王慶偉，白丹妮，沈夢婷，王麗紅，蘇 瑾

（佳木斯大學(xué)藥學(xué)院黑龍江省新藥創(chuàng)制與藥效毒理評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 佳木斯 154007）

滿山紅源自杜鵑花科，為杜鵑屬植物的干燥葉，其味辛、苦、性寒，具有止咳祛痰的功效［1，2］?，F(xiàn)代研究表明滿山紅不僅可以治療支氣管炎，還具有鎮(zhèn)痛、抗癌、抗氧化和強(qiáng)心等藥理作用［3］。滿山紅油是滿山紅葉經(jīng)水蒸氣蒸餾法提取得到的揮發(fā)油，其主要成分有吉馬酮、薄荷醇、槲皮素、杜松腦等［4］，有強(qiáng)烈刺激性香氣，味清涼而辛?？诜o藥作為臨床上最常見的給藥方式，具有安全、方便以及患者依從性好等優(yōu)點(diǎn)，但滿山紅油溶解性差導(dǎo)致口服生物利用度大大降低，此外滿山紅油的氣味刺鼻也不利于口服，因此大多數(shù)研究將滿山紅油以制劑的形式應(yīng)用于臨床研究。滿山紅油的現(xiàn)代制劑有片劑（如消咳喘片）、膠囊劑（復(fù)方滿山紅膠囊），亦有滴丸劑，這些常規(guī)的制劑方法對(duì)于胃腸道副作用明顯，并且容易造成揮發(fā)油部分成分的揮發(fā)。

脂質(zhì)體（liposome）是由脂質(zhì)雙分子層（由磷脂和膽固醇組成）構(gòu)成的封閉囊泡，具有一定的緩釋性和靶向性，此外還具有降低藥物毒性提高藥物穩(wěn)定性等優(yōu)勢［5］，脂質(zhì)體可分為傳統(tǒng)型、柔性、陽離子型、隱形型、免疫型、磁性、溫度敏感型和靶向型等［6］，靶向脂質(zhì)體是利用脂質(zhì)體作為藥物載體，可使藥物直接到達(dá)病變組織或靶細(xì)胞［7］。Box-Behnken響應(yīng)面法是一種適用于多因素考察的設(shè)計(jì)方法，其特點(diǎn)是運(yùn)用非線性擬合模型來提高準(zhǔn)確度，試驗(yàn)次數(shù)少，效率高［8-10］。脂質(zhì)體將滿山紅油包載之后可以提高滿山紅油的穩(wěn)定性，也可以提高其利用率，因此本實(shí)驗(yàn)采用乙醇注入法制備滿山紅油脂質(zhì)體，Box-Behnken 響 應(yīng) 面 法［11］優(yōu) 化 滿 山 紅 油 脂 質(zhì) 體 處方，以包封率作為指標(biāo)，考察滿山紅油脂質(zhì)體處方中的卵磷脂與膽固醇的比例、脂藥比、磷脂濃度，篩選出滿山紅油脂質(zhì)體的最優(yōu)處方，為設(shè)計(jì)、制備滿山紅油新制劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

UV-765 紫外-可見分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器廠）；Agilent1100series 高效液相色譜儀（美國安捷倫有限公司）；FA2004N 電子分析天平（上海恒平儀器廠）；Scientz-ⅡD 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝科技股份有限公司）；DF-101S 集熱式恒溫磁力攪拌器（河南省予華儀器廠）；Malvern Zetasizer Nano ZSE 納米粒度電位儀（英國馬爾文公司）

1.2 藥品

吉馬酮（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111665-201605）；滿山紅油（江西恒誠天然香料油有限公司，批號(hào)20180101）；注射用卵磷脂（上海太偉藥業(yè)股份有限公司）；膽固醇（大連美侖生物技術(shù)公司）；無水乙醇（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）

