賈 凡，鄭冬雪，陳如楓，趙紅玉，劉津源，張莉莉，趙林華，劉詠梅，張 云，朱曉云，闞 杰，劉新敏

（中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院，北京 100053）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是育齡期女性常見的的生殖內(nèi)分泌代謝紊亂性疾病，其病因尚未明確、病理機制復雜、臨床表現(xiàn)具有異質(zhì)性、遠期并發(fā)癥繁多，屬婦科臨床的一大難題。PCOS 的典型特征包括性激素水平異常、胰島素抵抗（insulin resistance，IR）、卵巢多囊樣改變、慢性亞臨床炎癥等。

腸道菌群是存在于人體腸道的正常微生物，被認為是一種新的人體器官，可通過神經(jīng)、內(nèi)分泌等多種途徑影響機體的生命活動，對維持人體健康至關重要［1］。腸道菌群紊亂在多種疾病的發(fā)生、發(fā)展中起到了重要的作用［2］。研究發(fā)現(xiàn)，PCOS 患者普遍存在腸道菌群譜的改變，多種腸道細菌與PCOS患者的血清睪酮、體質(zhì)量、血脂等指標存在關聯(lián)，且腸道微生態(tài)失衡程度與PCOS 的發(fā)生及疾病進展有關聯(lián)。腸道菌群紊亂參與了內(nèi)毒素血癥、短鏈脂肪酸（SCFA）生成、膽汁酸代謝、腦腸肽異常分泌等過程，上述生理病理過程與PCOS 的高雄激素血癥（hyperandrogenism，HA）、IR、慢性炎癥反應、腦腸肽水平異常等表現(xiàn)有關［3-11］。因此，腸道菌群可能通過參與HA、IR、慢性炎癥、腦腸介質(zhì)的分泌等途徑，影響卵泡發(fā)育、性激素及代謝水平等，參與PCOS 的病理過程。然而PCOS 的病理表現(xiàn)與菌群失衡的關系至今仍未明確，探究PCOS 與腸道菌群關系及糾正腸道菌群治療PCOS 的研究成為了近年研究的熱點。

理想動物模型的構(gòu)建是進一步探討PCOS 與腸道菌群關系研究的基礎，典型的PCOS 動物模型應具備較高的臨床相似性，以便進行后續(xù)發(fā)病機制及治療等相關研究［12］。PCOS 的造模方法眾多，來曲唑制備大鼠PCOS 的造模方法已相對成熟。來曲唑是一種芳香化酶抑制劑。芳香化酶是雄激素向雌激素轉(zhuǎn)化的最后一步限速酶。卵巢內(nèi)芳香化酶活性下降可阻止局部雄激素向雌激素的轉(zhuǎn)換，使雄激素水平升高；高水平的雄激素可引起卵泡過早閉鎖，卵巢不能形成優(yōu)勢卵泡，出現(xiàn)持續(xù)性無排卵狀態(tài)，引發(fā)卵泡發(fā)育障礙和生殖功能異常［13］。使用來曲唑造模操作具有創(chuàng)傷小、操作便捷等特點［14］。科研工作者常采用此方法造模用于PCOS 的動物實驗研究。造模時長多設置為3 周，給藥時間多設置為2周［15-18］。然而大鼠本身具有較強的自愈性［19］，在后續(xù)2 周的給藥時間內(nèi)若不持續(xù)予致病因素干預的情況下，大鼠的模型特征是否會自行消退尚未可知。為此，本研究將來曲唑造模時長分別設置為3 周和5周，來探究不同造模時長下來曲唑誘導的PCOS 大鼠卵巢形態(tài)、糖脂代謝、性激素水平及腸道菌群的差異，以明確2 周的“自愈時間”里模型大鼠的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取21 日齡SPF 級雌性SD 大鼠18 只，實驗動物許可證號：SCXK（京）2014-0004。飼養(yǎng)條件：室溫20～24 ℃，相對濕度為（50±10）%，12 h 光照/12 h 黑暗，周期交替進行，大鼠攝食、飲水自由。喂養(yǎng)飼料為普通飼料（供能比：蛋白質(zhì)22.47%，脂肪12.11%，碳水化合物65.42%），主要配方成分為酪蛋白、淀粉、麥芽糊精、蔗糖、纖維素、豆油等。大鼠及飼料均由北京華阜康生物技術有限公司提供。動物實驗經(jīng)中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準進行（批號IACUC-GAMH-2017-002）。

