余文，安琳，崔生輝

（中國食品藥品檢定研究院,北京 100050）

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，LM，以下簡稱單增李斯特菌）為細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭氏陽性無芽孢桿菌，是引起人畜共患病的重要食源性致病菌[1-3],它可以污染生肉、熟肉制品、蛋類等多種食品[4]。單增李斯特菌可以在冷藏條件下生長，其污染水平是確定冷藏食品安全性的關(guān)鍵因素[5]。低濃度（102CFU/g）的污染即可感染高危人群，包括新生兒、孕婦和免疫缺陷者等[6-7]，引起敗血癥、腦膜炎及單核細(xì)胞增生等多種疾病，死亡率高達(dá)20%～30%[8-10]。鑒于單增李斯特菌致病力較強(qiáng)[11-12]，GB 29921-2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)預(yù)包裝食品中致病菌限量》[13]中對(duì)熟肉制品和即食生肉制品中單增李斯特菌進(jìn)行了明確的限量規(guī)定，并指定依據(jù) GB 4789.30-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中微生物學(xué)檢驗(yàn)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》[14]（以下簡稱 GB 4789.30-2016）開展檢驗(yàn)。

GB 4789.30-2016中使用李氏增菌肉湯（LB1、LB2）對(duì)食品中可能污染的單增李斯特菌進(jìn)行兩步選擇性增菌，再劃線到 PALCAM 瓊脂培養(yǎng)基和李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基上對(duì)可疑菌落進(jìn)行分離，并進(jìn)行生化鑒定。其中 LB1、LB2增菌肉湯和選擇分離培養(yǎng)基是影響單增李斯特菌分離效果的重要因素。GB 4789.28-2013《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》[15]（以下簡稱 GB 4789.28-2013）選用了一株單增李斯特菌（ATCC19115）和2株非目標(biāo)菌（大腸埃希菌ATCC25922和糞腸球菌ATCC29212）采用了半定量的方法對(duì) LB1、LB2增菌肉湯進(jìn)行質(zhì)控。但單增李斯特菌作為一個(gè)種，其遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜，僅符合GB 4789.28-2013的培養(yǎng)基是否能滿足常見單增李斯特菌的分離尚有待分析。

本研究使用30株單增李斯特菌和9株非單增李斯特菌對(duì)市售4個(gè)品牌的李氏增菌肉湯、6個(gè)品牌的PALCAM 瓊脂培養(yǎng)基和李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基質(zhì)量進(jìn)行了對(duì)比分析，所獲數(shù)據(jù)以期為培養(yǎng)基的質(zhì)控、GB 4789.28-2013和GB 4789.30-2016修訂提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基與菌株

李氏增菌肉湯（LB1、LB2）購自 A、B、C、D四個(gè)公司；李斯特菌顯色培養(yǎng)基購自A、B、C、D、G、F六個(gè)公司；PALCAM瓊脂培養(yǎng)基購自A、B、C、D、E、F六個(gè)公司；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）購自美國BD公司。

本研究采用菌株包括實(shí)驗(yàn)室保存的30株單增李斯特菌和9株非單增李斯特菌（見表1）。30株單增李斯特菌包括標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC19115（源自美國菌種保藏中心）和29株本實(shí)驗(yàn)室從食品中分離的單增李斯特菌。

表1 9株非單增李斯特菌信息Table 1 Information of 9 non-Listeria monocytogenes

1.2 主要儀器

PL2002電子天平，梅特勒-托利多公司；MLS-3780高壓滅菌器，日本三洋公司；Thermo 1389生物安全柜，美國THERMO公司；PR 205050 GCN生化培養(yǎng)箱，美國THERMO公司；全自動(dòng)微生物螺旋加樣系統(tǒng)，西班牙IUL公司；Viteck compact 2全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)，法國梅里埃公司；BrukerAutoflexⅡ型基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS），德國Bruker公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株確認(rèn)