1.3 滿山紅油脂質(zhì)體的制備

取10 mL PBS（pH7.4）置50 mL 小燒杯中，放入磁力攪拌器，加熱保溫至50 ℃，量取5 mL 無水乙醇，將稱取的磷脂和膽固醇溶解于無水乙醇中，用注射器從該溶液中吸取5 mL，將一定量的滿山紅油加入剩余的溶液中，并用另一個(gè)注射器吸取剩余溶液，將兩份脂質(zhì)溶液以600 r/min 的速度同時(shí)緩慢注入到已配置好的PBS 中，滴加完畢后，繼續(xù)攪拌，使乙醇揮發(fā)完全，冰水浴探頭超聲，即得［12］。

1.4 含量測定方法

1.4.1 色 譜 條 件 色 譜 柱：C18柱（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（75∶25，V∶V）；柱溫：35 ℃；檢測波長：215 nm；流速：1 mL/min；進(jìn) 樣 量：10 μ L［13］。

1.4.2 專屬性試驗(yàn) 取不含吉馬酮的脂質(zhì)體、吉馬酮標(biāo)準(zhǔn)品、空白脂質(zhì)體加吉馬酮標(biāo)準(zhǔn)品和滿山紅油放入燒杯中并加入適量甲醇，之后轉(zhuǎn)移到10 mL 容量瓶并定容，根據(jù)上述的色譜條件對(duì)樣品進(jìn)行測定。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取吉馬酮標(biāo)準(zhǔn)品5.05 mg，將吉馬酮標(biāo)準(zhǔn)品放入50 mL 容量瓶，再用甲醇定容，將此濃度的溶液分別稀釋成濃度為1.01、5.05、10.10、15.15、20.20、25.25、30.30 μg/mL 的不同溶液，以215 nm 為吸收波長，對(duì)上述溶液進(jìn)行含量測定得出峰面積，以濃度（C）為橫坐標(biāo)，峰面積（S）為縱坐標(biāo)構(gòu)建線性方程。

1.4.4 精密度試驗(yàn) 將配制的吉馬酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行稀釋，分別稀釋成5.05、15.15、25.25 μg/mL 的低、中、高濃度的吉馬酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照上述的實(shí)驗(yàn)條件分別測定5 次，計(jì)算日內(nèi)精密度。再按同樣的方法，將3 份標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別測定5 d，用于日間精密度計(jì)算。

1.4.5 回收率試驗(yàn) 將配制的吉馬酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋成濃度為101.0 μg/mL 的溶液，從中取0.5、1.5、2.5 mL 各3 份于10 mL 容量瓶中，分別加入不含吉馬酮的脂質(zhì)體溶液2 mL，加入適量甲醇定容，搖晃使其充分溶解，分別得到濃度為5.05、15.15、25.25 μg/mL的吉馬酮溶液，每個(gè)樣品平行測定5 次，通過峰面積計(jì)算回收率。

1.5 包封率測定

采用超濾離心法測定。從已制備好的滿山紅油脂質(zhì)體中吸取0.5 mL 于超濾離心管中，在轉(zhuǎn)速為10 000 r/min 的條件下離心15 min，取出的濾液加入適量甲醇并放入10 mL 容量瓶，定容至刻度線，取10 μL 進(jìn)樣，測得W游離，另取0.5 mL 滿山紅油脂質(zhì)體于10 mL 容量瓶中，甲醇定容至刻度，取10 μL 進(jìn)樣，測得W總，包封率（EE）∶EE%＝（W總-W游離）/W總×100%

1.6 單因素試驗(yàn)

1.6.1 卵磷脂與膽固醇比例的考察 按“1.3”項(xiàng)下制備方法，固定卵磷脂的濃度為10 mg/mL，脂藥比為10∶1，溫度設(shè)置為50 ℃，冰浴探頭超聲10 min，按照磷脂與膽固醇質(zhì)量比為1∶1、3∶1、5∶1、7∶1、9∶1 分別對(duì)滿山紅油脂質(zhì)體包封率大小的影響進(jìn)行考察。

