伊艷杰，劉陽(yáng)，侯志鵬，趙書(shū)云，陸恒，賈劭，李瑞芳

（河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，鄭州市生物醫(yī)藥功能分子重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450001）

由霉菌引起的糧油食品變質(zhì)給食品工業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失[1,2]。霉菌屬中最常見(jiàn)的是黑曲霉，它是糧食儲(chǔ)藏過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)微生物，可以污染不同階段的農(nóng)產(chǎn)品，如收獲前、收獲后、加工和處理階段，它的存在對(duì)儲(chǔ)藏糧食的品質(zhì)影響甚大[3,4]。根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，每年全球平均有 2%的糧食因?yàn)槊棺兌荒苁秤茫械募Z油食品從外表上雖然看不出有霉變，但已受霉菌毒素污染，當(dāng)毒素被人體誤食或被皮膚吸收后，常會(huì)引起人體機(jī)能減退、患病甚至導(dǎo)致死亡[5-7]。

在過(guò)去幾十年中，使用化學(xué)防腐防霉劑作為抗菌劑來(lái)控制糧食變質(zhì)已成為一種常用手段。然而，隨著消費(fèi)者對(duì)天然、健康食品的日益關(guān)注，食品加工商開(kāi)始尋找更安全的替代品來(lái)取代化學(xué)添加劑[1,8]。生物防治已被逐漸應(yīng)用于食品安全控制中[9]，芽孢桿菌屬（Bacillusspp.）在自然界中廣泛存在，與傳統(tǒng)的益生菌相比，芽孢桿菌發(fā)揮作用的主要成份是芽孢體，對(duì)溫度具有較高耐受性，可以在室溫下長(zhǎng)期儲(chǔ)存，也可以在不同的pH環(huán)境下儲(chǔ)存[10]。詹藝舒等[11]從空氣、竹子內(nèi)生細(xì)菌中篩選出一株甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌Z21，發(fā)現(xiàn)該菌株的無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)黑曲霉、康氏木霉、綠色木霉等病菌有較強(qiáng)的抑制作用；Podile等[12]研究的枯草芽孢桿菌AF1使黑曲霉的細(xì)胞壁受損，進(jìn)而抑制黑曲霉的生長(zhǎng)；Hassan等[13]研究的地衣芽孢桿菌BL350-2不僅可以抑制黑曲霉MC5的生長(zhǎng)，并且可以降低真菌毒素的合成；?ztopuz等[14]分離出6株芽孢桿菌可以抑制黑曲霉EGE-K-213的孢子萌發(fā)和菌體生長(zhǎng)。蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）產(chǎn)生的多種活性物質(zhì)，例如低分子多肽、脂肽類(lèi)抗生素和抗菌蛋白等[15,16]，可以有效抑制多種病原微生物的生長(zhǎng)，具有良好的研究和應(yīng)用價(jià)值。蠟樣芽孢桿菌在小麥的黑曲霉防治應(yīng)用方面鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究對(duì)蠟樣芽孢桿菌XZ30-2的發(fā)酵液進(jìn)行穩(wěn)定性分析、小麥黑曲霉防治效果測(cè)定和動(dòng)物安全性評(píng)價(jià)，以推動(dòng)菌株XZ30-2發(fā)酵液在食品安全控制領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蠟樣芽孢桿菌XZ30-2（MZ646135）和黑曲霉均為本實(shí)驗(yàn)室-80 ℃保存菌株；KM 小鼠（許可證號(hào)SCXK（豫）2015-0004），體重18～22 g，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SPF級(jí)，雌雄各半，健康狀況良好。

葡萄糖、可溶性淀粉，天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；NaCl，天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；豆粕，市售；蛋白胨、酵母浸粉，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；瓊脂粉，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 生防細(xì)菌的抑菌能力檢測(cè)

采用平板對(duì)峙法測(cè)定蠟樣芽孢桿菌XZ30-2的抑菌活性[17]，在平板中央接種黑曲霉，28 ℃培養(yǎng)1 d后，在十字線適當(dāng)距離接種細(xì)菌XZ30-2，每組3次重復(fù)，在28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d后，測(cè)量拮抗菌與病原菌之間的距離即拮抗帶，拮抗帶的大小反映XZ30-2對(duì)黑曲霉的抑制能力。