1.2 實驗用藥

來曲唑片（弗?。ㄒ?guī)格：2.5 mg/片，諾華制藥有限公司，批號：H20140149）；羧甲基纖維素鈉（Sodium carboxymethylcellulose，CMC-Na，北京索萊寶科技有限公司，批號：1002004956）。

1.3 實驗試劑

卵 泡 刺 激 素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）、雌二醇（estradiol，E2）、黃體生成素（luteinizing hormone，LH）、總 膽 固 醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、脂多糖（LiPo-Polysaccharide，LPS）酶聯(lián)免疫吸附測定（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，Elisa）試劑盒，購買于南京金益柏生物科技有限公司，產(chǎn)品批號分別為JEB-13680、JEB-13691、JEB-13706、JEB-13917、JEB-13131、JEB-13984；血清睪酮（testosterone，T）、胰 島 素（fasting insulin，F(xiàn)INS）酶 聯(lián) 免 疫 吸 附 法（ELISA）試劑盒，購買于abcam 公司，產(chǎn)品批號分別為ab108666、ab100578。

1.4 實驗儀器

ACCU-CHEK 血糖儀，羅氏（卓越金采）；ACCU-CHEK 血糖試紙，羅氏（卓越型）；低溫離心機，HITACHI（CT15RE）；37 ℃恒溫箱，上海一恒科技有 限 公 司（DHP-9082 型）；酶 標 儀 機，BioTek（2100）；包埋機，德國Leica（EG140H）；病理切片機，德國Leica（RM2135）；全自動化封片機；德國Leica（CN5030）；顯微鏡，日本OLYMPUS（BH-2）。

1.5 藥物制備

1.5.1 1% 羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液的配置 使用電子天平稱取5 g CMC-Na，然后緩慢加入到100 mL 熱水中，用玻璃棒攪拌至將近溶解，添加餾水至500 mL。封瓶保存，CMC-Na 第二日完全溶解。

1.5.2 來曲唑+CMC-Na 混合液的配置 取2.5 mg來曲唑（1 片），溶于20 mL 的1% CMC-Na，再加30 mL 蒸餾水，充分溶解混勻，配置成來曲唑（0.1 mg/kg/d）+1%的羧甲基纖維素（CMC-Na 2 mL/kg）溶液，將配置完成的混合液封裝于EP 管中，存放于干燥陰涼處。

1.6 造模方法

參照文獻［20-22］使用的造模方法制備PCOS大鼠模型，采用隨機數(shù)字表法，將18 只SD 大鼠隨機分為A 組（造模3 周組）、B 組（造模5 周組）、D 組（對照組），每組6 只。A、B 組大鼠每日灌胃2 mL 來曲唑+CMC-Na 混合液（來曲唑片1 mg·kg-1·d-1+1%CMC-Na 溶液）溶液，B 組連續(xù)灌胃5 周，A 組連續(xù)灌胃3 周后再連續(xù)灌胃2 mL CMC-Na 溶液2 周；D 組每日灌胃2 mL CMC-Na 溶液；3 組大鼠均予普通飼料飼養(yǎng)5 周。