1.6.2 卵磷脂與藥物比例的考察 按“1.3”項(xiàng)下制備方法，固定卵磷脂的濃度為10 mg/mL，卵磷脂與膽固醇的比例為7∶1，溫度設(shè)置為50 ℃，冰浴探頭后超聲10 min，按照卵磷脂與藥物質(zhì)量比為4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1 分別對(duì)滿山紅油脂質(zhì)體包封率大小的影響進(jìn)行考察。

1.6.3 磷脂濃度的考察 按“1.3”項(xiàng)下制備方法，固定卵磷脂與膽固醇的比例為7∶1，脂藥比為10∶1 溫度設(shè)置為50 ℃，冰浴探頭后超聲10 min，改變卵磷脂濃度分別為3、6、9、12、15 mg/mL，分別對(duì)滿山紅油脂質(zhì)體包封率大小的影響進(jìn)行考察。

1.6.4 制備溫度考察 按“1.3”項(xiàng)下制備方法，將卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比固定為7∶1，卵磷脂的濃度為10 mg/mL，脂藥比為10∶1，冰浴探頭后超聲10 min，改變制備溫度分別為30、40、50、60、70 ℃，分別對(duì)滿山紅油脂質(zhì)體包封率大小的影響進(jìn)行考察。

1.6.5 超聲時(shí)間的考察 按“1.3”項(xiàng)下制備方法，將卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比固定為7∶1，卵磷脂的濃度為10 mg/mL，脂藥比為10∶1，溫度設(shè)置為50 ℃，將超聲時(shí)間設(shè)置為5、10、15、20、25 min，分別對(duì)滿山紅油脂質(zhì)體包封率大小的影響進(jìn)行考察。

1.7 Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化處方

在單因素試驗(yàn)并結(jié)合文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上得出3 個(gè)對(duì)滿山紅油脂質(zhì)體包封率影響較顯著的因素：卵磷脂與膽固醇的比例（X1）、脂藥比（X2）、磷脂濃度（X3），以包封率（Y）作為響應(yīng)值，采用Box-Behnken 法優(yōu)化滿山紅油脂質(zhì)體處方。試驗(yàn)中每個(gè)因素的3 個(gè)水平分別記為-1、0、+1。以包封率為考察指標(biāo)，并且考察值越大越好，采用Design Expert 軟件優(yōu)化滿山紅油脂質(zhì)體的處方。見表1。

表1 Box-Behnken 因素水平表Tab 1 Box-Behnken factor level table

2 結(jié)果

2.1 含量測定

2.1.1 專屬性 在上述色譜條件下，測得空白脂質(zhì)體（圖1）、吉馬酮標(biāo)準(zhǔn)品（圖2）、空白脂質(zhì)體加吉馬酮標(biāo)準(zhǔn)品（圖3）、滿山紅油脂質(zhì)體（圖4）的液相色譜圖。結(jié)果顯示，輔料對(duì)樣品的測定無干擾。

圖1 空白脂質(zhì)體液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms of blank liposome

圖2 吉馬酮液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatograms of germacrone

圖3 空白脂質(zhì)體加吉馬酮液相色譜圖Fig 3 HPLC chromatograms of blank Rhododendri Daurici oil liposome

圖4 滿山紅油脂質(zhì)體高效液相色譜圖Fig 4 HPLC chromatograms of Folium Rhododendri Daurici oil liposome iposome and germacrone

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 吉馬酮在1～100 mg/mL線性關(guān)系良好，得到回歸方程為：S＝35.756C-5.9414（r＝0.999 6）。

2.1.3 精密度試驗(yàn) 吉馬酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液的日內(nèi)精密度RSD 分別為2.47%、1.84%、1.44%，日間精密度RSD 分別為2.63%、1.63%、1.25%，得出的RSD值均符合要求，表明該方法精密度良好。

2.1.4 回收率試驗(yàn) 3 種吉馬酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液的平均回收率分別為97.82%、101.19%、98.97%，同時(shí)RSD 值也符合方法學(xué)要求。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 卵磷脂與膽固醇比例的考察 隨著卵磷脂比例的增大，包封率先增大隨后平穩(wěn)，包封率最高為卵磷脂與膽固醇的比例為7∶1，這是因?yàn)楫?dāng)卵磷脂用量過低時(shí)不足以包封滿山紅油，當(dāng)卵磷脂用量過高時(shí)，體系呈乳白色，部分磷脂從脂質(zhì)體表明析出［14］，因此選擇5∶1～9∶1 作為卵磷脂與膽固醇的比例。