使用全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)和MALDI-TOF MS對(duì)30株單增李斯特菌進(jìn)行確認(rèn)。

1.3.2 李氏增菌肉湯比對(duì)

取30株單增李斯特菌和9株非單增李斯特菌的TSA平板二代新鮮培養(yǎng)物，加入無菌生理鹽水中，制備 2.6～2.8麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?，用無菌生理鹽水梯度稀釋到合適倍數(shù)，采用E50模式螺旋涂布至TSA平板上，平行涂布兩個(gè)平板，36 ℃培養(yǎng)24 h，進(jìn)行計(jì)數(shù)。將LB1增菌肉湯1 mL分裝于24孔板中，取合適濃度的菌液10 μL分別加入不同廠家的LB1增菌肉湯中（接種水平為300～500 CFU/孔），30 ℃培養(yǎng)24 h。取培養(yǎng)后的LB1增菌肉湯梯度稀釋到合適倍數(shù)，采用E50模式螺旋涂布至TSA平板上，平行涂布兩個(gè)平板，36 ℃培養(yǎng)24 h，進(jìn)行計(jì)數(shù)。取10 μL LB1增菌肉湯接入1 mL LB2增菌肉湯中，30 ℃培養(yǎng)24 h。取LB2增菌肉湯梯度稀釋到合適倍數(shù)，采用 E50模式螺旋涂布至 TSA平板上，平行涂布兩個(gè)平板，36 ℃培養(yǎng)24 h，進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.3 PALCAM 瓊脂培養(yǎng)基和單增李斯特菌顯色培養(yǎng)基比對(duì)

取30株單增李斯特菌和9株非單增李斯特菌的TSA平板二代新鮮培養(yǎng)物，加入無菌生理鹽水中，制備 2.6～2.8麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?，用無菌生理鹽水稀釋到合適稀釋度，采用E50模式螺旋涂布至PALCAM、單增李斯特菌顯色培養(yǎng)基和參比TSA平板，平行涂布兩個(gè)平板，36 ℃培養(yǎng)48 h后進(jìn)行計(jì)數(shù)，接種水平為20～200 CFU/板。

1.3.4 選擇性分離固體培養(yǎng)基的生長率計(jì)算

取出待測(cè)培養(yǎng)基及TSA參比培養(yǎng)基，選擇菌落數(shù)在20～200 CFU的平板按照以下公式計(jì)算生長率（PR值）：

式中：

PR——生長率；

NS——待測(cè)培養(yǎng)基平板上得到的菌落總數(shù)；

N0——參比培養(yǎng)基平板上得到的菌落總數(shù)。

1.3.5 李氏增菌肉湯及選擇性分離固體培養(yǎng)基的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

按照GB 4789.28-2013要求推算，LB1、LB2肉湯增菌后的濃度須大于104CFU/mL，使用增菌后濃度相較標(biāo)準(zhǔn)濃度（104CFU/mL）倍數(shù)的對(duì)數(shù)（以下簡稱濃度倍數(shù)對(duì)數(shù)）進(jìn)行分析，即增菌后的計(jì)數(shù)結(jié)果除以104再取對(duì)數(shù)。對(duì)30株單核細(xì)胞增生李斯特菌在4個(gè)品牌的培養(yǎng)基得到的濃度倍數(shù)對(duì)數(shù)，使用雙因素方差分析（two-way ANOVA）分析培養(yǎng)基間差異，并使用配對(duì)t檢驗(yàn)比較LB1與LB2兩種增菌肉湯中平均生長濃度的差異。

對(duì)30株單增李斯特菌在6個(gè)品牌的PALCAM瓊脂培養(yǎng)基和單增李斯特菌顯色培養(yǎng)基上的生長率，使用雙因素方差分析（two-way ANOVA）分析培養(yǎng)基間差異，并使用配對(duì)t檢驗(yàn)比較PALCAM瓊脂培養(yǎng)基和顯色培養(yǎng)基上生長率的差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 李氏增菌肉湯的增菌效果比較