1.7 取材方法

造模給藥結(jié)束后，禁食8 h 后進行取材。各組大鼠稱重，尾尖取血，使用血糖儀測血糖。將大鼠倒置于掌心，輕壓大鼠直腸部位，在無菌環(huán)境下收集新鮮糞便，每只大鼠收集5 個糞便標本，糞便置于無菌EP 管內(nèi)，-80 ℃冰箱內(nèi)保存。腹腔注射10%水合氯醛（按0.6 mL/100 g 大鼠體重，并根據(jù)情況補注）麻醉。麻醉成功后，將大鼠仰臥位固定，酒精消毒皮膚，剪開腹腔，腹主動脈采血，采血管存放，冰上靜置，離心，分離血清，保存于-80 ℃冰箱。斷頭法處死大鼠，取出卵巢組織，冰上玻片放置，去除卵巢周圍組織脂層，4%多聚甲醛溶液固定。

1.8 觀察指標及方法

1.8.1 卵巢組織形態(tài)學觀察 以4 %多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋；以4 μm 厚度切片，常規(guī)脫蠟、水化后蘇木素染色5～10 min；1%鹽酸乙醇分化，1%伊紅溶液染色，脫水，透明中性樹膠封片，顯微鏡下觀察各組大鼠卵巢組織形態(tài)學變化。

1.8.2 性激素相關指標檢測 取-80 ℃冰箱保存的血清，采用ELISA 檢測血清中T、FSH、LH、E2的含量，具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行。使用酶標儀進行吸光度的檢測，根據(jù)酶聯(lián)免疫反應后吸光度值的大小判斷標本中待測樣品的濃度。

1.8.3 糖脂代謝指標檢測 血糖（glucose，Glu）：使用血糖儀測定大鼠尾間血血糖；FINS、TG、TC、LPS：?。?0 ℃冰箱保存的血清，采用ELISA 法檢測，根據(jù)公式【HOMA-IR＝Glu（mmol/L）×FINS（mIU/L）/22.5】計算HOMA-IR。

1.8.4 LPS 水平的檢測 取-80 ℃冰箱保存的血清，采用ELISA 法檢測血清中LPS 的含量，具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行。使用酶標儀進行吸光度的檢測，根據(jù)酶聯(lián)免疫反應后吸光度值的大小判斷標本中待測樣品的濃度。

1.8.5 糞便腸道菌群檢測 大鼠糞便樣品提檢及測序委托深圳微生太科技有限公司進行。每只大鼠 取 2～3 粒 糞 便。 使 用 Illumina 公 司 的MiseqPE300 平臺對細菌16S rDNA V3-V4 區(qū)進行測序及生物信息分析。主要流程如下：（1）細菌基因組總DNA 抽提；（2）對V3-V4 可變區(qū)進行PCR 擴增，其中引物序列為338F：5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3'， 806R： 5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'；擴增程序為：95 ℃預變性3 min，27個循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s），72 ℃延 伸10 min（PCR 儀 使 用ABIGeneAmP-9700 型）；（3）純化擴增產(chǎn)物；（4）測序文庫制備及質(zhì)檢；（5）Miseq 上機高通量測序。

1.9 統(tǒng)計學處理

1.9.1 大鼠一般情況、體質(zhì)量、性激素、糖脂代謝及LPS 等指標的分析 使用SPSS22.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD 或鄧尼特檢驗。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

1.9.2 腸道菌群分析 使用Qiime2 diversity 插件對形成的OTU 代表序列進行AlPha 多樣性和Beta多樣性分析，使用Kruskal Wallis 及LEfSe 等方法分析物種在各分類水平組間的顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

實驗過程中，所有大鼠未出現(xiàn)呼吸困難、流涕、震顫、驚厥等異常表現(xiàn)，大鼠皮毛光澤，未出現(xiàn)大鼠死亡。大鼠進食量、飲食量活動情況等均未出現(xiàn)異常。

2.2 各組大鼠體質(zhì)量比較

各組大鼠實驗開始前的質(zhì)量無顯著差異。實驗結(jié)束后，與D 組相比，A、B 組大鼠體質(zhì)量明顯上升（P＜0.05）。A、B 組大鼠相比，體質(zhì)量無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量的比較（，n=6）Tab 1 Comparison of body weight of rats in each group（，n=6）