2.2.2 卵磷脂與藥物比例的考察 包封率先增大后減小，在比例達(dá)到10∶1 時(shí)包封率最大，之后當(dāng)藥物濃度過低時(shí)包封率又隨之減小［14］，因此選擇脂藥比為8∶1～12∶1 做進(jìn)一步研究。

2.2.3 磷脂濃度的考察 隨著磷脂濃度的增加，包封率先增大，后減小，考慮到載藥量，磷脂濃度選擇9～15 mg/mL 進(jìn)一步考察。

2.2.4 制備溫度考察 隨著溫度的增加，包封率呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢，溫度過低不利于形成脂質(zhì)體，但溫度過高也會(huì)使得卵磷脂發(fā)生氧化，因此溫度選擇在40～60 ℃，并且溫度在該范圍內(nèi)無明顯變化。

2.2.5 超聲時(shí)間的考察 隨著超聲時(shí)間的增加，包封率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，10～20 min 區(qū)間包封率最高，最終選擇15 min 作為實(shí)驗(yàn)的超聲時(shí)間。

2.3 Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化處方

根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件所得出的數(shù)據(jù)研究因素對(duì)包封率的影響。預(yù)測模型的P值小于0.000 1，證明模型極其顯著。失擬項(xiàng)P值為0.326 4，大于0.05，模型信號(hào)噪聲比為26.218，大于4，模型分辨力強(qiáng)。擬合得二次回歸方程：Y1＝80.03+2.49A+2.93B-7.55C+0.070AB+0.67AC+0.27BC-7.07A2-2.01B2-4.09C2。其相關(guān)系數(shù)r2＝0.987 2，失擬項(xiàng)不顯著，證明回歸方程與實(shí)測值擬合較好，該方程可以代替分析。因素A、B、C 的P值均小于0.000 1，說明卵磷脂與膽固醇的比例、脂藥比、磷脂濃度對(duì)包封率的影響都有顯著差異［15］。見表2、3。

表2 BBD 設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab 2 BBD design and results

圖5 中的響應(yīng)面圖顯示不同的獨(dú)立變量對(duì)滿山紅油脂質(zhì)體處方包封率的影響，由圖可知，隨著膽固醇與卵磷脂比例（X1）的增大，包封率先增大后減?。浑S著脂藥比（X2）的增大，包封率逐漸減??；隨著磷脂濃度（X3）增大，包封率先增大后減小。

圖5 包封率響應(yīng)面圖Fig 5 Response surface three-dimensional map of the encapsulation efficiency

2.3.1 Box-Behnken 響應(yīng)面優(yōu)化與分析 根據(jù)方程，繪制出每個(gè)因素對(duì)脂質(zhì)體包封率影響的響應(yīng)面曲面圖，得出各個(gè)因素對(duì)滿山紅油脂質(zhì)體制備的影響。對(duì)使用Design Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行擬合作圖得到的響應(yīng)面圖和等高線圖進(jìn)行對(duì)比，可明顯看出每個(gè)因素和響應(yīng)值及各因素間的交互作用［16］。之后進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果得出各因素的最優(yōu)處方中卵磷脂與膽固醇的比例為7.28∶1、卵磷脂與藥物的比例為11.34∶1、磷脂濃度為9.32 mg/mL。

2.3.2 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)得出的處方，將最佳條件設(shè)置為卵磷脂與膽固醇的比例為7.28∶1、卵磷脂與藥物的比例為11.34∶1、磷脂濃度為9.32 mg/mL。制成3 批滿山紅油脂質(zhì)體樣品，結(jié)果見表4。

表3 包封率回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Regression model coefficient of encapsulation efficiency of Folium Rhododendri Daurici oil liposome

