董永貞，陳翊平

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北武漢 430070）

食源性致病菌引發(fā)的食源性疾病是國(guó)際公共衛(wèi)生領(lǐng)域最受關(guān)注的食品安全問(wèn)題之一。目前，常見(jiàn)的食源性致病菌主要包括單核細(xì)胞增生李斯特菌（簡(jiǎn)稱單增李斯特菌，Listeria monocytogenes）、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等。其中，單增李斯特菌因其環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、危害嚴(yán)重、分布廣泛等特性被列為重點(diǎn)檢測(cè)對(duì)象。單增李斯特菌是一種嗜冷的人畜共患病原菌，能夠在低溫下長(zhǎng)時(shí)間存活，易在食品加工生產(chǎn)鏈中傳播，且難以被滅殺[1-3]。人體感染后會(huì)引起流感樣疾病、腦膜炎、敗血癥等，嚴(yán)重時(shí)危及生命，致死率高達(dá)20%～30%[4-7]。單增李斯特菌引發(fā)的食品安全事件也屢見(jiàn)不鮮。因此，對(duì)單增李斯特菌進(jìn)行有效的監(jiān)控是保障人體健康、降低經(jīng)濟(jì)損失、提升社會(huì)效益的重要手段。

目前針對(duì)單增李斯特菌的常規(guī)檢測(cè)方法主要包括以下三類[8-10]：（1）培養(yǎng)鑒定法；（2）免疫分析法，如酶聯(lián)免疫吸附法和膠體金免疫層析法等[11]；（3）基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的分子生物學(xué)方法，如熒光定量PCR方法、微滴數(shù)字PCR方法、多重PCR方法等[12-13]。雖然已有多種用于單增李斯特菌定量定性的檢測(cè)方法，但以上方法在一定程度上存在增菌時(shí)間長(zhǎng)、樣品前處理復(fù)雜、成本高等問(wèn)題，難以滿足高流行性的單增李斯特菌現(xiàn)場(chǎng)、快速檢測(cè)的需求。

生物傳感器是一類近年來(lái)發(fā)展迅速、性能優(yōu)異的快速檢測(cè)方法。生物傳感器以生物分子（如抗體、核酸等）作為識(shí)別元件，通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)化器將識(shí)別信息轉(zhuǎn)換為便于檢測(cè)的光、電、磁等信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的快速分析[14]。目前，已有大量報(bào)道將生物傳感器用于單增李斯特菌的快速檢測(cè)[15-18]。不同于光、電信號(hào)，磁信號(hào)在食品基質(zhì)中背景低，在檢測(cè)過(guò)程中具有更高的信噪比。而基于磁信號(hào)的磁弛豫免疫傳感器也逐漸步入廣大研究者的視野。傳統(tǒng)的磁弛豫（magnetic relaxation switching，MRS）免疫傳感器是以偶聯(lián)有致病菌單克隆捕獲抗體和識(shí)別抗體的超順磁納米顆粒為磁信號(hào)探針，通過(guò)免疫反應(yīng)誘導(dǎo)磁探針聚集，引起磁信號(hào)增強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)致病菌快速檢測(cè)的均相免疫分析方法[19]。雖然傳統(tǒng)磁弛豫免疫傳感器具有樣品前處理簡(jiǎn)單、信噪比高等優(yōu)點(diǎn)，但傳統(tǒng)的磁弛豫免疫傳感器線性范圍較窄，靈敏度不足，易受基質(zhì)干擾而引起非特異性聚集，無(wú)法實(shí)現(xiàn)食源性致病菌的靈敏準(zhǔn)確分析[20,21]。開(kāi)發(fā)高性能的磁探針和探索有效的信號(hào)轉(zhuǎn)化機(jī)制是解決這一問(wèn)題的有效途徑。

本研究設(shè)計(jì)并合成了一種雙球狀的 Au-Fe3O4二聚體納米顆粒，并以其為磁信號(hào)探針，開(kāi)發(fā)了一種過(guò)氧化氫介導(dǎo)的 Ag@Au-Fe3O4磁探針組裝信號(hào)傳感策略。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建了新型的 MRS免疫生物傳感器，用于食品中單增李斯特菌的快速、高靈敏檢測(cè)，以期為食源性致病菌的快速檢測(cè)提供有力的工具。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

