葛 創(chuàng)，錢(qián) 益，朱冬梅，朱 斌

（南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院南通市第一人民醫(yī)院肝膽外科，江蘇 南通 226001）

肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC），簡(jiǎn)稱肝癌，是一種常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腫瘤，死亡率位居全球腫瘤第三［1］。中國(guó)HCC 患者數(shù)量占全球一半以上［2］，發(fā)病率逐年增長(zhǎng)，已成為我國(guó)60 歲以下男性中死亡率最高的癌癥［3］。國(guó)內(nèi)外諸多學(xué)者指出，慢性炎癥在HCC 的形成和演進(jìn)過(guò)程中扮演了重要角色，很大一部分肝癌由慢性肝臟炎癥發(fā)展而來(lái)［4］。肝癌微環(huán)境中存在大量的基質(zhì)細(xì)胞，如活化的肝星狀細(xì)胞、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞和免疫細(xì)胞等，產(chǎn)生許多炎癥因子，如白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1、IL-6 和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等，這些炎癥因子通過(guò)自分泌或旁分泌作用于腫瘤細(xì)胞，與胞膜受體特異性結(jié)合，將信號(hào)傳遞至胞內(nèi)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞持續(xù)增殖、逃避生長(zhǎng)抑制、抵抗凋亡、誘導(dǎo)血管生成、活化侵襲轉(zhuǎn)移、逃避免疫破壞等。因此，從腫瘤炎性反應(yīng)環(huán)節(jié)著手研究肝癌，對(duì)揭示其發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制、提高診斷精確度、指導(dǎo)設(shè)計(jì)精準(zhǔn)臨床藥物及判斷預(yù)后，進(jìn)一步提高肝癌的治療水平具有重要意義。

腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6）是TNFα、IL-1β 等炎癥刺激信號(hào)下游的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白之一，參與調(diào)節(jié)腫瘤炎性反應(yīng)和腫瘤的進(jìn)程。作為腫瘤壞 死 因 子（tumor necrosis factor，TNF）超 家 族 和Toll 樣/白細(xì)胞介素受體（Toll/IL-1 receptor，TIR）超家族的重要胞內(nèi)接頭蛋白，TRAF6 能直接或間接同多種TNF 和TIR 受體家族成員結(jié)合，介導(dǎo)下游信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，如PI3K/AKT、NF-κB 信號(hào)通路等，從而影響細(xì)胞的生存、增殖、分化和凋亡，并參與多個(gè)生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控。例如，TRAF6 可以通過(guò)上調(diào)AKT 信號(hào)通路從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展［5］；TRAF6 還 可 以 促 進(jìn)K-RAS 介 導(dǎo) 的 胰 腺 癌 增 殖［6］。這些研究均提示，TRAF6 在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程中扮演重要角色。目前，盡管已有針對(duì)TRAF6 的相對(duì)深入的研究，但肝癌細(xì)胞內(nèi)TRAF6 對(duì)下游信號(hào)通路調(diào)節(jié)及其機(jī)制尚未完全明確。因此，研究肝癌細(xì)胞內(nèi)TRAF6 促進(jìn)HCC 發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制對(duì)于探索慢性炎癥在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和siRNA 轉(zhuǎn)染

肝癌細(xì)胞系SMCC7721 和人普通肝細(xì)胞系L02 購(gòu)自美國(guó)型培養(yǎng)標(biāo)本，QGY7701、Hep3B 細(xì)胞購(gòu)自上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所（中國(guó)科學(xué)院，上海）。細(xì)胞系常規(guī)培養(yǎng)于杜爾貝科改良的培養(yǎng)基（Invitrogen，Grand Island，NY，USA），10%熱 滅 活 胎 牛 血 清（FBS）（gibco，carlsbad，CA，USA），2 mmol/L L-谷氨酰胺，100 U/mL 青霉素和100 mg/mL 鏈 霉 素，5% CO2，37 ℃。3 個(gè) 靶 向TRAF6 的 小 干 擾RNA（siRNA）（siRNA1，siRNA2，siRNA3）由廣州RiboBio 有限公司（Guangzhou，China）設(shè)計(jì)。siRNA 轉(zhuǎn)染使用Lipofectamine 2000 試劑（invitrogen，carlsbad，CA，USA），按照制造商的規(guī)程進(jìn)行。轉(zhuǎn)染72 h 后檢測(cè)敲除效率。將合成純化的TRAF6 基因片段插入慢病毒載體pll3.7，命名為L(zhǎng)v-Rescue。

