覃國(guó)新，閆飛燕，周其峰，李慧玲，勞水兵，楊玉霞，莫仁甫，羅麗紅，陳泳锨，何潔，韋宇寧，王海軍

（廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與檢測(cè)技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)部甘蔗品質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(南寧)，廣西南寧 530007）

豆芽作為人們?nèi)粘２妥郎系氖卟酥唬錉I(yíng)養(yǎng)豐富，富含維生素C、維生素A、氨基酸、膳食纖維等有易于人體健康的成份，深受人們的喜愛[1]。然而，為了提高豆芽產(chǎn)量，有不法商販在豆芽種植生產(chǎn)過程中濫用添加劑（如植物激素、化學(xué)試劑、抗生素等），致使有關(guān)“毒豆芽”的事件時(shí)有報(bào)道，使人們對(duì)食用豆芽存在一定的安全隱患。由于植物激素能參與調(diào)控植物生長(zhǎng)和發(fā)育的全過程[2-4]，成為了不法商販主要濫用的添加劑之一。吲哚乙酸（Indole acetic acid，IAA）作為重要的植物激素之一，對(duì)植物的生長(zhǎng)、分化起著極其重要的調(diào)節(jié)控制作用[5,6]。在豆芽種植過程中使用IAA不僅能促進(jìn)豆芽生長(zhǎng)發(fā)育縮短生產(chǎn)周期，而且能提高產(chǎn)量，但是盲目或者過量的使用該植物激素，勢(shì)必會(huì)造成環(huán)境污染、殘留量超標(biāo)、危害人們身體健康等與“毒豆芽”事件息息相關(guān)的問題[7,8]。然而，我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)尚未規(guī)定吲哚乙酸在豆芽中的殘留限量值，也未查到豆芽中吲哚乙酸殘留檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。因此，建立簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的方法檢測(cè)豆芽中吲哚乙酸殘留尤為重要。

目前，測(cè)定吲哚乙酸的方法主要有酶聯(lián)免疫分析法[9]、化學(xué)發(fā)光分析法[10]、氣相色譜法[11]、高效液相色譜法[12]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13]等。其中，酶聯(lián)免疫分析方法雖然儀器操作簡(jiǎn)單且分析速度快，但容易造成假陽性，定性和定量同時(shí)存在問題；化學(xué)發(fā)光分析法背景干擾較大且檢測(cè)過程操作較復(fù)雜；氣相色譜法需要柱前衍生，明顯增加了影響因素；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)具有高靈敏度和高選擇性好的優(yōu)勢(shì)[14]，但面臨儀器購置和運(yùn)行成本高昂等問題，難以實(shí)現(xiàn)普及；高效液相色譜分析法因具有重現(xiàn)性好、靈敏度高、準(zhǔn)確性可靠、儀器較容易普及等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注。但由于豆芽樣品本身存在一定的基質(zhì)干擾，按傳統(tǒng)固相萃取凈化方法前處理，操作繁瑣、費(fèi)時(shí)，難于滿足大批樣品的快速檢測(cè)需求。

QuEChERS前處理技術(shù)是2003年由Anastassiades等開發(fā)并用于植物源性食品中農(nóng)藥多殘留檢測(cè)的樣品前處理，因其具有簡(jiǎn)單、快速、有效、可靠等優(yōu)點(diǎn)而獲得廣泛應(yīng)用[15,16]。近年來，水果和蔬菜中農(nóng)藥多殘留色譜分析檢測(cè)一般都選擇 QuEChERS方法進(jìn)行樣品前處理[17,18]，而多功能針式過濾器（F-QuEChERS）是基于QuEChERS原理，在通過式固相固相萃取凈化的基礎(chǔ)上[19]，將提取溶液的凈化和過濾集于一步完成而建立的色譜分析樣品前處理方法，不僅具有QuEChERS方法的優(yōu)點(diǎn)，而且還節(jié)省了振搖凈化和離心的多個(gè)環(huán)節(jié)。將多功能針式過濾器方法代替?zhèn)鹘y(tǒng)固相萃取凈化方法，不僅能簡(jiǎn)化繁瑣的步驟，縮短樣品前處理時(shí)間，而且能有效降低樣品本身帶來的基質(zhì)效應(yīng)，從而有效解決傳統(tǒng)固相萃取凈化方法操作繁瑣費(fèi)時(shí)的問題。本實(shí)驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，基于F-QuEChERS原理，建立了多功能針式過濾器-高效液相色譜（HPLC）法快速檢測(cè)豆芽中的吲哚乙酸，方法操作簡(jiǎn)便，快速準(zhǔn)確，能滿足豆芽中吲哚乙酸殘留快速檢測(cè)的要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters 2695高效液相色譜儀配置有二級(jí)管陣列檢測(cè)器，美國(guó) Waters公司；色譜柱 XDB-C18（4.6 mm×250，5 μm），Agilent；DS-1 型高速組織搗碎機(jī)，上海標(biāo)模儀器廠；LD5-2A型低速離心機(jī)，北京京立離心機(jī)有限公司；多功能針式過濾器F-QuEChERS（含150 mg MgSO4、50 mg乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）PSA、50 mg十八烷基鍵合相硅膠（C18）、5 mg石墨化碳黑（GCB）），天津阿爾塔科技有限公司。