表1 各組大鼠體質(zhì)量的比較（，n=6）Tab 1 Comparison of body weight of rats in each group（，n=6）

注：與D 組相比，*P＜0.05。

體質(zhì)量(g)256.50±19.44*288.50±38.26*227.00±11.61組別A 組B 組D 組

2.3 各組大鼠卵巢組織形態(tài)學比較

如圖1 所示，光鏡下，D 組可見多個黃體，成熟卵泡內(nèi)可見卵母細胞，顆粒細胞排列整齊并呈多層，無囊狀擴張卵泡；A、B 組卵巢組織無發(fā)育成熟的卵泡，卵泡結(jié)構(gòu)不規(guī)則并可見較多的囊狀擴張卵泡，部分卵泡顆粒細胞層數(shù)減少甚至消失。

圖1 各組大鼠卵巢組織形態(tài)學比較（H＆E×40）Fig 1 The morphological comparison of rat ovary in each group（H＆E×40）

2.4 各組大鼠血清性激素水平比較

與D 組相比，B 組T 水平明顯升高（P＜0.001）；A 組、B 組E2水平明顯降低（P＜0.001），F(xiàn)SH 水平明顯降低（P＜0.001），LH 水平明顯降低（P＜0.001），LH/FSH 水平明顯升高（P＜0.001）。與A 組相比，B 組E2水平顯著降低（P＜0.05），T 水平顯著升高（P＜0.01）。兩組LH、FSH、LH/FSH 水平無顯著差異（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清性激素水平比較（，n=6）Tab 3 Comparison of serum sex hormone levels in each group of rats（，n=6）

表2 各組大鼠血清性激素水平比較（，n=6）Tab 3 Comparison of serum sex hormone levels in each group of rats（，n=6）

注：與D 組相比，**P＜0.01，***P＜0.001；與A 組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別A 組E2(ng/L)36.20±3.92***T(ng/mL)0.46±0.04 FSH(ng/L)7.05±0.97***LH(ng/L)33.15±3.23***LH/FSH 4.54±0.43***B 組33.05±2.59***#0.57±0.09***##7.70±2.23***33.98±4.26**4.73±0.75***3.63±0.56 D 組43.22±4.75 0.44±0.05 10.55±1.38 38.63±4.70

2.5 各組大鼠糖、脂代謝水平比較

各組大鼠Glu、FINS、HOMA-IR 水平無顯著差異。與D 組相比，A 組、B 組TC 水平明顯升高（P＜0.01）；與A 組 相比，B 組TG 水平顯著升高（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠糖、脂代謝水平比較（，n=6）Tab 3 Comparison of glucose and lipid metabolism levels of rats in each group（，n=6）

表3 各組大鼠糖、脂代謝水平比較（，n=6）Tab 3 Comparison of glucose and lipid metabolism levels of rats in each group（，n=6）

注：與D 組相比，**P＜0.01；與A 組相比，#P＜0.05。

TG(ng/L)49.75±6.93 57.43±11.49#50.77±6.78組別A 組B 組D 組Glu(mmol/L)5.00±0.18 4.93±0.42 4.87±0.40 FINS(mU/L)8.10±1.25 7.80±0.28 7.83±0.24 HOMA-IR 1.80±0.24 1.71±0.15 1.69±0.17 TC(μmol/L)17.23±3.18**17.69±4.41**13.98±2.83

2.6 各組大鼠血清LPS 水平比較

與D 組相比，A 組、B 組大鼠血清LPS 水平明顯上升（P＜0.01）。A 組與B 組血清LPS 水平無顯著差異。見表4。

表4 各組大鼠血清LPS 水平比較（，n=6）Tab 4 Comparison of serum LPS levels of rats in each group（，n=6）