1.2 定量實(shí)時(shí)PCR

使 用SYBR Green Mastermix kit（TaKaRa，Tokyo，Japan）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)TRAF6 的表達(dá)水平，并根據(jù)試劑方向在ABI Prism 7900HT（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA）上進(jìn)行3 次分析。用TRIzol 試劑（Invitrogen）提取細(xì)胞總RNA 并進(jìn)行定量。mRNA 檢測(cè)采用逆轉(zhuǎn)錄酶（TaKaRa）逆轉(zhuǎn)錄總RNA（500 ng）。β-actin作為內(nèi)部控制。所有實(shí)驗(yàn)都重復(fù)3 次。引物序列使用Primer 3.0 軟件（http：//www.simgene.com/Primer3）設(shè)計(jì)，具體如下。

β-actin：Forward 5'-ACCGAGCGCGGCTACAG-3'， Reverse 5'-CTTAATGTCACGCACGATTTCC-3'；TRAF6： Forward 5'-TGGATGCCAAACCAGAGC-3'，Reverse 5'-TCAAAGCGGGTGGAGACC-3'。

1.3 Western blotting

使用放射免疫沉淀分析緩沖液和新鮮蛋白酶和磷酸酶抑制劑（Beyotime，中國(guó)南通）提取培養(yǎng)細(xì)胞的總蛋白，并使用Bradford 測(cè)定法（Bio-Rad 實(shí)驗(yàn)室，Hercules，CA，美國(guó)）進(jìn)行定量。取等量的蛋白樣品（30 μg）裝入各通道。用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，然后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上。免疫印跡采用抗c-myc、cyclin D1 抗體（abcam technology）、YB-1 抗 體（zen bioscience）、TRAF6 抗 體（cell signaling technology）、Wnt1、βcatenin、CYLD 和 內(nèi) 參β-actin 抗 體（cell signaling technology）。ImageJ 軟件（NIH，Bethesda，MD，USA）用于量化波段的集成密度。

1.4 細(xì)胞增殖及侵襲實(shí)驗(yàn)

為了研究TRAF6 與肝癌的關(guān)系，本研究檢測(cè)了TRAF6 在SMCC7721、QGY7701、Hep3B 肝 癌細(xì)胞系和正常肝細(xì)胞系L02 中以及siRNA 處理和SMCC7721 中的表達(dá)。使用CCK8 試劑盒（Vazyme Biotech）評(píng)估細(xì)胞增殖。檢測(cè)CCK8 時(shí)，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞（5×103）接種于96 孔板中，分別培養(yǎng)12、24、48、72 h，每孔加入CCK8 試劑，37 ℃孵育2 h。用酶標(biāo)儀在450 nm 處測(cè)定吸收（ELX-800；Bio-Tek，Winooski，VT，USA）。

入侵檢測(cè)使用Transwell 單位（corning costar，tewksbury，MA，USA）與Matrigel（BD Biosciences）滲透進(jìn)行評(píng)估。在不含F(xiàn)BS 的DMEM 中，將細(xì)胞（3×104個(gè)/孔）接種于上室，下室填滿含10%FBS 的DMEM 作為化血紅素。培養(yǎng)36 h 后收集濾片，4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色。濾嘴頂部的非侵襲性腫瘤細(xì)胞用棉簽去除。在光鏡下對(duì)通過(guò)濾鏡的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

5ethynyl-2'-deoxyuridine（EdU）檢測(cè)將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞（2×105）接種于玻璃底細(xì)胞培養(yǎng)皿（nest biotechnology，NJ，USA），然后按照制作說(shuō)明處理細(xì)胞，最后用激光共聚焦掃描顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞樣品。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用STATA version 9.2（STATA Corp.，College Station，TX，USA）和 SPSS version 18.0（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，GraphPad prism 軟件（GraphPad software，San Diego，CA，USA）進(jìn)行圖片分析。計(jì)量資料以表示，使用單因素方差及post hoc分析。P＜0.05 則差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TRAF6 表達(dá)情況

與正常細(xì)胞（0.002 3±0.000 3）相比，TRAF6在HCC 中 異 常 上 調(diào)（SMCC7721：0.066 6±0.001 7，QGY7701：0.030 0±0.002 6，Hep3B：0.002 3±0.000 3）（圖1a），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝603.18，P＝0.001）。3 種干擾RNA 轉(zhuǎn)染肝癌SMMC7721 后，與其它兩組相比（siRNA1：0.034 3±0.000 9，siRNA2：0.021 8±0.001 4）siRNA3 敲 低 組 效 果 明 顯（0.0069±0.0001），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝538.67，P＝0.001），由此選作靶向干擾組（圖1b）。