本研究中涉及的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌ATCC 19115，單核細(xì)胞增生李斯特菌CMCC 54002、威爾斯李斯特菌ATCC 35897、綿羊李斯特菌ATCC 19119、副溶血弧菌ATCC 17802、腸炎沙門氏菌ATCC 14028、大腸桿菌 ATCC 25922和金黃色葡萄球菌 ATCC 29213，均在本實(shí)驗(yàn)保存。

羧基修飾的磁性納米顆粒（MNP180）（直徑為180 nm；10 mg/mL），Thermo Fisher Scientific公司。單增李斯特菌抗體，美國(guó) GeneTex公司。牛血清白蛋白（BSA），1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺（EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺活性酯（NHS），上海阿拉丁生化科技股份有限公司。胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯（TSB）和胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA），青島海博生物技術(shù)有限公司。其他普通的試劑均為化學(xué)分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

便攜式磁分離架，美國(guó)Ocean NanoTech公司；低場(chǎng)核磁共振儀（Low field nuclear magnetic resonance spectrometer，LF-NMR），紐邁分析儀器股份有限公司（中國(guó)上海）；旋轉(zhuǎn)混勻儀，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器股份公司；MS-3渦流旋轉(zhuǎn)振蕩器，德國(guó)IKA公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津市泰斯特股份有限公司。

1.3 菌株活化和菌液制備

將凍存的單增李斯特菌菌種在常溫下解凍，并通過(guò)平板劃線法，在TSA培養(yǎng)基上對(duì)其進(jìn)行活化（37 ℃下恒溫培養(yǎng) 18 h）。然后，選取單個(gè)典型菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃下恒溫震蕩（轉(zhuǎn)速為180 r/min）培養(yǎng)24 h。吸取培養(yǎng)后的菌液1 mL于1.5 mL無(wú)菌離心管中，10000 r/min離心3 min，除去上清，用0.9%生理鹽水洗滌2次并重懸，通過(guò)平板計(jì)數(shù)法確定菌數(shù)，得到濃度為108CFU/mL的菌液備用。

1.4 Ag(NH3)2OH溶液的配制

將200 μL氨水（15 mol/L）加入到6 mL AgNO3（0.1 mol/L）中，并混合均勻。然后加入3 mL KOH（0.8 mol/L）溶液，并繼續(xù)緩慢加入190 μL氨水（15 mol/L）。最后加入25 mL去離子水得到Ag(NH3)2OH溶液，保存在4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 Au-Fe3O4納米磁探針的合成

本實(shí)驗(yàn)首先參考曾景斌等人[22]的方法合成了Fe3O4納米磁顆粒。在此基礎(chǔ)上，將1.25 mL HAuCl4（10 mmol/L），5 mg檸檬酸三鈉，0.5 mL Fe3O4納米磁顆粒加入到沸騰去離子水中，并保持30 min。離心洗滌后，得到Au-Fe3O4納米磁探針。

1.6 MNP180-Ab1的制備

在 1 mg MNP180溶液中加入 50 μL EDC（10 mg/mL）和25 μL NHS（10 mg/mL），在室溫下緩慢震蕩反應(yīng)15 min。磁分離并除去上清液后，用PBS緩沖液重懸，并加入 40 μg單增李斯特菌的捕獲抗體（Ab1），在室溫下緩慢震蕩反應(yīng) 2 h。磁分離并除去上清液后，加入500 μL含3%牛血清白蛋白的PBS溶液，在室溫下封閉1 h。封閉結(jié)束后用PBST（含0.05%吐溫 20的 PBS）緩沖液洗滌 3次并重懸，得到的MNP180-Ab1的保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.7 Ag@Au-Fe3O4-MRS免疫傳感器的構(gòu)建并用于單增李斯特菌的定量分析

在 100 μL MNP180-Ab1中分別加入 100 μL 單增李斯特菌菌液（50 CFU/mL～107CFU/mL），置于37 ℃下反應(yīng)1 h。反應(yīng)完成后，磁分離用PBST洗三次，分別加入100 μL辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的單增李斯特菌檢測(cè)抗體（HRP-Ab2，5 μg/mL），37 ℃反應(yīng) 1 h。磁分離用PBST洗三次，去離子水洗一次，分別加入50 μL H2O2（500 μmol/L），在 37 ℃下反應(yīng) 15 min。反應(yīng)完成后，取20 μL上清液加入200 μL Ag(NH3)2OH溶液（4.8 mmol/L）和100 μL Au-Fe3O4溶液（稀釋100倍）混合液中，在室溫下反應(yīng)10 min。反應(yīng)完成后，將反應(yīng)液進(jìn)行橫向弛豫時(shí)間（T2）的測(cè)定。