表4 各組大鼠血清LPS 水平比較（，n=6）Tab 4 Comparison of serum LPS levels of rats in each group（，n=6）

注：與D 組相比，**P＜0.01，***P＜0.001。

LPS (ng/L)107.37±9.86***98.90±10.46**82.04±16.84組別A 組B 組D 組

2.7 各組大鼠腸道菌群比較

2.7.1 測序數(shù)據(jù) 從18 例樣本中共獲得461 553 條可用序列，基于所有樣品的有效序列進行聚類/去噪，共獲得854 個可操作分類單元（OPerational Taxonomic Units，OTU）。各組的OTU 數(shù)目用花瓣圖表示（圖2），重疊部分代表3 組共有的物種數(shù)目，非重疊的部分代表對應分組特有的物種數(shù)目。結(jié)果顯示，3 組共有OTU 229 個，A 組特有OTU 200 個，B 組特有OTU 202 個，D 組特有OTU 223 個。A、B組特有OTU 水平低于D 組。

圖2 OTU 數(shù)量分布Fig 2 OTU number distribution

2.7.2 樣品構(gòu)成豐富度-稀釋曲線 稀釋曲線用來評價測序量是否足以覆蓋所有類群，并間接反映樣品中物種的豐富程度。當曲線趨于平緩或者達到平臺期時可以認為測序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品中所有的物種，增加測序數(shù)據(jù)無法再找到更多的OTU。橫坐標代表隨機抽取的序列數(shù)量；縱坐標代表觀測到的OTU 數(shù)量。樣本曲線的延伸終點的橫坐標位置為該樣本的測序數(shù)量。如圖3 所示，隨著測序量達到一定程度，曲線趨于平坦，可以認為測序深度可基本覆蓋到樣品中所有的物種。

圖3 稀釋性曲線分析圖Fig 3 Dilution curve analysis diagram

2.7.3 腸道菌群組間AlPha 多樣性分析 AlPha 多樣性代表某一特定區(qū)域或樣品內(nèi)的物種多樣性，包括了物種組成的豐富度與均勻度兩方面，常用Chao 1、Observed OTU、Shannon 指數(shù)以及Faith's Phylogenetic Diversity（Faith PD）等進行評價，值越大表明樣品組成越復雜。結(jié)果顯示，與D 組相比，A組、B 組Chao 1、Observed OTU、Shannon 指 數(shù)、Faith PD 等方面均有下降趨勢，無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），但多樣性指數(shù)降低的趨勢一致。B 組的Chao 1 指 數(shù)、Observed OTU、Shannon 指 數(shù)、Faith PD 等較A 組有下降趨勢，差異無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。見圖4。

圖4 AlPha 多樣性指數(shù)分析Fig 4 AlPha diversity index analysis

2.7.4 腸道菌群Beta 多樣性分析 Beta 多樣性用于分析不同組微生物物種的多樣性。常用主坐標分析（PCoA）進行表示。見圖5，圖中兩樣本之間距離越遠則差異越大，距離越近表明樣本的物種組成結(jié)構(gòu)越相似。使用置換多元方差分析（PERMANOVA）方法進行比較各組間微生物組成結(jié)構(gòu)是否存在顯著性差異，結(jié)果顯示，B 組與D 組的微生物組成具有顯著差異（P＜0.05）。見圖5。

圖5 PCoA 分析Fig 5 PCoA analysis

表5 Beta 多樣性指數(shù)分析-置換多元方差分析結(jié)果（pairwise permanova results，n=12）Tab 5 Beta diversity index analysis-permutation multivariate analysis of variance results（pairwise permanova results，n=12）

2.7.5 菌群組成差異

2.7.5.1 門水平（Phylum） 單個樣本結(jié)果顯示（圖6），OTU 主要歸至細菌界的厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、放線菌門（Actinobacteria）等，其中厚壁菌門和擬桿菌門所占豐富度最高。