圖1 TRAF6 在細(xì)胞系中（a）及經(jīng)3 種siRNA 干擾后的SMCC7721 中（b）表達(dá)情況Fig 1 Expression of TRAF6 in different cell strains（a）and SMSS7721 cell interfered by 3 siRNAs（b）

2.2 干預(yù)TRAF6 對(duì)SMCC7721 細(xì)胞惡性表型的影響

為研究TRAF6 對(duì)HCC 細(xì)胞的作用，選取SMCC7721 作 為T(mén)RAF6 高 表 達(dá) 細(xì) 胞。siRNA3 敲除SMCC7721 TRAF6 的表達(dá)。CCK8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖2a），TRAF6 表達(dá)降低顯著抑制了SMCC7721細(xì)胞的增殖。在TRAF6基因敲除細(xì)胞中過(guò)表達(dá)TRAF6 可使細(xì)胞增殖能力恢復(fù)并增強(qiáng)。通過(guò)Transwell 實(shí)驗(yàn)（圖2b）檢測(cè)TRAF6 對(duì)細(xì)胞遷移的影響。與對(duì)照細(xì)胞相比（397.67±16.26），TRAF6處理的SMCC7721 細(xì)胞侵襲性顯著降低（78.00±9.54）；經(jīng)Lv-Rescue 質(zhì)粒處理后，細(xì)胞侵襲能力恢復(fù)（458.33±23.54）（圖2c），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝521.39，P＝0.007）。

圖2 TRAF6 促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲Fig 2 TRAF6 promotes cell proliferation and invasion

EdU 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖3）表明，TRAF6 表達(dá)降低顯著抑制了SMCC7721 細(xì)胞的增殖（68.76±5.64v.s.100.00±1.83）；在TRAF6 基因敲除細(xì)胞中過(guò)表達(dá)該基因恢復(fù)并增強(qiáng)SMCC7721 細(xì)胞的增殖能力（148.32±15.29），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝142.63，P＝0.001）。

圖3 EdU 實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig 3 Result of Edu assay

2.3 TRAF6 對(duì)相關(guān)蛋白水平的影響

Western blotting 檢測(cè)結(jié)果表明TRAF6敲除可明顯下調(diào)YB-1 水平（299 403.3±24 951.8v.s.62 692.3±25 795.1）；而其下游促癌因子c-myc 和Cyclin D1 亦下調(diào)明顯，與此相反，去泛素化酶CYLD 表達(dá)水平卻明顯提高，Wnt/β-catenin 通路蛋白水平同步下調(diào)（圖4）。這些結(jié)果表明TRAF6 敲除很可能通過(guò)影響YB-1 對(duì)HCC 起到抑制作用，此過(guò)程中c-myc、cyclin D1 水平下降，且與Wnt/β-catenin 通路密切正相關(guān)。經(jīng)Lv-Rescue 質(zhì)粒處理后，各指標(biāo)恢復(fù)，YB-1上調(diào)（474 718.8±43 160.5），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝162.84，P＝0.007）。

圖4 YB-1、c-myc、cyclin D1、Wnt/β、catenin、CYLD 表達(dá)水平Fig 4 Expression of YB-1，c-myc，cyclin D1，Wnt/β，catenin，and CYLD

3 討論

TRAF6 具有C端的TRAF 結(jié)構(gòu)域和N端的激活結(jié)構(gòu)域，可以作為泛素連接酶（ubiquitin-ligase enzyme，E3），與泛素結(jié)合酶（ubiquitin-conjugating enzyme，E2）結(jié)合，促進(jìn)下游蛋白K63 多聚泛素化［7-10］。據(jù)報(bào)道，TRAF6 作為E3 連接酶致使蛋白激酶發(fā)生K63 多聚泛素化，對(duì)蛋白激酶的膜定位非常重要，可以促進(jìn)腫瘤的進(jìn)程［5］。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)YB-1 也可以被E3 連接酶HACE1 催化形成K27 多聚泛素化鏈，K27 多聚泛素化的YB-1 可被分泌至細(xì)胞外［11］，從而發(fā)揮其生物學(xué)功能。由此，YB-1 的多聚泛素化修飾被認(rèn)為對(duì)其自身的活化以及下游信號(hào)通路的活化十分關(guān)鍵。

