趙凱悅 劉蜜敏 曾 利 姜海倫 李卓榮 徐 芳 劉 睿

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，北京 100050)(2.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，烏魯木齊 830004)

瘤果黑種草子是毛茛科植物瘤果黑種草(NigellaglanduliferaFreyn et Sint.)的干燥成熟種子，是新疆維吾爾族習(xí)用藥物，具有補(bǔ)腎健腦、通經(jīng)、通乳、利尿等功效[1]，其臨床制劑常被用于治療風(fēng)濕病關(guān)節(jié)肌肉腫痛、腰膝冷痛[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，瘤果黑種草子所含活性成分豐富，在多種疾病動(dòng)物模型上顯示出了抗炎、抗氧化、抑制腫瘤、保護(hù)肝臟等良好的藥理活性。瘤果黑種草子提取物能夠增強(qiáng)抗氧化酶活性，減少脂質(zhì)過(guò)氧化物產(chǎn)生，改善四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷，抑制艾氏腹水瘤小鼠肉瘤生長(zhǎng)[3-4]。在抗炎作用方面，瘤果黑種草子提取物能夠改善葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎癥狀，減輕腸道炎性細(xì)胞浸潤(rùn)[5]。其活性成分能夠降低濃氨水引咳小鼠的咳嗽次數(shù)，增強(qiáng)家兔氣管纖毛黏液流運(yùn)動(dòng)，抑制乙酰膽堿所致豚鼠平滑肌痙攣，降低慢阻塞肺病大鼠模型肺部組織炎性反應(yīng)程度，改善乙醇誘導(dǎo)急性肝損傷小鼠相關(guān)指標(biāo)水平，緩解佐劑誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎損傷、化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的小鼠耳廓腫脹[6-11]。以上動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，瘤果黑種草子在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性阻塞性肺病、支氣管痙攣、酒精性肝損傷等炎性反應(yīng)相關(guān)的疾病方面有潛在應(yīng)用。目前，研究者對(duì)瘤果黑種草子抗炎作用僅限于藥理活性的研究，缺乏對(duì)其抗炎作用機(jī)制的報(bào)道。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可利用化合物靶標(biāo)數(shù)據(jù)和疾病的人源性數(shù)據(jù)，針對(duì)中藥多組分多靶標(biāo)的性質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)性分析，從多角度闡述中藥能夠調(diào)控與涉及的靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而分析藥物的潛在作用機(jī)制。本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析方法，擬通過(guò)數(shù)據(jù)挖掘與分析整合，建立瘤果黑種草子化合物-靶標(biāo)作用網(wǎng)絡(luò)，對(duì)潛在靶標(biāo)的生物功能和信息調(diào)控通路進(jìn)行富集，分析瘤果黑種草子抗炎相關(guān)的基因、分子和信號(hào)通路。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)

使用Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.swisstargetprediction.ch/)、UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.uniprot.org./)、PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.drug-bank.ca/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.omim.org/)、GeneCard數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.genecards.org/)Cytoscape(3.7.0)軟件(http://cytoscapeweb.cytoscape.org/)、Venny2.1.0在線軟件(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)、聯(lián)川生物云平臺(tái)(https://www.omicstudio.cn/tool/)、Metascape基因注釋分析工具(https://metascape.org/)和STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(http://string-db.org/)等相關(guān)平臺(tái)和數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2 成分靶標(biāo)數(shù)據(jù)集和炎性反應(yīng)相關(guān)靶標(biāo)數(shù)據(jù)集建立

通過(guò)文獻(xiàn)檢索瘤果黑種草子化學(xué)成分，利用PubChem和ChemDraw獲得成分結(jié)構(gòu)sdf格式文件并借助Swiss Target Prediction預(yù)測(cè)化合物靶標(biāo)。分別以“rheumatoid arthritis (RA)”“inflammation”“alcoholic hepatitis”“chronic obstructive pulmonary disease (COPD)”等為關(guān)鍵詞在OMIM、Genecards、DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)檢索炎性反應(yīng)相關(guān)靶標(biāo)并通過(guò)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)規(guī)范靶標(biāo)的基因名。

利用在線韋恩圖繪制平臺(tái)Venny2.1.0(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)，繪制化合物和疾病靶標(biāo)韋恩圖，獲得二者共同靶標(biāo)并以此作為瘤果黑種草子抗炎作用的潛在靶標(biāo)。

1.3 成分-共同靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Cytoscape3.7.0構(gòu)建成分-共同靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)，以degree平均值為篩選條件，篩選排名靠前的成分。借助STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置combing score值為0.9，限定物種為Homo sapiens，分析共同靶標(biāo)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，以tsv格式保存文件。利用Cytoscape3.7.0中的Network Analysis工具分析互作網(wǎng)絡(luò)，篩選大于平均degree(度值)的靶標(biāo)作為重要靶標(biāo)。