圖6 門水平菌群相對豐度柱狀圖Fig 6 Histogram of relative abundance of phylum horizontal flora

對門水平的菌群物種進行差異性分析，結(jié)果表明，與D 組相比，B 組厚壁菌門（Firmicutes）豐度上升（P＜0.01），A 組厚壁菌門（Firmicutes）有上升趨勢（P＞0.05）；A 組、B 組擬桿菌門（Bacteroidetes）豐度下降（P＜0.05；P＜0.05）。見表6。

表6 各物種在門水平上的平均相對豐度（%，n=6）Tab 6 The average relative abundance of each species at the phylum level（%，n=6）

表6 各物種在門水平上的平均相對豐度（%，n=6）Tab 6 The average relative abundance of each species at the phylum level（%，n=6）

注：與D 組相比，*P＜0.05；**P＜0.01。

Actinobacteria 0.81±0.29 0.83±0.50 0.82±0.61組別A 組B 組D 組Firmicutes 64.92±5.57 70.67±6.70**55.12±11.38 Bacteroidetes 26.08±5.53*25.20±6.03*37.90±11.19 Proteobacteria 7.40±8.49 2.46±2.13 4.95±2.80 Verrucomicrobia 0.38±0.70 0.38±0.79 0.57±1.25

2.7.5.2 屬水平（Genus） 單個樣本結(jié)果顯示（圖7），樣本中細菌群落組成中，豐富度前10 的菌屬分別是：乳桿菌屬（Lactobacillus）、普雷沃氏菌屬（Prevotella）、顫螺旋菌屬（OscillosPira）、布勞特氏菌屬（Blautia）、擬桿菌屬（Bacteroides）、ParaPrevotella菌屬、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、Allobaculum菌屬、螺桿菌屬（Helicobacter）、糞球菌屬（CoPrococcus）。

圖7 屬水平菌群相對豐度柱狀圖Fig 7 Histogram of relative abundance of genus horizontal flora

差異性分析結(jié)果顯示（表7），與D 組相比，B 組乳桿菌屬（Lactobacillus）顯著上升（P＜0.01），A 組有上升趨勢。與A 組相比，B 組乳桿菌屬（Lactobacillus）顯著上升（P＜0.05）。

表7 相對豐度前10 位的菌屬比較（%，n=6）Tab 7 Comparison of the top 10 bacterial genera in relative abundance（%，n=6）

表7 相對豐度前10 位的菌屬比較（%，n=6）Tab 7 Comparison of the top 10 bacterial genera in relative abundance（%，n=6）

注：與D 組相比，**P＜0.01；與A 組相比，#P＜0.05。

D 組8.29±6.42 9.18±13.46 6.84±2.22 0.45±0.35 1.68±1.49 2.33±3.02 3.66±3.04 1.26±0.84 0.71±0.65 0.63±0.52菌屬名稱Lactobacillus Prevotella OscillosPira Blautia Bacteroides ParaPrevotella Ruminococcus Allobaculum Helicobacter CoPrococcus A 組13.40±8.47 1.49±3.28 8.37±6.16 2.97±4.16 1.18±0.67 3.84±3.29 3.14±3.20 2.35±2.38 1.37±2.62 1.03±0.55 B 組29.23±17.86**0.06±0.14 6.85±4.29 0.28±0.28 1.00±1.05 5.08±5.68 1.86±0.87 1.71±1.20 0.51±0.72 1.99±2.05