1.2.2 發(fā)酵液的制備及抑菌活性測(cè)定

參考Shen等[18]方法，將拮抗細(xì)菌XZ30-2活化培養(yǎng)后，挑取單菌落于20/100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，160 r/min搖瓶培養(yǎng)10～12 h。然后按照發(fā)酵液4%的接種量，接種到100/250 mL LB液體培養(yǎng)基中，36 ℃，160 r/min搖瓶培養(yǎng)48 h。經(jīng)4 ℃，11000 r/min離心15 min，0.22 μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾，收集上清液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用生長(zhǎng)速率法[19]測(cè)定不同因素處理下發(fā)酵液的抑菌率。

1.2.3 發(fā)酵液的穩(wěn)定性分析

參考趙雅等[20]方法進(jìn)行XZ30-2發(fā)酵液的穩(wěn)定性測(cè)定。

（1）熱穩(wěn)定性

將發(fā)酵液分別在室溫約20（對(duì)照）、50、60、70、80、90和100 ℃等條件下恒溫2 h，每個(gè)處理重復(fù)3次。采用生長(zhǎng)速率法[19]測(cè)定不同溫度處理下發(fā)酵液的抑菌率。

（2）酸堿穩(wěn)定性

將發(fā)酵液用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH分別調(diào)整pH值為1、3、5、7、9、11和13，靜置2 h后調(diào)至pH值為7（自然pH），以pH為7處理的發(fā)酵液作為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。采用生長(zhǎng)速率法[19]測(cè)定不同pH處理下發(fā)酵液的抑菌率。

（3）紫外光穩(wěn)定性

將發(fā)酵液分成5等份，置于距離20 W紫外燈30 cm處，分別照射30、60、90、120和150 min，以未經(jīng)紫外線處理的發(fā)酵液為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。采用生長(zhǎng)速率法[19]測(cè)定不同紫外光處理下發(fā)酵液的抑菌率。

（4）自然光穩(wěn)定性

將發(fā)酵液分成7等份，放置于4500 lx光照培養(yǎng)箱正中央，依次經(jīng)過(guò)0、1、2、4、8、16和32 h白光照射后取出，每個(gè)處理重復(fù)3次。采用生長(zhǎng)速率法[19]測(cè)定不同日光處理下發(fā)酵液的抑菌率。

1.2.4 發(fā)酵液凍干粉的制備及其對(duì)黑曲霉防治效果測(cè)定

將XZ30-2的發(fā)酵液經(jīng)真空冷凍干燥制備成凍干粉于-20 ℃保存?zhèn)溆谩０l(fā)酵液凍干粉對(duì)小麥感染黑曲霉的防治研究參照袁遠(yuǎn)等[21]的方法并適當(dāng)修改。對(duì)照組和處理組小麥分別加入 4%的黑曲霉孢子懸浮液混勻，處理組小麥中加入5 mL 1%的凍干粉和15 mL無(wú)菌水混合均勻，對(duì)照組小麥中加入20 mL無(wú)菌水混合均勻，用保鮮膜密封后置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，7 d后觀察小麥感染黑曲霉的發(fā)病狀況。

1.2.5 動(dòng)物安全性分析

KM小鼠飼養(yǎng)于溫度22 ℃，相對(duì)濕度40%～70%的動(dòng)物房。動(dòng)物食用飼料和飲用水經(jīng)高壓滅菌處理，參照田原等[22]的方法飼養(yǎng)小鼠。

1.2.5.1 急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)

采用最大劑量耐受法[23,24]，以5 000 mg/kg·bw劑量為最大劑量，取0.5 g發(fā)酵液凍干粉溶于9.5 mL無(wú)菌水中，得到5%濃度的發(fā)酵液溶液。每組動(dòng)物10只，雌雄各半。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，處理組用發(fā)酵液凍干粉溶液20 mL/kg·bw灌胃，對(duì)照組用同體積無(wú)菌水灌胃。分別于第0、2、4、8和14 d稱(chēng)量各組小鼠體重，觀察小鼠的中毒表現(xiàn)及死亡情況，記錄小鼠的毛皮、眼睛、肢體活動(dòng)和行為等改變情況，注意是否出現(xiàn)抽搐、腹瀉、流涎、嗜睡和昏迷等癥狀，記錄中毒體征出現(xiàn)和消失的時(shí)間以及死亡時(shí)間。