吲哚乙酸（純度≥99.6%，m/m），上海安譜試驗(yàn)科技股份有限公司；甲酸、乙酸、乙腈（色譜純），賽默飛世爾（中國(guó)）科技有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取適量的吲哚乙酸標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈配制成濃度為1000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備容液；準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用乙腈稀釋成濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液；接著用乙腈逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，配制得到0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 mg/L系列的乙腈標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品的前處理

提取：取新鮮豆芽試樣（購于本地市場(chǎng)）用組織搗碎機(jī)搗碎并混勻后，準(zhǔn)確稱取10.00 g，加入10.0 mL 1%乙酸乙腈提取液，渦旋提取2 min后，再加入1 g氯化鈉、2 g無水硫酸鎂后，接著渦旋提取1 min，最后以4000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，收集上清液待凈化。

凈化：取上述上清液1.5 mL以2滴/s的速度通過多功能針式過濾器F-QuEChERS于進(jìn)樣瓶中，供高效液相色譜測(cè)定。

1.4 高效液相色譜的檢測(cè)條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6×250 mm，5 μm），Agilent；柱溫：35 ℃；流速 1.0 mL/min；進(jìn)樣量10.0 μL。流動(dòng)相A：乙腈，流動(dòng)相B：0.1%甲酸溶液。梯度洗脫程序?yàn)椋?～2.0 min，10% A；2.0～3.0 min，10%～40% A；3.0～4.0 min，40% A；4.0～5.0 min，40%～80% A；5.0～6.0 min，80% A；6.0～7.0 min，80%～40% A；7.0～8.0 min，40% A；8.0～9.0 min，40%～10% A；9.0～10.0 min，10% A；檢測(cè)波長(zhǎng)：267 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件的選擇

眾所周知，農(nóng)藥殘留檢測(cè)樣品前處理通常使用的提取溶劑有甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯等。根據(jù)目標(biāo)農(nóng)藥的理化性質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了甲醇、乙腈、酸化甲醇及酸化乙腈作為提取溶劑對(duì)目標(biāo)物的提取效果，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，甲醇和乙腈對(duì)吲哚乙酸都有較好的提取效率，但甲醇提取所得成分更復(fù)雜，提取液較難凈化，檢測(cè)干擾較大。而吲哚乙酸在酸性條件下提取效果更好，通過實(shí)驗(yàn)研究表明，1.0%的乙酸乙腈提取樣品中的吲哚乙酸，其回收率達(dá)到80%以上，均比其它幾種溶劑的提取效果好。因此，實(shí)驗(yàn)以濃度為1.0%的乙酸乙腈作為提取溶劑。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)比了甲醇和乙腈作為高效液相色譜法的流動(dòng)相時(shí)的分離效果，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用乙腈時(shí)得到響應(yīng)值較高且的峰形較好；同時(shí)，考察不同濃度甲酸水溶液（0.01%、0.05%、0.1%、0.5%）為流動(dòng)相的響應(yīng)效果，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)甲酸水溶液濃度為0.1%時(shí)得到的峰形及響應(yīng)值均最佳，且在優(yōu)化的色譜條件下，待測(cè)植物激素在豆芽基質(zhì)中能達(dá)到良好的基線分離（分離色譜圖如圖1所示），因此，選擇了乙腈-0.1%甲酸溶液作為分離分析的流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，由圖可見，豆芽基質(zhì)不干擾目標(biāo)物的分離測(cè)定。

2.3 凈化方式的選擇

高效液相色譜法分析植物源性樣品的農(nóng)藥殘留，色譜分析容易受樣品基質(zhì)的干擾，從而影響檢測(cè)的靈敏度及準(zhǔn)確性。因此，選擇合適的樣品前處理凈化方式極其重要。多功能針式過濾器主要是基于QuEChERS原理，將凈化材料（PSA、C18、GCB等）填充于帶有有機(jī)濾膜的一次性注射針管筒中，以簡(jiǎn)化樣品前處理過程，具有QuEChERS的簡(jiǎn)單、快速、可靠、有效等特點(diǎn)，有效提高樣品前處理的效率，適合大批量樣品的分析檢測(cè)。本研究采用酸化乙腈渦旋提取2 min后，加入適量氯化鈉和無水硫酸鎂，再繼續(xù)渦旋提取 1 min，離心后，上清液直接經(jīng)多功能針式過濾器凈化以吸附蛋白質(zhì)、色素等干擾物質(zhì)，和傳統(tǒng)的固相萃取凈化方式相比，本方法將凈化方式縮減到一步完成，明顯提高了檢測(cè)效率。