表2 30株單增李斯特菌在4個(gè)品牌李氏增菌肉湯LB1和LB2中增菌后濃度分布情況Table 2 Concentration distribution of 30 strains of Listeria monocytogenes in four brands of Listeria enriched broth LB1 and LB2

表3 單增李斯特菌在4個(gè)品牌李氏增菌肉湯LB1和LB2增菌后濃度比較（CFU/mL）Table 3 Comparison of concentration of Listeria monocytogenes after enrichment of LB1 and LB2in four brands of Listeria enriched brot(CFU/mL)

表4 非單增李斯特菌在李氏增菌肉湯LB1和LB2中24h增菌效果比較（CFU/mL）Table 4 Comparison of 24 h increasing effect of non-monocytosteria in Listeria increasing broth LB1 and LB2 (CFU/mL)

單增李斯特菌ATCC19115在4個(gè)品牌LB1肉湯中的生長濃度均可達(dá)到1×107CFU/mL以上，而在LB2肉湯中的生長濃度均低于2×105CFU/mL。30株單增李斯特菌在4個(gè)品牌的LB1中的平均生長濃度極顯著性高于LB2中的平均生長濃度（tdf=119=10.03，p＜0.01）。LB1增菌肉湯和LB2增菌肉湯中加入了不同濃度的萘啶酮酸和吖啶黃作為抑菌劑，LB1增菌肉湯中萘啶酮酸的濃度為 22.20 μg/mL，吖啶黃的濃度為 13.30 μg/mL；LB2增菌肉湯中萘啶酮酸的濃度為20 μg/mL，吖啶黃的濃度為25 μg/mL[14]。可見LB2增菌肉湯中萘啶酮酸的濃度幾乎為 LB1增菌肉湯中的二倍，因此LB2抑菌性較LB1強(qiáng)，LB1增菌效果優(yōu)于LB2。

30株單增李斯特菌在4個(gè)品牌LB1（F3,87=2.92，p＜0.05）和LB2（F29,87=18.12，p＜0.01）肉湯中的平均生長濃度可見顯著性差異，其中B品牌的LB1增菌后濃度顯著高于其余3個(gè)品牌（p＜0.05）。LB1和LB2液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)成分一致，為胰胨、多價(jià)胨、酵母膏、磷酸鹽、氯化鈉、和七葉苷。其中磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉等化學(xué)物質(zhì)較為穩(wěn)定，一般差異性不大，造成不同品牌LB1和LB2培養(yǎng)基質(zhì)量差異的原因，多為胰胨、多價(jià)胨、酵母膏等營養(yǎng)成分的質(zhì)量和配比差異。

6株單增李斯特菌在部分品牌的LB1和LB2肉湯的生長濃度低于 1×105CFU/mL，其中單增李斯特菌FC4278和FC11106在不同品牌肉湯中的生長狀況最差（表3），其余24株單增李斯特菌在4個(gè)品牌的LB1和LB2肉湯的生長濃度超過1×105CFU/mL。FC4278和FC11106單增李斯特菌在4個(gè)品牌的李氏增菌肉湯中增菌效果不佳，上述結(jié)果提示，李氏增菌肉湯中的營養(yǎng)成分不能滿足這2株單增李斯特菌的需求，且李氏增菌肉湯中的抑菌成分對(duì)這2株單增李斯特菌有一定的抑制作用。朱海華等[16]的研究中發(fā)現(xiàn)對(duì)單增李斯特菌的增菌效果更佳的增菌肉湯LB3。

大腸埃希氏ATCC25922、糞腸球菌ATCC29212、金黃色葡萄菌 ATCC25923和表皮葡萄球菌CMCC26609在4個(gè)品牌的LB1和LB2肉湯中均未見顯著生長；糞腸球菌 MS2515、大腸埃希氏CICC29001、枯草芽孢桿菌CMCC63501和陰溝腸桿菌MS2323在部分品牌LB1或LB2肉湯中呈顯著生長；肺炎克雷伯菌ATCC700603在所有品牌LB1和LB2肉湯中均呈顯著生長（表4）。