1.8 實(shí)際樣品檢測(cè)

取10 g火腿樣品切碎后與90 mL無(wú)菌生理鹽水（0.9% NaCl）混合，然后以中速均質(zhì)15 min。在900 μL勻漿中加入不同濃度的單增李斯特菌，振蕩混勻，使其終濃度分別達(dá)到102、104、106CFU/g。配制的加標(biāo)樣品以500 r/min低速離心30 s，以去除大顆粒食品顆粒，并對(duì)上清液通過(guò)本方法進(jìn)行分析。此外，在本地超市中購(gòu)買15個(gè)火腿盲樣，取10 g火腿樣品切碎后與90 mL無(wú)菌生理鹽水（0.9% NaCl）混合。均質(zhì)15 min后，在37 ℃下震蕩培養(yǎng)6 h。增菌后，低速離心得到上清液，通過(guò)所構(gòu)建的Ag@Au-Fe3O4-MRS傳感器對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)樣品設(shè)置三個(gè)平行。

1.9 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel、Origin軟件進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 Au-Fe3O4納米磁探針的表征

本研究首先合成了Au-Fe3O4納米磁顆粒（圖1a），并通過(guò)透射電子顯微鏡（TEM）對(duì)其進(jìn)行了微觀表征。如圖1b所示，所合成的Au-Fe3O4納米磁顆粒為雙球體結(jié)構(gòu)，其中黑色球體為Au納米顆粒，經(jīng)計(jì)算，其粒徑約為15 nm，灰色球體為Fe3O4納米磁顆粒，其粒徑約為20 nm。整個(gè)Au-Fe3O4納米磁顆粒的粒徑約為35 nm。本研究也利用紫外分光光度計(jì)對(duì)其進(jìn)行了表征（圖 1c），與 Fe3O4納米磁顆粒相比，Au-Fe3O4納米磁探針在520 nm附近出現(xiàn)顯著的吸收峰，與單純的Au納米顆粒吸收峰相同。本研究進(jìn)一步對(duì)其磁響應(yīng)性能進(jìn)行了測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Au-Fe3O4納米磁探針相比Fe3O4顆粒具有更好的橫向弛豫效率（圖1d）。同時(shí)也研究了Au-Fe3O4納米磁顆粒的儲(chǔ)存穩(wěn)定性，在4 ℃儲(chǔ)存720 d內(nèi)，其磁信號(hào)無(wú)顯著變化（圖1e），且其顏色無(wú)顯著變化（圖 1f），證明所合成的Au-Fe3O4納米磁探針具有良好的穩(wěn)定性。綜上，本研究成功合成出了磁響應(yīng)性能優(yōu)異的 Au-Fe3O4納米磁探針。

2.2 Ag@Au-Fe3O4信號(hào)讀出系統(tǒng)性能評(píng)價(jià)

本研究通過(guò)H2O2引起Au-Fe3O4磁探針狀態(tài)變化來(lái)構(gòu)建MRS信號(hào)讀出系統(tǒng)（圖2a）。當(dāng)H2O2存在時(shí)，體系中的銀離子（Ag+）能夠被還原為Ag單質(zhì)，沉積在 Au-Fe3O4納米顆粒中 Au部分的表面，形成Ag@Au-Fe3O4納米顆粒，而在銀單質(zhì)充足的情況下，所形成的 Ag@Au-Fe3O4納米顆粒能夠進(jìn)一步組裝為Fe3O4-Au@Ag@Au-Fe3O4聚集體，從而實(shí)現(xiàn)Au-Fe3O4磁探針從單分散狀態(tài)變?yōu)榫奂癄顟B(tài)，引起T2信號(hào)的增強(qiáng)。H2O2含量的不同，所引起的聚集狀態(tài)的變化程度不同，產(chǎn)生的T2信號(hào)的變化值（?T2）也不同，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)H2O2的定量分析。

本研究對(duì) Ag@Au-Fe3O4磁顆粒所形成的聚集體進(jìn)行了表征。TEM 結(jié)果顯示，經(jīng)組裝后，Au-Fe3O4磁探針由圖1b中的分散狀態(tài)變?yōu)閳D2b的聚集狀態(tài)。同時(shí)，本研究通過(guò)UV-vis對(duì)Au-Fe3O4磁探針聚集前后的紫外吸收進(jìn)行了測(cè)定（圖 2c）。結(jié)果顯示，聚集后體系的紫外吸收峰的位置由原來(lái)的 520 nm（紅色線）偏移到480 nm（藍(lán)色線），這是由于Ag殼的包覆使Au納米顆粒被掩蓋，從而產(chǎn)生了藍(lán)移。