1.2.5.2 小鼠血液生理指標(biāo)測(cè)定

小鼠經(jīng)過(guò)14 d灌胃處理后，取血樣前16 h斷食，不斷水，采用乙醚麻醉后，進(jìn)行心臟取血裝入滅菌的1.5 mL離心管，將血樣靜置1～3 h，經(jīng)3000 r/min離心10 min，用移液器吸取血清，使用生化分析儀測(cè)定各項(xiàng)血清學(xué)生理指標(biāo)[25,26]，包括谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、尿素氮（BUN）和肌酐含量（CREA）[27,28]。

1.2.5.3 病理學(xué)檢查

14 d后對(duì)用乙醚麻醉后的小鼠進(jìn)行尸檢，摘取心臟、肝臟、脾臟和腎臟等臟器，觀察各組臟器器官的顏色，形態(tài)是否異常，針對(duì)病變的臟器需要進(jìn)行組織病理學(xué)檢測(cè)，最后用生理鹽水沖洗臟器，濾紙吸干后稱(chēng)重，測(cè)得各組器官的臟器指數(shù)[29]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用SPSS 20.0分析各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的方差，并采用Duncan氏新復(fù)極差法分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異顯著性[30]。

2 結(jié)果與討論

2.1 蠟樣芽孢桿菌XZ30-2對(duì)黑曲霉的抑制

采用平板對(duì)峙法檢測(cè)XZ30-2對(duì)黑曲霉的抑制，由圖1可知，拮抗帶寬5.32 mm，說(shuō)明蠟樣芽孢桿菌XZ30-2菌株對(duì)黑曲霉有較強(qiáng)的抑制作用。通過(guò)生長(zhǎng)速率法測(cè)出 XZ30-2發(fā)酵液對(duì)黑曲霉的抑制率為54.31%。

2.2 發(fā)酵液的穩(wěn)定性分析

2.2.1 溫度對(duì)發(fā)酵液抑菌穩(wěn)定性的影響

不同溫度處理與對(duì)照組（室溫）相比，當(dāng)發(fā)酵液經(jīng)過(guò) 50、60 ℃處理后，其對(duì)黑曲霉的抑菌活性無(wú)顯著變化，當(dāng)處理溫度上升到 70 ℃后，抑菌活性開(kāi)始降低，經(jīng)過(guò)100 ℃處理后，抑菌率降低了31.86%，與對(duì)照組相比差異顯著（見(jiàn)圖 2a），表明發(fā)酵液經(jīng)過(guò)高溫處理后不具有良好的耐熱性。黃偉等[31]研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽胞桿菌JK19發(fā)酵液經(jīng)過(guò)80 ℃處理后抑菌圈直徑開(kāi)始下降，抑菌圈直徑下降了28%；賈淑穎等[32]研究蘇云金芽孢桿菌Bt185和HD-1菌株的發(fā)酵上清液，經(jīng)過(guò)50 ℃處理后，抑菌圈明顯變小，80 ℃處理后幾乎沒(méi)有抑菌圈，即抑菌物質(zhì)逐漸失活。表明發(fā)酵液中含有易受溫度影響的物質(zhì)，可能是某種多糖或者蛋白質(zhì)[33,34]。

2.2.2 酸堿對(duì)發(fā)酵液抑菌穩(wěn)定性的影響

發(fā)酵液在pH 5～9范圍處理時(shí)，其抑菌活性相對(duì)穩(wěn)定。在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿條件下，發(fā)酵液對(duì)黑曲霉的抑菌率降低，與對(duì)照相比呈顯著性差異（見(jiàn)圖 2b），表明發(fā)酵液不耐強(qiáng)酸和強(qiáng)堿，適宜 pH為 5～9，抑菌率為48.59%。與Jiang等[35]研究中的AspergillusAs-75的發(fā)酵液在pH為6的弱酸性條件下，抗菌活性穩(wěn)定，在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿條件下，抑菌圈最大降低9.9 mm結(jié)果相似。隨著pH的變化，發(fā)酵液會(huì)出現(xiàn)沉淀的現(xiàn)象，可能是脂肽類(lèi)物質(zhì)發(fā)生了酸沉淀[36]。

