董 敏 尤金煒 梁 磊 吳正林 田小蕓

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物室，南京 210002)

遺傳上的高度純合是對近交系動物的基本要求。根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)，新建立的近交系需進(jìn)行相應(yīng)的遺傳檢測，國際上通用的遺傳檢測方法很多，其中毛色基因檢測法是遺傳監(jiān)測的重要方法之一[1]。自發(fā)性白內(nèi)障大鼠由本中心培育，經(jīng)過10多年的連續(xù)近交繁殖，現(xiàn)已培育至第31代，暫定名為自發(fā)性先天性白內(nèi)障大鼠(TSC)大鼠，理論上已經(jīng)達(dá)到基因高度純合，符合近交系動物的近親繁殖代數(shù)要求，且具有自身獨(dú)特的生物學(xué)特征[1]。本實(shí)驗(yàn)組已經(jīng)對TSC大鼠各生理指標(biāo)作了相應(yīng)的檢測與分析，已經(jīng)做了晶狀體的病理學(xué)研究、繁殖性能及生長發(fā)育實(shí)驗(yàn)、血液生化及血液流變學(xué)指標(biāo)、臟器重量及系數(shù)以及血壓與體溫基礎(chǔ)數(shù)據(jù)分析。另外，為了監(jiān)測TSC大鼠的基因純合度和遺傳穩(wěn)定性，我們對其毛色基因類型進(jìn)行了測試，確定了其基因類型。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

1.1.1待測TSC大鼠：由東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物室提供，來自基礎(chǔ)群的TSC大鼠，6～8周齡，體質(zhì)量180～200 g，雌雄各半，毛色為白色，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號【SCXY(軍)2017-0018】。

1.1.2已知復(fù)隱性基因大鼠：F344大鼠及BN大鼠由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供【SCXK(滬)2018-0006】。其毛色及基因型分別為白色(aaBBcc)和巧克力色(aabbCC)。

1.2 飼養(yǎng)管理及環(huán)境

實(shí)驗(yàn)大鼠均飼養(yǎng)在屏障環(huán)境中，室內(nèi)的溫濕度均由中央空調(diào)控制，溫度為20～26 ℃，相對濕度為50%～70%，采用12 h∶12 h晝夜間斷照明。使用許可證號【SYXK(軍)2017-0037】。大鼠飼料為60Co輻射飼料，生產(chǎn)許可證號【蘇飼審(2019)01008】，營養(yǎng)成分執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：Q/320115XT04-2019。飲水為消毒的酸化水，使用的墊料、盒子等用具均進(jìn)行131 ℃ 5 min高壓預(yù)真空滅菌。飼養(yǎng)由持證上崗具有大專及以上文化的熟練技師負(fù)責(zé)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1方法：將待測基因型的TSC大鼠雄性分別與已知基因型的F344大鼠及BN大鼠雌性按1∶2交配，同時將待測基因型的TSC大鼠雌性分別與已知基因型的F344大鼠及BN大鼠雄性按1∶2交配，每組7窩，生產(chǎn)后兩周觀察F1代仔鼠毛色，觀察時間1～2周。再通過TSC與BN大鼠的F1代與親本BN大鼠按1∶2回交，每組7窩，生產(chǎn)后觀察仔鼠1～2周。通過以上已知復(fù)隱性親本F344大鼠及BN大鼠的基因型、F1代大鼠的毛色基因表現(xiàn)型及F1代與親本BN大鼠回交毛色基因型，綜合判斷TSC大鼠毛色基因的基因型。

1.3.2判斷結(jié)果要求：純系大鼠后代毛色應(yīng)完全一致。出現(xiàn)異色者(如毛色變黃、腹印等)，即為不純；被測品系用于交配的雌雄動物數(shù)均不少于7只，每個個體后代仔鼠觀察數(shù)不少于7只。

2 結(jié)果

2.1 用已知復(fù)隱性基因的F344大鼠及BN大鼠與待測基因型的TSC大鼠相互交配

TSC大鼠與BN大鼠雜交，無論雌雄，其F1代所觀察的大鼠毛色均呈一致的巧克力色，見圖1 F1代B位點(diǎn)為Bb基因。TSC大鼠與F344大鼠雜交，無論雌雄，其F1代所觀察的大鼠毛色均呈一致的白色，見圖2，可能為白色隱性上位，說明其沒有C基因，具體見表1。