基于上述驗(yàn)證結(jié)果，本研究進(jìn)一步對(duì) Ag@Au-Fe3O4信號(hào)讀出系統(tǒng)的性能進(jìn)行了評(píng)價(jià)。如圖2d所示，隨著HRP濃度的增加，剩余H2O2濃度降低，?T2值逐漸減?。?T2值=T2（H2O）-T2（H2O2））。這表明該信號(hào)讀出系統(tǒng)對(duì)HRP具有良好的響應(yīng)，可用于MRS生物傳感器的開(kāi)發(fā)。

2.3 Ag@Au-Fe3O4-MRS免疫傳感器檢測(cè)單增李斯特菌的性能評(píng)價(jià)

在上述 Ag@Au-Fe3O4磁信號(hào)讀出系統(tǒng)可行且具有良好響應(yīng)性的基礎(chǔ)上，本研究結(jié)合免疫分析方法，構(gòu)建了Ag@Au-Fe3O4-MRS免疫傳感器（圖3a）。當(dāng)單增李斯特菌存在時(shí)，MNP180-Ab1能夠?qū)ζ溥M(jìn)行捕獲，進(jìn)而結(jié)合HRP-Ab2，形成帶有HRP的“雙抗夾心”免疫復(fù)合物。HRP的量與單增李斯特菌濃度正相關(guān)。HRP能夠催化H2O2降解，而剩余的H2O2能夠被Ag@Au-Fe3O4信號(hào)讀出系統(tǒng)定量分析，從而實(shí)現(xiàn)單增李斯特菌的檢測(cè)。

2.3.1 靈敏度實(shí)驗(yàn)

本研究研究了Ag@Au-Fe3O4-MRS免疫傳感器檢測(cè)單增李斯特菌的靈敏度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著單增李斯特菌濃度的增大，?T2值逐漸增大。經(jīng)計(jì)算，本MRS傳感器檢測(cè)單增李斯特菌的檢測(cè)限為 50 CFU/mL（圖 3a），線性范圍為 102CFU/mL～106CFU/mL（線性方程：Y=39.38X+1315.18，R2=0.99）（圖3b）。

本研究對(duì)不同單增李斯特菌的檢測(cè)方法進(jìn)行了對(duì)比（表1）。與現(xiàn)有的基于酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的方法相比，本 MRS傳感器在靈敏、線性范圍、簡(jiǎn)便性、檢測(cè)成本等方面均具有較好的優(yōu)勢(shì)，在致病菌檢測(cè)方面有良好的應(yīng)用前景。

本研究中 MRS免疫傳感器的高靈敏度主要?dú)w因于三方面的因素：（1）HRP-H2O2介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)既具有酶促反應(yīng)的高效性，同時(shí)信號(hào)轉(zhuǎn)化降低了基質(zhì)干擾，避免了因基質(zhì)引起的非特異性聚集，有助于傳感器靈敏度的提高；（2）H2O2介導(dǎo)的Ag@Au-Fe3O4信號(hào)讀出系統(tǒng)是一種高效的組裝及信號(hào)產(chǎn)生策略，能夠解決傳統(tǒng) MRS傳感器聚集效率低的難題，有利于提高靈敏度；（3）所合成的Au-Fe3O4磁探針具有更強(qiáng)的磁弛豫效率，為靈敏度的提高提供有利的基礎(chǔ)。

表1 單增李斯特菌的檢測(cè)方法的對(duì)比Table 1 Comparison of detection methods for Listeria monocytogenes

2.3.2 特異性實(shí)驗(yàn)

本研究進(jìn)一步測(cè)試了Ag@Au-Fe3O4-MRS免疫傳感器檢測(cè)單增李斯特菌的特異性。以威爾斯李斯特菌、綿羊李斯特菌、副溶血弧菌、腸炎沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為陰性對(duì)照組，驗(yàn)證方法的特異性。其中所有細(xì)菌的濃度均為105CFU/mL。如圖4a所示，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌 ATCC 19115和CMCC 54002的?T2值顯著高于陰性對(duì)照組，證明本MRS免疫傳感器在檢測(cè)單增李斯特菌時(shí)具有良好的特異性。

