.3.3 濃縮過程的考察

對痕量物質(zhì)的檢測，氮吹濃縮是常見提高目標(biāo)物分析靈敏度或置換溶劑的常見手段。以空白樣品加標(biāo)為例，考察了氮吹濃縮對方法回收率的影響。結(jié)果顯示，氮吹濃縮之前，硫代黃素回收率為95.2%，氮吹濃縮后硫代黃素回收率為80.1%，明顯低于氮吹濃縮之前，原因可能為氮吹過程中目標(biāo)物發(fā)生了損失。兼顧方法的靈敏度與準(zhǔn)確性，本方法不進(jìn)行氮吹富集。

2.4 線性范圍、相關(guān)系數(shù)及定量限(limit of quantitation，LOQ)

2.4.1 方法的線性范圍

用純乙腈配制硫代黃素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量濃度分別為0.5、2.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL。將標(biāo)準(zhǔn)溶液按濃度從低到高依次經(jīng)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件進(jìn)行測定，根據(jù)質(zhì)量濃度與色譜峰面積響應(yīng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和計算回歸方程及其相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明,硫代黃素質(zhì)量濃度為0.5～50.0 ng/mL時，濃度與其峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性方程為Y=3 660.332X+837.035，其相關(guān)系數(shù)(r)大于0.998。采用空白基質(zhì)加標(biāo)的方法，以信噪比S/N=10得到目標(biāo)物的LOQ為5.0 μg/kg，以信噪比S/N=3得到目標(biāo)物的檢出限為2.0 μg/kg。硫代黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品加標(biāo)溶液總離子流和特征離子質(zhì)量色譜圖如圖5所示。

A-標(biāo)準(zhǔn)溶液(2 ng/mL)；B-樣品加標(biāo)溶液(20.0 μg/kg)圖5 硫代黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品加標(biāo)溶液的總離子流和提取離子流色譜圖Fig.5 Extracted ion current chromatograms of thioflavine T in the standard solution

2.4.2 方法回收率和精密度

稱取大黃魚陰性樣品加入硫代黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到低、中、高3水平濃度為5.0、20.0和100.0 μg/kg的加標(biāo)樣品，按照本方法對大黃魚樣品中的硫代黃素進(jìn)行6次測定，回收率在94.1%～99.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.53%～1.60%時，符合重復(fù)性試驗對相對標(biāo)準(zhǔn)偏差的要求，結(jié)果如表2所示。

表2 大黃魚中硫代黃素回收率及精密度(RSD)(n=6)Table 2 Recoveries and RSDs of thioflavine T in Larimichthys crocea (n=6)

2.4.3 ME的考察

本方法分別測定了空白樣品處理液與純?nèi)軇┲刑砑油侥繕?biāo)成分的響應(yīng)值，計算二者的相對比值來評價ME。ME計算如公式(1)所示：

(1)

式中：ME為負(fù)值表示存在基質(zhì)抑制效應(yīng)，為正值表示存在基質(zhì)增強效應(yīng)，0為無ME，絕對值越大表示ME越強。結(jié)果顯示，本方法中硫代黃素的ME為2.1%～10.2%時，ME影響不明顯，因此采用純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量。

2.5 實際樣品測定

應(yīng)用所建立的方法對市售20批次大黃魚樣品進(jìn)行測定，結(jié)果均未檢出硫代黃素。

3 結(jié)論

本文通過優(yōu)化儀器條件及前處理條件，建立了改進(jìn)QuEChERS方法結(jié)合UPLC-MS/MS測定大黃魚中硫代黃素殘留的分析方法。該方法簡單、快速、靈敏度高，定性定量準(zhǔn)確，適用于大黃魚中硫代黃素的檢測,填補了國內(nèi)UPLC-MS/MS法測定大黃魚中硫代黃素含量的技術(shù)空白，為檢驗標(biāo)準(zhǔn)的建立提供技術(shù)參考，有助力于市場監(jiān)管部門對硫代黃素非法添加的有效監(jiān)管。