2.4 實(shí)際樣品基質(zhì)效應(yīng)的考察

在實(shí)際樣品的分析檢測(cè)過程中，采用同一種前處理方法處理不同的樣品，樣品基質(zhì)仍然會(huì)對(duì)同一目標(biāo)物產(chǎn)生不同的干擾。本實(shí)驗(yàn)采用了基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率與純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線的斜率比值（ME），來評(píng)價(jià)豆芽基質(zhì)對(duì)吲哚乙酸色譜分析的基質(zhì)效應(yīng)，當(dāng)ME越接近于1時(shí)，表明基質(zhì)效應(yīng)就越小。方法如下：取不含待測(cè)物的豆芽空白樣品，經(jīng)“1.3”方法進(jìn)行前處理，得到樣品提取凈化液，接著用此凈化液稀釋100 mg/L的吲哚乙酸溶液，配成濃度為0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 mg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作容液。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)樣分析，以吲哚乙酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度作為橫坐標(biāo)，相對(duì)應(yīng)的峰面積作為縱坐標(biāo)進(jìn)行制作基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，吲哚乙酸在豆芽提取凈化液中的基質(zhì)效應(yīng)較?。∕E=0.98），因此，本實(shí)驗(yàn)選擇純?nèi)軇┡渲茦?biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行外標(biāo)法定量。

表1 豆芽中吲哚乙酸的基質(zhì)效應(yīng)Table 1 Matrix effects of indoleacetic acid in matrix of bean sprout

表2 實(shí)際樣品中吲哚乙酸殘留量回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 2 Spike recovery rates for indoleacetic acid (n=6)

2.5 方法的線性范圍、檢出限及定量下限

本研究在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定“1.2”節(jié)配制的系列吲哚乙酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用峰面積（Y）對(duì)質(zhì)量濃度（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程見表1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，吲哚乙酸在0.05～10.0 mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9999。以3倍信噪比所對(duì)應(yīng)的吲哚乙酸濃度來確定檢出限（LOD），以10倍信噪比所對(duì)應(yīng)的吲哚乙酸濃度來確定定量限（LOQ），計(jì)算得吲哚乙酸在豆芽基質(zhì)中的檢出限（LOD）為0.03 μg/kg，定量下限（LOQ）為 0.1 μg/kg。

2.6 回收率及精密度

取市售未檢出吲哚乙酸的豆芽為空白樣品，按“1.2”節(jié)進(jìn)行前處理。按低、中、高3個(gè)濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，對(duì)比多功能針式過濾器凈化方法（F-QuEChERS）和固相萃取凈化方法（SPE）兩種前處理方式。在10 g勻漿樣品中吲哚乙酸添加0.1、0.5、5.0 mg/kg 3個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果如表2所示，吲哚乙酸在豆芽中2種凈化方式的平均添加回收率范圍分別為80.6%～105.3%和78.5%～98.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為 1.8%～4.6%和2.9%～5.2%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)-QuEChERS和SPE的方法回收率和精密度都能滿足農(nóng)藥殘留檢測(cè)的要求，但F-QuEChERS方法操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短，適合大批樣品的快速檢測(cè)。

2.7 實(shí)際樣品的檢測(cè)

從農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)隨機(jī)購買10份豆芽樣品，按照本研究新建立的方法對(duì)豆芽中的吲哚乙酸進(jìn)行測(cè)定，10份樣品均未檢出吲哚乙酸殘留。

3 結(jié)論

本研究基于QuEChERS前處理技術(shù)，將多功能針式過濾器用于樣品前處理，將凈化和過濾集于一體，報(bào)道了HPLC方法檢測(cè)豆芽中吲哚乙酸殘留量，以乙腈和0.1%甲酸為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)267 nm，該方法操作簡(jiǎn)潔、快速、準(zhǔn)確、可靠。將多功能針式過濾器用于農(nóng)藥殘留檢測(cè)樣品前處理，不僅能有效除去蛋白質(zhì)、色素等樣品基質(zhì)的干擾物質(zhì)，而且對(duì)實(shí)驗(yàn)研究中吲哚乙酸能保持較高的回收率，有效提高了檢測(cè)效率，適用于批量豆芽樣品中吲哚乙酸殘留的快速檢測(cè)。