2.2.3 紫外光照射對(duì)發(fā)酵液抑菌穩(wěn)定性的影響

發(fā)酵液經(jīng)不同時(shí)間紫外光照射后，隨著照射處理時(shí)間延長(zhǎng)至150 min，抑菌率降低了1.69%，與對(duì)照組相比其抑菌活性無(wú)顯著影響（見(jiàn)圖2c），表明發(fā)酵液對(duì)紫外光長(zhǎng)時(shí)間的照射有較好的穩(wěn)定性。這一結(jié)果與Liu等[37]研究的Marine StreptomycesGB-2發(fā)酵液經(jīng)紫外光照射處理24 h抑菌直徑基本不變的現(xiàn)象相同。

2.2.4 日光照射對(duì)發(fā)酵液抑菌穩(wěn)定性的影響

發(fā)酵液經(jīng)不同日光照射處理0～32 h后，與對(duì)照組相比，其抑菌活性未發(fā)生變化。當(dāng)日光持續(xù)照射32 h后，其抑菌率為52.45%（見(jiàn)圖2d）。表明發(fā)酵液具有較好的自然光穩(wěn)定性。與劉小玉等[38]研究的解淀粉芽孢桿菌 ck-05在自然光持續(xù)照射 24 h后抑菌率為64.81%，與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化趨勢(shì)的結(jié)論保持一致。

2.3 蠟樣芽孢桿菌XZ30-2發(fā)酵液凍干粉對(duì)黑曲霉的防治效果

蠟樣芽孢桿菌XZ30-2的發(fā)酵液經(jīng)過(guò)冷凍干燥，每100 mL發(fā)酵液可得150 mg凍干粉，混合黑曲霉孢子懸浮液的小麥籽粒經(jīng)過(guò)發(fā)酵液凍干粉溶液處理后，在28 ℃培養(yǎng)7 d后，和對(duì)照組相比，沒(méi)有大片明顯的黑曲霉菌落（見(jiàn)圖3）。說(shuō)明該發(fā)酵液對(duì)高水分含量的小麥有著明顯的的防霉效果。

表1 XZ30-2發(fā)酵液對(duì)各組小鼠生長(zhǎng)情況的影響Table 1 Effects of XZ30-2 fermentation supernatant on the growth of mice in each group

2.4 蠟樣芽孢桿菌XZ30-2發(fā)酵液的動(dòng)物安全性評(píng)價(jià)

2.4.1 XZ30-2發(fā)酵液凍干粉對(duì)小鼠的生長(zhǎng)和死亡的影響

小鼠在動(dòng)物房經(jīng)過(guò)兩天適應(yīng)性飼養(yǎng)，各組小鼠的體重之間差別不明顯，說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具有可實(shí)驗(yàn)性。小鼠經(jīng)過(guò)發(fā)酵液灌胃后，采取自由飲食，在0、2、4、8和14 d同一時(shí)間對(duì)小鼠進(jìn)行稱(chēng)重，在早期灌胃后，小鼠體重增加速率稍有降低，在第8 d后恢復(fù)正常生長(zhǎng)速度。第14 d試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，體重變化差異不顯著(見(jiàn)表1)，說(shuō)明發(fā)酵液對(duì)小鼠并無(wú)促進(jìn)發(fā)育或抑制發(fā)育的情況，且各組均沒(méi)有出現(xiàn)死亡。周淑貞等[39]研究的短小芽孢桿菌B102口服菌液對(duì)小白鼠無(wú)致病性，生長(zhǎng)期間未出現(xiàn)死亡，與本研究結(jié)果一致，表明XZ30-2發(fā)酵液對(duì)小鼠生長(zhǎng)無(wú)致病性。