1.4 GO生物功能富集分析與KEGG通路富集分析

為進(jìn)一步闡明上述重要靶標(biāo)蛋白的生物學(xué)功能和在信息調(diào)控中的作用，通過(guò)Metascape基因功能注釋分析工具，默認(rèn)P≤0.01，物種限定為Homo sapiens，選擇Custom Analysis分析，進(jìn)行GO生物功能和KEGG通路的富集分析。其中，GO生物功能分為細(xì)胞組成(cellular component，CC)、生物過(guò)程(biology process，BP)和分子功能(molecular function，MF)，使用聯(lián)川生物云平臺(tái)可視化富集結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 瘤果黑種草子活性分子的靶標(biāo)預(yù)測(cè)、炎性反應(yīng)相關(guān)靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)建立

經(jīng)文獻(xiàn)挖掘整理，檢索到60個(gè)潛在活性分子。借助Swiss Target Prediction預(yù)測(cè)靶標(biāo)，去除“probability”為0的靶標(biāo)，最終收集到57個(gè)活性分子的潛在靶標(biāo)信息，3個(gè)活性分子未收錄入該數(shù)據(jù)庫(kù)。將靶標(biāo)數(shù)據(jù)去重處理得到1 066條信息。通過(guò)多數(shù)據(jù)庫(kù)、多關(guān)鍵詞聯(lián)合檢索的方法，合并去重處理數(shù)據(jù)，共收集到1 938個(gè)炎性反應(yīng)相關(guān)疾病的靶標(biāo)信息。

經(jīng)在線韋恩圖軟件Venny2.1.0分析，活性分子和炎性反應(yīng)相關(guān)靶標(biāo)的共同靶標(biāo)有318個(gè)，這些共同靶標(biāo)可能是瘤果黑種草子發(fā)揮抗炎作用的潛在作用靶標(biāo)。如圖1所示，藍(lán)色component代表活性分子靶標(biāo)數(shù)量，黃色disease表示疾病靶標(biāo)數(shù)量。

圖1 活性成分-疾病交集韋恩圖Fig.1 Venn diagram of the activecomponent-disease intersection

2.2 重要靶標(biāo)的篩選

由String得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，圖2中有318個(gè)節(jié)點(diǎn)，1 777條邊，平均節(jié)點(diǎn)度11.2，平均局部聚類系數(shù)為0.538。邊的粗細(xì)表示蛋白間作用的強(qiáng)弱。通過(guò)平均度值篩選出101個(gè)重要靶標(biāo)。在網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點(diǎn)(Node)表示靶標(biāo)，節(jié)點(diǎn)之間的連線(Edge)代表靶標(biāo)間的相互作用。某一節(jié)點(diǎn)的degree值(度值)定義為網(wǎng)絡(luò)中該節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)連線的數(shù)目，度值大小反映了節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中貢獻(xiàn)度大小。通過(guò)度值篩選出排名前10的關(guān)鍵靶標(biāo)，PIK3CA、STAT3、PIK3R1、APP、MAPK1、MAPK3、AKT1、SRC、CXCR4、TP53，提示這些靶標(biāo)可能在瘤果黑種草子抗炎作用中起重要作用。

圖2 共同靶標(biāo)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Interaction network of common target proteins

2.3 活性分子-共同靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析

借助Cytoscape3.7.0構(gòu)建活性分子-共同靶標(biāo)的可視化網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)中含有375個(gè)點(diǎn)，2 440條邊。平均每個(gè)活性分子對(duì)應(yīng)42.80(2 440/57)個(gè)靶標(biāo)，每個(gè)靶標(biāo)平均連接7.67個(gè)活性分子(2 440/318)，由此推斷，瘤果黑種草子的抗炎作用可能同時(shí)涉及一個(gè)活性分子對(duì)應(yīng)多個(gè)靶標(biāo)和一個(gè)靶標(biāo)受多個(gè)活性分子干預(yù)的情況，體現(xiàn)了中藥多組分、多靶標(biāo)的藥理作用特性。圖中黃色箭頭形狀代表共同靶標(biāo)，粉色圓形代表活性分子。靶標(biāo)圖形越大，表明其度值越大，提示其可能是網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)(圖3)。

圖3 活性分子-靶標(biāo)互作網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Active compound-target intersection network