2.7.6 組間差異性顯著分析-LEfSe 分析 LEfSe 分析屬于非參數(shù)檢驗，適用于菌群豐度差異檢驗，用于描述物種各水平在組間是否具有顯著性差異。LEfSe 可用于區(qū)分每一分組的特征微生物，一般將LDA＞3 的微生物，視為在某一分組中豐度較高的微生物。結(jié)果顯示，D 組差異性物種主要包括普雷沃氏菌屬（Prevotella）、f_Ruminococcaceae菌科、柔膜菌綱（Mollicutes）、柔膜菌門（Tenericutes）、厭氧原體屬（AnaeroPlasma）、厭氧原體目（AnaeroPlasmatales）、厭氧原體科（AnaeroPlasmataceae）；B 組差異性物種主要包括乳桿菌科（Lactobacillaceae）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、芽孢桿菌綱（Bacilli）、乳桿菌目（Lactobacillales）、雙歧桿菌科（Bifidobacteriaceae）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、雙歧桿菌目（Bifidobacteriales）、梭 菌 屬（Clostridium）、梭 菌 科（Clostridiaceae）、放線菌綱（Actinobacteria）；A 組差異性物種主要包括Roseburia菌。見圖8。

圖8 差異物種分布圖Fig 8 Differential species distribution map

3 討論

PCOS 是臨床常見的生殖-內(nèi)分泌兼代謝紊亂性疾病之一。育齡期婦女PCOS 在全球的患病率約為5%～10%［23］。腸道菌群被稱為人體的“第二基因組”，具有參與免疫調(diào)控、維持腸道上皮屏障健康、產(chǎn)生SCFA 等功能［24］。腸道菌群紊亂是由于腸道微生物多樣性改變致腸道微生物群與宿主細胞之間的異常相互作用，與代謝性疾病、自身免疫性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和心血管疾病等的病理過程有關［2］。近年來，有更多的研究發(fā)現(xiàn)PCOS 患者與健康人群之間存在腸道菌群的差異，且腸道微生態(tài)失衡與PCOS 的發(fā)生及疾病進展有關聯(lián)。

理想的動物模型的構(gòu)建是后續(xù)探討發(fā)病機制及病理過程的基礎。針對PCOS 的造模方法眾多，包括外源性雄激素、外源性胰島素、孕激素聯(lián)合人絨毛膜促性腺激素等誘導PCOS 的造模方法，但上述方法存在外源性激素的干擾作用，故對造模結(jié)果影響的因素并不單一［25-27］。來曲唑是一種芳香化酶抑制劑，能抑制體內(nèi)雄激素向雌激素的轉(zhuǎn)化過程從而升高雄激素水平。高水平的雄激素可引起卵泡過早閉鎖，引發(fā)卵泡發(fā)育障礙和生殖功能異常。因此，來曲唑造模能較好的反應PCOS 的典型臨床特征，且具有操作簡單、創(chuàng)傷小、不存在外源性激素的干擾等優(yōu)勢。

來曲唑制備PCOS 大鼠模型的方法相對成熟，已被廣泛用于PCOS 的實驗研究。綜觀進行藥物機理研究的文獻，來曲唑造模時長有用藥3 周和用藥5周的差別。本研究中，來曲唑用藥3 周和用藥5 周兩組模型大鼠鏡下均失去正常卵巢的組織形態(tài)學結(jié)構(gòu)，可觀察到多個囊狀擴張卵泡，顆粒細胞層變薄，黃體數(shù)量減少甚至消失。與正常對照組相比，造模5 周組大鼠血清T 明顯升高，但造模3 周組大鼠血清T 僅有升高的趨勢，不排除后者在停止用藥后發(fā)生了“自愈”。臨床或生化高雄激素血癥是PCOS 的核心病理特點，從這一點而言，造模5 周組大鼠是更適合用于研究的PCOS 模型，也更接近人在病理狀態(tài)下進行治療的狀態(tài)。雌激素對機體血脂代謝具有促進作用［28］。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，造模3 周與造模5 周的大鼠血糖和胰島素水平均無明顯差異，但總膽固醇均升高，說明來曲唑?qū)μ谴x無明顯的影響，但會影響脂代謝，可能與其降低雌激素水平有關。