2.4.2 XZ30-2發(fā)酵液凍干粉對(duì)小鼠器官指數(shù)的影響

在對(duì)小鼠進(jìn)行發(fā)酵液灌胃的14 d后，解剖觀察小鼠臟器。結(jié)果顯示，處理組小鼠臟器顏色、大小和形態(tài)與對(duì)照組一致，處理組與對(duì)照組均無(wú)可見(jiàn)病變，與林松泉等[40]研究的凝結(jié)芽孢桿菌ZC-1安全性實(shí)驗(yàn)中剖檢小鼠，未見(jiàn)任何器官、消化道出現(xiàn)病變結(jié)果一致；Shobharani等[41]研究的彎曲芽孢桿菌MCC2427和地衣芽孢桿菌MCC2512對(duì)大鼠進(jìn)行90 d的灌胃，生命器官組織的顏色、大小、硬度正常，未發(fā)生病變。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠經(jīng)過(guò)發(fā)酵液14 d灌胃后，臟器組織無(wú)明顯病理變化，經(jīng)過(guò)稱(chēng)重計(jì)算得出臟器指數(shù)如表2，處理組與對(duì)照組數(shù)據(jù)均無(wú)顯著性差異，說(shuō)明蠟樣芽孢桿菌XZ30-2發(fā)酵液對(duì)小鼠的臟器指數(shù)沒(méi)有顯著影響，表明其對(duì)小鼠是安全的，無(wú)毒副作用。

表2 XZ30-2發(fā)酵液對(duì)各組小鼠臟器指數(shù)的影響Table 2 Effects of XZ30-2 fermentation supernatant on organ index of mice in each group

2.4.3 XZ30-2發(fā)酵液凍干粉對(duì)小鼠血清生理指標(biāo)的影響

在對(duì)小鼠進(jìn)行發(fā)酵液灌胃的14 d后，檢驗(yàn)小鼠血清生理指標(biāo)ALT、AST、BUN和CREA。如表3所示，與參照范圍形成對(duì)比，KM小鼠雄性的ALT高于參照值，但是處理組和對(duì)照組相比差異不大，說(shuō)明XZ30-2發(fā)酵液對(duì)ALT不具有顯著影響，可能是外界因素的影響導(dǎo)致小鼠ALT上升。另外小鼠的BUN均高于正常值；CREA均低于正常值，雌性處理組的BUN和對(duì)照組含量 14.50 mmol/L相比，BUN降低了 5.14 mmol/L。BUN是蛋白質(zhì)代謝的重要產(chǎn)物，蛋白質(zhì)的被利用程度是反映機(jī)體適應(yīng)力大小的指標(biāo)之一[42]，雌性的BUN下降說(shuō)明XZ30-2發(fā)酵液可以提高雌性機(jī)體的適應(yīng)能力；王巖等[43]研究的解淀粉芽孢桿菌 SSY1對(duì)小鼠進(jìn)行了急性毒性和慢性毒性試驗(yàn)，CREA均低于參照值，但和對(duì)照組相比不具有顯著性，基本體現(xiàn)小鼠正常的生理狀態(tài)。由此表明，該劑量對(duì)小鼠機(jī)體未造成損傷，XZ30-2發(fā)酵液對(duì)動(dòng)物的安全性良好。

表3 小鼠的血清生理指標(biāo)Table 3 The serological physiological indexes of mice in each group

3 結(jié)論

蠟樣芽孢桿菌XZ30-2對(duì)黑曲霉具有較好的抑菌效果，發(fā)酵液抑菌率為54.31%。蠟樣芽孢桿菌XZ30-2發(fā)酵液對(duì)紫外光、日光、pH 5～9具有較強(qiáng)的耐受性，隨著溫度升高至 70 ℃時(shí)抑菌效果開(kāi)始下降。在對(duì)鄭麥366進(jìn)行防霉測(cè)定中，處理組相比對(duì)照組無(wú)大面積明顯可見(jiàn)的黑曲霉菌落，XZ30-2發(fā)酵液具有良好的防霉效果。采用發(fā)酵液凍干粉溶液對(duì)小鼠進(jìn)行14 d灌胃期間，小鼠行為動(dòng)作和體態(tài)正常、體重增加正常，未出現(xiàn)異常行為和死亡現(xiàn)象；小鼠經(jīng)解刨后，處理組小鼠臟器的顏色、大小和形態(tài)與對(duì)照組一致，處理組與對(duì)照組均無(wú)可見(jiàn)病變；XZ30-2發(fā)酵液未對(duì)小鼠的肝功能和腎功能指標(biāo)產(chǎn)生負(fù)面影響，確定XZ30-2發(fā)酵液是安全、無(wú)毒的，可以被進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用。