2.2 不同品牌PALCAM瓊脂培養(yǎng)基和李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基比對(duì)結(jié)果

30株單增李斯特菌在6個(gè)品牌的PALCAM瓊脂培養(yǎng)基上的生長率存在極顯著性差異（F5,145=13.16，p＜0.01）。包括ATCC19115在內(nèi)的13株單增李斯特菌在D品牌的PALCAM瓊脂培養(yǎng)基上生長率低于0.5，其中1株菌在E品牌、4株菌在F品牌培養(yǎng)基上生長率低于0.5（表5），其余17株單增李斯特菌在所有品牌的PALCAM瓊脂培養(yǎng)基上的生長率均超過0.5。30株單增李斯特菌在A、B和C品牌的PALCAM瓊脂培養(yǎng)基上的生長率均高于0.5。

30株單增李斯特菌在6個(gè)品牌顯色培養(yǎng)基上的生長率有著性差異（F5,145=2.32，p＜0.05）。30株單增李斯特菌在A、B、C、D、G品牌顯色培養(yǎng)基上的生長率均高于0.5，3株單增李斯特菌在F品牌培養(yǎng)基上的生長率低于0.5（表5）。

30株單增李斯特菌在顯色培養(yǎng)基上的生長率極顯著性高于 PALCAM 瓊脂培養(yǎng)基上的生長率（使用A、B、C、D、F五品牌數(shù)據(jù)，tdf=149=3.74，p＜0.01）。本研究結(jié)果提示，顯色培養(yǎng)基對(duì)單增李斯特菌的檢測(cè)效果優(yōu)于 PALCAM 瓊脂培養(yǎng)基。劉成文等、炊慧霞等[17,18]等也在研究中提到單增李斯特菌在顯色培養(yǎng)基上的檢出效率優(yōu)于 PALCAM 瓊脂培養(yǎng)基。李斯特菌在PALCAM瓊脂培養(yǎng)基上被區(qū)分出來是基于β-D-葡萄糖苷酶的活性。這種酶裂解培養(yǎng)基中的七葉甙產(chǎn)生灰綠色菌落，然后通過降解產(chǎn)物七葉苷與檸檬酸鐵銨中的鐵離子反應(yīng)，菌落周圍產(chǎn)生棕黑色暈圈（6,7-二羥基香豆素）。培養(yǎng)基中的氯化鋰和其它的抗生素能抑制革蘭氏陰性菌和大多數(shù)革蘭氏陽性菌生長。PALCAM 瓊脂培養(yǎng)基不能將單增李斯特氏菌與其他李斯特氏菌區(qū)分開，因此需要進(jìn)一步的鑒定分析來確定。李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基中的色素與李斯特氏菌具有的酶發(fā)生特異性反應(yīng)，水解底物，釋放出顯色基團(tuán)。在平板上，單增李斯特氏菌呈現(xiàn)出藍(lán)色菌落，菌落周圍有一圈白色暈環(huán),抑制劑可抑制雜菌的生長。李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基能區(qū)分單增李斯特氏菌與絕大部分其他李斯特氏菌，但不能區(qū)分綿羊李斯特氏菌。然而綿羊李斯特氏菌在食品檢測(cè)中非常少見。

表5 單增李斯特菌在6個(gè)品牌PALCAM和顯色培養(yǎng)基上生長率比較結(jié)果Table 5 Comparison of growth rate of Listeria monocytogenes on 6 brands of PALCAM and chromogenic medium

表6 非單增李斯特菌在PALCAM和顯色培養(yǎng)基上的生長率Table 6 Growth rate of non-monoproliferative Listeria on PALCAM and chromogenic medium