YB-1 也被稱為DNA 結(jié)合蛋白B，最初發(fā)現(xiàn)是一個(gè)可特異性識(shí)別多種不同基因Y 盒子啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子。YB-1 亦是冷休克蛋白超家族成員之一。研究發(fā)現(xiàn)，在多種惡性腫瘤，如乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌和卵巢癌中，YB-1 蛋白水平與腫瘤級(jí)別和預(yù)后有關(guān)［12］。眾多研究表明，YB-1 主要通過(guò)調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯發(fā)揮作用，并且這一調(diào)節(jié)作用是由其在細(xì)胞內(nèi)的定位決定的。在胞漿內(nèi)，YB-1調(diào)節(jié)mRNA 穩(wěn)定性及翻譯水平［13］；在核內(nèi)，YB-1 通過(guò)識(shí)別特定啟動(dòng)子序列促進(jìn)原癌基因的轉(zhuǎn)錄，如c—myc、Cyclin D1等［13，14］。在 肝 癌 組 織 中YB-1 蛋白主要在細(xì)胞漿中表達(dá)，部分肝癌組織有明顯核表達(dá)［15］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干擾TRAF6 后，肝癌SMMC7721 細(xì)胞增殖及侵襲能力明顯降低；同時(shí)，YB-1 表達(dá)水平明顯下調(diào)，其下游其促癌因子cmyc、Cyclin D1 也 隨 之 下 調(diào)。由 此 推 測(cè)TRAF6 作為炎癥因子受體胞內(nèi)部分，表達(dá)水平下調(diào)后，其胞內(nèi)泛素化酶活性水平下調(diào)，進(jìn)而影響YB-1 胞漿內(nèi)穩(wěn)定以及胞核內(nèi)定位或表達(dá)，從而抑制原癌基因cmyc、Cyclin D1轉(zhuǎn)錄，最終抑制了肝癌SMMC7721的增殖侵襲。

與TRAF6 相反，去泛素化酶CYLD 可以通過(guò)特異切除多聚泛素鏈抑制YB-1 的泛素化修飾，從而影響其下游信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)［16］。許多研究表明，腫瘤抑制因子CYLD 作為一種去泛素化酶可以通過(guò)去泛素化部分信號(hào)分子從而抑制JNK、NF-κB 等信號(hào)途徑的激活，參與多種實(shí)體瘤（如結(jié)腸癌、宮頸癌等）的發(fā)生、發(fā)展［17，18］。本實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)，肝癌細(xì)胞在TRAF6 被 干 擾 后，YB-1、c-myc、Cyclin D1 表 達(dá)水平明顯下調(diào)，而其去泛素化酶CYLD 表達(dá)水平則明顯提高。結(jié)合既往研究［19］推斷，在SMCC7721 細(xì)胞中TRAF6 可能通過(guò)影響YB-1 表達(dá)或泛素化修飾YB-1 而調(diào)整其下游因子c-myc 和Cyclin 的表達(dá)水平，該過(guò)程與去泛素化酶CYLD 呈負(fù)相關(guān)。為進(jìn)一步證明干擾TRAF6 可抑制腫瘤增殖及進(jìn)展，我們 選 取 了 經(jīng) 典 促 腫 瘤 通 路Wnt/β-catenin［20］進(jìn) 行 驗(yàn)證，結(jié)果表明Wnt、β-catenin 表達(dá)水平亦明顯下調(diào)。

綜上所述，推斷干擾TRAF6 可以通過(guò)下調(diào)YB-1 的表達(dá)或者增強(qiáng)去泛素化酶CYLD 對(duì)YB-1活性的抑制，從而降低促癌因子c-myc、cyclin D1 表達(dá)水平，抑制肝癌細(xì)胞增殖及侵襲等能力，該過(guò)程與Wnt/β-catenin 通路密切相關(guān)。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

葛創(chuàng)：主要實(shí)驗(yàn)執(zhí)行，數(shù)據(jù)整理，文章撰寫(xiě)；朱冬梅：數(shù)據(jù)整理及分析，文獻(xiàn)檢索；錢(qián)益：實(shí)驗(yàn)設(shè)備維護(hù)、實(shí)驗(yàn)試劑選擇購(gòu)買，文章修改；朱斌：課題思路設(shè)計(jì)，文獻(xiàn)檢索相關(guān)分析。