2.3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

本研究通過(guò)對(duì)本 MRS免疫傳感器元件（MNP180-Ab1、Ab2-HRP、Au-Fe3O4）進(jìn)行不同時(shí)間的儲(chǔ)存，測(cè)試了本MRS免疫傳感器的穩(wěn)定性。如圖4b所示，MNP180-Ab1、Ab2-HRP、Au-Fe3O4在 4 ℃儲(chǔ)存0、3、7、10、14、21、30 d后，對(duì)單增李斯特菌（105CFU/mL）的信號(hào)響應(yīng)無(wú)顯著變化，證明本MRS免疫傳感器的穩(wěn)定性良好。

2.4 Ag@Au-Fe3O4-MRS免疫傳感器檢測(cè)火腿中的單增李斯特菌

實(shí)際應(yīng)用性是分析方法的重要方面，為了評(píng)估本研究所構(gòu)建的Ag@Au-Fe3O4-MRS免疫傳感器在復(fù)雜基質(zhì)中檢測(cè)單增李斯特菌的實(shí)用性，本研究進(jìn)行了加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)和實(shí)際樣品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

2.4.1 回收率實(shí)驗(yàn)

表2 Ag@Au-Fe3O4-MRS免疫傳感器的加標(biāo)回收率Table 2 Recovery rates of Ag@Au-Fe3O4-MRS immunosensor

本研究通過(guò)在空白火腿樣品中分別添加不同濃度水平（低：102CFU/g，中：104CFU/g，高：106CFU/g）的單增李斯特菌來(lái)測(cè)定本 MRS免疫傳感器的加標(biāo)回收率情況。如表 2所示，火腿樣品中平均回收率為79.4%～105.9%，且變異系數(shù)為 6.34%～11.42%。該結(jié)果表明，Ag@Au-Fe3O4-MRS免疫傳感器對(duì)復(fù)雜食品樣品中的單增李斯特菌檢測(cè)具有良好的抗基質(zhì)干擾作用，具有較高的準(zhǔn)確性。這是由于（1）復(fù)雜的食品樣品基質(zhì)中無(wú)磁信號(hào)，背景信號(hào)低；（2）本方法中磁探針的組裝過(guò)程中，Au納米顆粒起到了橋梁作用，降低了基質(zhì)干擾；（3）高效的信號(hào)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)排除了很大部分的機(jī)制干擾。

2.4.2 實(shí)際樣品檢測(cè)

基于上述研究結(jié)果，本研究采用所構(gòu)建的Ag@Au-Fe3O4-MRS免疫傳感器和qPCR方法進(jìn)行了隨機(jī)火腿樣品（采購(gòu)自武漢當(dāng)?shù)氐某校┲袉卧隼钏固鼐臋z測(cè)。如圖5a所示，在所檢測(cè)的15個(gè)火腿樣品中，樣品2、3、5、10、13均檢測(cè)為單增李斯特菌陽(yáng)性，其他樣品均檢測(cè)為陰性，并且本方法與 qPCR方法檢測(cè)結(jié)果具有良好的一致性（圖 5b）。本研究構(gòu)建的MRS免疫傳感器不需要復(fù)雜的前處理和DNA提取步驟，反應(yīng)體系簡(jiǎn)單，成本較低，在食源性致病菌快速檢測(cè)方面具有良好的應(yīng)用前景。

3 結(jié)論

本研究構(gòu)建了一種快速高靈敏的 MRS免疫傳感器，并將其用于單增李斯特菌的定量分析。在該傳感器中，HRP-H2O2介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)能夠有效地放大信號(hào)，并通過(guò)將單增李斯特菌的濃度信號(hào)轉(zhuǎn)化為H2O2的濃度信號(hào)，降低了食品基質(zhì)的干擾。而 H2O2介導(dǎo)的 Ag@Au-Fe3O4信號(hào)讀出系統(tǒng)是一種高效的信號(hào)組裝策略，避免了傳統(tǒng)基質(zhì)與抗體修飾磁顆粒的直接接觸模式，在提高傳感器靈敏度的同時(shí)，避免了磁顆粒的非特異性聚集，提高了方法的準(zhǔn)確性。因此，本研究開(kāi)發(fā)的Ag@Au-Fe3O4-MRS免疫傳感器具有良好的靈敏度和準(zhǔn)確性，在食源性致病菌檢測(cè)方面具有良好的潛力。