由表4 可知，按照最佳條件進(jìn)行的試驗(yàn)，所得的包封率的偏差絕對(duì)值較小，證實(shí)所建數(shù)學(xué)模型預(yù)測性良好。

表4 Box-Behnken 響應(yīng)面優(yōu)化法的驗(yàn)證（n=3，）Tab 4 Validation of the Box-Behnken response surface optimization method（n=3，）

表4 Box-Behnken 響應(yīng)面優(yōu)化法的驗(yàn)證（n=3，）Tab 4 Validation of the Box-Behnken response surface optimization method（n=3，）

注：偏差%＝（預(yù)測值-實(shí)測值）/預(yù)測值×100%。

載藥量（%）5.84 6.07 5.92 5.94±0.12-批次12 3均值±標(biāo)準(zhǔn)差偏差（%）包封率（%）81.08 84.35 82.21 82.55±1.66+2.4%粒徑（nm）154.6 131.3 105.7 130.53±24.46-PDI 0.203 0.229 0.124 0.185±0.05-Zeta 電位（mV）-23.5-20.9-21.5 21.97±1.36-

3 討論

常規(guī)的脂質(zhì)體制備方法有薄膜分散法、乙醇注入法、逆向蒸發(fā)法等［17-19］，實(shí)驗(yàn)前期對(duì)3 種方法進(jìn)行比較，薄膜分散法制備的脂質(zhì)體粒度分布不均勻且包封率較低，洗膜時(shí)水化不完全且時(shí)間長，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時(shí)抽真空容易造成揮發(fā)油的散失，很難實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)；逆向蒸發(fā)法適合制備水溶性藥物的脂質(zhì)體，滿山紅油脂溶性大且制備的脂質(zhì)體粒徑較大，故不采用此制備方法；乙醇注入法操作簡便，對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器要求不高，制備的脂質(zhì)體粒徑均勻，包封率較高，重現(xiàn)性好，適合大規(guī)模生產(chǎn)［20］。

對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行超聲乳化，可以將大單室脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化為小單室脂質(zhì)體，使得粒徑減小，使得脂質(zhì)體納米粒融合造成的沉淀現(xiàn)象減小［21］。當(dāng)溶液進(jìn)行探頭超聲時(shí)，脂質(zhì)體出現(xiàn)渾濁，超聲后呈乳白色，粒徑減小不明顯，考慮是因探頭溫度過高破壞脂質(zhì)體，因此，在超聲時(shí)對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行冰浴，超聲后脂質(zhì)體透明有乳光，粒徑較小、均一穩(wěn)定。

本實(shí)驗(yàn)采用乙醇注入-探頭超聲法制備滿山紅油脂質(zhì)體，以包封率為指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)得出各因素的最優(yōu)范圍，然后以使用Box-Behnken 響應(yīng)面法對(duì)處方工藝進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳試驗(yàn)條件，結(jié)果表明：當(dāng)卵磷脂與膽固醇的比例為7.28∶1、卵磷脂與藥物的比例為11.34∶1、磷脂濃度為9.32 mg/mL，制備溫度50 ℃，超聲時(shí)間15 min 時(shí)，包封率最高，平均包封率為（82.55±1.66）%，通過驗(yàn)證試驗(yàn)證明3批脂質(zhì)體各項(xiàng)指標(biāo)的偏差較小，證明制備工藝穩(wěn)定可行，通過制備滿山紅油脂質(zhì)體，不僅使?jié)M山紅揮發(fā)油的穩(wěn)定性提高，還為開發(fā)新制劑提供了可能性。

作者貢獻(xiàn)度說明

蘇瑾：選題及實(shí)驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)，論文修改；王麗紅：藥材鑒定及成分測定；王慶偉：具體實(shí)驗(yàn)操作、數(shù)據(jù)處理、撰寫論文；沈夢婷：實(shí)驗(yàn)材料的購買和數(shù)據(jù)分析；白丹妮：實(shí)驗(yàn)操作及數(shù)據(jù)收集與處理。