雄激素水平的升高會影響腸道微生物的多樣性，改變多種腸道細菌的豐度，導致腸道菌群的紊亂［29］。本研究發(fā)現(xiàn)，來曲唑制造的PCOS 大鼠模型存在腸道菌群的變化，表現(xiàn)在α 多樣性、β 多樣性均與正常組大鼠有差異；在門水平的相對豐度也發(fā)生了改變，厚壁菌門的豐度有不同程度的上升，擬桿菌門豐度下降；在屬水平上，乳桿菌屬豐度上升，這與此前多項研究報道的研究結(jié)果方向一致［30-32］，造模5 周組較造模3 周組菌群紊亂的趨勢更加明顯，提示來曲唑造模后大鼠存在菌群失調(diào)的現(xiàn)象；不同來曲唑造模時長下菌群的結(jié)構(gòu)存在差異。兩組腸道菌群的差異可能與不同來曲唑用藥時長下雄激素水平差異有關。

此外，模型組存在擬桿菌屬、普雷沃氏菌屬、瘤胃球菌屬等益生菌豐度下降的趨勢，且造模5 周組上述菌屬豐度下降的程度甚于造模3 周組。高水平的乳桿菌屬可使腸道內(nèi)Ghrelin 水平減低。研究證實Ghrelin 具有延緩LH 對GnRH 反饋的應答、降低或延遲垂體釋放LH 脈沖強度的作用，從而抑制LH的過度合成與釋放；PCOS 患者的Ghrelin 分泌受損［33］，結(jié)合本研究結(jié)果可以推測乳桿菌屬可能通過腸-腦軸調(diào)控LH 水平，從而影響下丘腦-垂體-卵巢軸的激素分泌水平、加劇PCOS 的病理過程。

此外，擬桿菌屬屬于益生菌，具有調(diào)控T 淋巴細胞的增殖分化，抑制機體炎癥反應、調(diào)控宿主的免疫系統(tǒng)等作用，還能促進糖類及膽固醇代謝等。普雷沃氏菌屬是參與調(diào)控血糖的益生菌。瘤胃球菌屬能產(chǎn)生SCFA、降解多糖及纖維［26，34，35］。若益生菌減少，腸道菌群紊亂，會誘導腸道黏膜屏障受損、腸壁通透性增加，引起LPS 入血。LPS 是腸道革蘭陰性菌的細胞壁的組分之一，具有內(nèi)毒素作用，是炎癥和代謝疾病早期發(fā)展的重要因子［36］。能誘發(fā)機體的炎癥反應途徑，進而引發(fā)胰島素信號調(diào)控傳導障礙、導致全身的代謝紊亂。本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠血清LPS 水平顯著升高，說明腸道菌群的變化又引起了炎癥反應，后者能影響糖脂代謝，引發(fā)PCOS 病理過程加劇，形成惡性循環(huán)。

綜上所述，來曲唑造模3 周并停藥2 周與來曲唑造模5 周大鼠的模型特征存在差異，前者停用造模藥物后存在一定的“自愈”；后者PCOS 表型特征更為典型。利用造模5 周大鼠模型，在最后2 周進行藥物干預研究，既與人在PCOS 病理狀態(tài)下進行治療的狀況相符，也可以排除停止造模用藥后大鼠“自愈”帶來的偏差。PCOS 能引起腸道菌群的變化，腸道菌群在組間結(jié)構(gòu)的變化與不同造模時長有關。利用兩組模型，可以在一定范圍內(nèi)進行PCOS發(fā)病及病理變化與腸道菌群的關系研究。

作者貢獻度說明：

賈凡：實驗實施、數(shù)據(jù)整理、論文書寫及論文修改；鄭冬雪：實驗設計及實驗實施；陳如楓：實驗實施；趙紅玉：實驗實施；劉津源：實驗設計前期的資料查閱及整理；張莉莉：實驗設計前期的資料查閱；趙林華：實驗指導、實驗監(jiān)督；劉詠梅：實驗指導；張云：實驗指導；朱曉云：實驗指導；闞杰：實驗指導；劉新敏：實驗設計、實驗指導、實驗監(jiān)督、論文審校。