9株非李斯特菌在品牌F的PALCAM瓊脂培養(yǎng)基和品牌 G的顯色培養(yǎng)基上均未見生長。大腸埃希菌ATCC25922和糞腸球菌MS2515在五個(gè)品牌的顯色培養(yǎng)基和 PALCAM 瓊脂培養(yǎng)基上均未見生長。金黃色葡萄菌 ATCC25923在 A、B、C、D四個(gè)品牌的PALCAM培養(yǎng)基上呈現(xiàn)不同程度的生長，但該菌在五個(gè)品牌顯色培養(yǎng)基上均未見生長。表皮葡萄球菌CMCC26609在三個(gè)品牌PALCAM培養(yǎng)基和四個(gè)品牌顯色培養(yǎng)基上均呈現(xiàn)良好生長?？莶菅挎邨U菌CMCC63501和肺炎克雷伯菌ATCC700603僅在兩個(gè)品牌的顯色培養(yǎng)基上呈現(xiàn)良好生長，而陰溝腸桿菌MS2323僅在品牌 C的顯色培養(yǎng)基上呈現(xiàn)良好生長（表6）。

3 結(jié)論

3.1 GB 4789.28-2013中選擇了1株單增李斯特菌和2株非單增李斯特菌作為LB1、LB2增菌肉湯、PALCAM培養(yǎng)基和單增李斯特菌顯色培養(yǎng)基的質(zhì)控菌株。本研究選擇了 30株不同來源的單增李斯特菌作為目標(biāo)菌和9株非目標(biāo)菌。目標(biāo)菌的來源更廣，更全面，非目標(biāo)菌涵蓋了食品中常見的致病菌，更具代表性。此外，GB 4789.28-2013中對(duì)LB1、LB2增菌肉湯采用的是半定量計(jì)數(shù)法，PALCAM培養(yǎng)基和單增李斯特菌顯色培養(yǎng)基采用的是定量計(jì)數(shù)法進(jìn)行質(zhì)控。本研究采用了螺旋涂布計(jì)數(shù)法對(duì)市售的 4個(gè)品牌的李氏增菌肉湯、6個(gè)品牌的顯色培養(yǎng)基和 PALCAM 瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行對(duì)比，此方法為定量計(jì)數(shù)法，較GB 4789.28-2013中半定量計(jì)數(shù)法更為準(zhǔn)確。

3.2 本研究發(fā)現(xiàn)2株單增李斯特菌在4個(gè)品牌的李氏增菌肉湯中增菌效果均不佳，且LB1增菌肉湯中的平均生長濃度極顯著性高于LB2增菌肉湯。上述結(jié)果表明GB 4789.30-2016方法中使用LB1配合LB2肉湯進(jìn)行增菌存在漏檢風(fēng)險(xiǎn)，且LB1增菌效果優(yōu)于LB2。建議修訂GB 4789.30-2016時(shí)，考慮使用LB1配合另一種對(duì)單增李斯特菌增菌效果更佳的肉湯，以提高單增李斯特氏菌的檢出率。

3.3 市售的4個(gè)品牌的李氏增菌肉湯的增菌效果、6個(gè)品牌的 PALCAM 瓊脂培養(yǎng)基和李斯特菌顯色培養(yǎng)基的檢測(cè)效果存在顯著差異，不同品牌培養(yǎng)基質(zhì)量差異大。鑒于以上研究分析，建議有關(guān)機(jī)構(gòu)研制參比培養(yǎng)基，為培養(yǎng)基的生產(chǎn)和使用提供更規(guī)范的質(zhì)量控制。本研究所獲實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)培養(yǎng)基生產(chǎn)廠家的質(zhì)量控制和產(chǎn)品質(zhì)量提升具有一定參考價(jià)值，并為 GB 4789.28-2013標(biāo)準(zhǔn)的制修訂提供了參考數(shù)據(jù)。