圖1 TSC與BN雜交F1Fig.1 F1 Hybridization of TSC and BN

圖2 TSC與F344雜交F1Fig.2 F1 Hybridization of TSC and F344

圖3 圖1中雜交F1與TSC回交Fig.3 Backcross of TSC with F1 generation in Figure 1

表1 F1代仔鼠的毛色表型Table 1 Hair color phenotype of F1 generation

2.2 用TSC大鼠與BN大鼠雜交的F1代與TSC大鼠回交

TSC大鼠與BN大鼠雜交的F1代與TSC大鼠回交后，仔鼠出現(xiàn)黑、白、花色(圖3)，初步推斷F1代A位點(diǎn)為Aa基因，根據(jù)以上信息，推測TSC大鼠與BN大鼠F1代基因型為AaBbCc，具體見表2。

表2 F1代與TSC大鼠回交的毛色表型Table 2 Hair color phenotype of F1 generationbackcrossed with TSC rats

2.3 根據(jù)已知復(fù)隱性親本的基因型及F1代仔鼠毛色表現(xiàn)型，對TSC大鼠毛色基因結(jié)果作出判斷

已知復(fù)隱性基因大鼠BN大鼠(巧克力色)基因型為aabbCC，F(xiàn)1代基因型為aaBbBc，由此推測待測白內(nèi)障大鼠TSC的基因型為aaBBcc。

3 討論

3.1 控制毛色的基因分析

控制毛色的基因很多，受ABC 3個位點(diǎn)支配。A位點(diǎn)上基因所控制的是每根毛中色素的分布，基因A對a顯性?；蛐褪茿A或Aa時，色素在毛尖或根部含量高，中部少。基因?yàn)閍a時，色素在毛中沉著均勻一致。B位點(diǎn)上基因與黑色素合成有關(guān)，基因B對b顯性，基因型是BB或Bb時，可合成黑色色素，bb時合成褐色色素。A、B位點(diǎn)可組合成4種基本毛色：A-B為野生色；aaB為黑色；Abb為肉桂色；aabb為棕色[2-3]。C位點(diǎn)上基因與被毛毛色形成有關(guān)，基因C對c顯性，基因型為CC或Cc時，被毛均為有色，基因型為cc時，被毛為白色，眼為紅色。C位點(diǎn)具有隱性上位作用，當(dāng)基因型為cc時，A、B位點(diǎn)無論怎樣組合，被毛顏色均為白色[4-5]。

3.2 關(guān)于TSC大鼠的毛色基因位點(diǎn)純合度和毛色基因型

TSC大鼠是由本單位在屏障環(huán)境SD大鼠生產(chǎn)的仔鼠中發(fā)現(xiàn)的5只先天性白內(nèi)障大鼠，經(jīng)過10多年近交繁育的新近交品系，已培育至第31代，暫命名為TSC大鼠，理論上已經(jīng)達(dá)到基因高度純合。本實(shí)驗(yàn)中，TSC大鼠與F344大鼠交配時，所生F1代顏色均為白色，初步推斷C位點(diǎn)為cc，不含C基因。A、B兩個位點(diǎn)尚不能判斷。在TSC大鼠與BN大鼠交配所生的F1代仔鼠中，14窩仔鼠毛色均為巧克力色，已知BN大鼠基因型為aabbCC，結(jié)合前面結(jié)果，初步判斷，F(xiàn)1代仔鼠B位點(diǎn)為Bb，C位點(diǎn)為Cc。根據(jù)其F1代與TSC大鼠回交，仔鼠出現(xiàn)黑色、白色、花色(圖3)，初步推斷其F1代A位點(diǎn)為Aa，根據(jù)以上判斷，其F1代基因型應(yīng)該為AaBbCc，因此證明TSC大鼠毛色基因?yàn)锳ABBcc。

在測試中，雌或雄性TSC大鼠分別與BN、F344大鼠雜交或回交，其F1代仔鼠毛色表型均為均一色，本次測試結(jié)果結(jié)合項目組前期做的晶狀體病理學(xué)研究、繁殖性能及生長發(fā)育實(shí)驗(yàn)、血液生化及血液流變學(xué)指標(biāo)、臟器重量及系數(shù)以及血壓與體溫基礎(chǔ)等數(shù)據(jù)分析結(jié)果[6-10]，說明TSC大鼠毛色基因純合度均達(dá)100%，遺傳純合度已達(dá)國家標(biāo)準(zhǔn)，是毛色基因位點(diǎn)高度純合的自發(fā)性先天性白內(nèi)障大鼠模型。