2.4 GO生物功能富集注釋

采用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)瘤果黑種草子的101個(gè)重要靶標(biāo)進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)富集分析2 354條，其中細(xì)胞組分(cellular component，CC)111條、分子功能(molecular function，MF)139條、生物過(guò)程(biological process，BP)2 104條。如表1，圖4所示，瘤果黑種草子抗炎作用的潛在靶標(biāo)主要存在于胞膜和蛋白質(zhì)復(fù)合物。如表2，圖5所示，分子功能富集結(jié)果提示，潛在靶標(biāo)的分子功能主要有G蛋白偶聯(lián)的胺受體活性(G protein-coupled amine receptor activity)、G蛋白偶聯(lián)神經(jīng)遞質(zhì)受體活性(G protein-coupled neurotransmitter receptor activity)、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性(neurotransmitter receptor activity)、血清素受體活性(serotonin receptor activity)等。如表3，圖6所示，生物過(guò)程主要涉及機(jī)體對(duì)傷口的反應(yīng)(response to wounding)、激酶活性的正調(diào)控(positive regulation of kinase activity)、轉(zhuǎn)移酶活性的正調(diào)控(positive regulation of transferase activity)、MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)的正調(diào)控(positive regulation of MAPK cascade)和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的正調(diào)控(positive regulation of locomotion)等。

表1 GO 細(xì)胞組分富集分析Table 1 GO cell component enrichment analysis

表3 GO生物過(guò)程富集分析Table 3 GO biological process enrichment analysis

2.5 KEGG通路富集注釋

對(duì)瘤果黑種草子抗炎重要靶標(biāo)進(jìn)行全基因組及代謝途徑(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集分析，獲得165條通路。如表4,圖7所示，按照-LogP排序，排名靠前的有癌癥通路(pathways in cancer)、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染(kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)、人類巨細(xì)胞病毒感染(human cytomegalovirus infection)、乙型肝炎(Hepatitis B)、癌癥中的多糖(proteoglycans in cancer)等通路。其中Th17細(xì)胞分化通路(Th17 cell differentiation)與自身免疫疾病密切相關(guān)，-LogP值為28.02。

圖4 GO 細(xì)胞組分富集分析Fig.4 GO cell component enrichment analysis

圖5 GO 分子功能富集分析Fig.5 GO molecular function enrichment analysis

3 討論

現(xiàn)代中藥技術(shù)對(duì)瘤果黑種草子的研究覆蓋了較多的研究領(lǐng)域，提示該藥具有抗氧化、抗病毒、抗感染、腫瘤抑制和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性。瘤果黑種草子提取物可緩解LPS，木瓜蛋白酶所致大鼠COPD模型中的炎性細(xì)胞趨化、炎性因子水平升高，同時(shí)對(duì)急性酒精性肝損傷所致小鼠血液轉(zhuǎn)氨酶水平升高、肝小葉結(jié)構(gòu)破壞、肝細(xì)胞壞死也有保護(hù)作用[7,9]。其總黃酮提取物具有抗炎，鎮(zhèn)咳作用，可以抑制大鼠棉球肉芽腫，延長(zhǎng)噴霧致小鼠哮喘的反應(yīng)潛伏期，抑制豚鼠離體肺支氣管灌流實(shí)驗(yàn)和離體回腸實(shí)驗(yàn)中工具藥物所致的平滑肌痙攣[12-13]。其總皂苷提取物能夠抑制二甲苯所致的小鼠耳廓腫脹及角叉菜膠所致的足趾腫脹[14]，減少冰醋酸所致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的增高，并對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎的繼發(fā)性損害及膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎損傷有明顯的抑制作用[6]。上述研究顯示，瘤果黑種草子的有效成分具有良好的抗炎作用，本文結(jié)合中醫(yī)藥的“整體觀念”理論，分析瘤果黑種草子發(fā)揮多效抗炎作用的疾病靶標(biāo)。上述研究顯示，瘤果黑種草子的有效成分具有良好的抗炎作用，本文結(jié)合中醫(yī)藥的“整體觀念”理論，分析瘤果黑種草子發(fā)揮多效抗炎作用的疾病靶標(biāo)瘤果黑種草子用于治療風(fēng)濕病所致的關(guān)節(jié)痛，緩解關(guān)節(jié)滑膜的慢性炎性反應(yīng)。在這類疾病中，Th17被認(rèn)為是驅(qū)動(dòng)疾病發(fā)展的關(guān)鍵因素[15]。Th17細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子IL-17和IL-21，協(xié)同放大其他細(xì)胞因子的致炎作用，激活滑膜成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，促進(jìn)分泌更多炎性物質(zhì)，從而作用于多種胞內(nèi)通路發(fā)揮促進(jìn)破骨細(xì)胞分化、促進(jìn)骨基質(zhì)降解、抑制骨生成等作用，加劇關(guān)節(jié)炎性反應(yīng)[16]。本研究的重要靶標(biāo)篩選和基因通路富集結(jié)果顯示，與Th17細(xì)胞分化通路(Th17 cell differentiation)相關(guān)的基因有IL-6、IL-2、STAT3、STAT6、JAK1、JAK2、JAK3、JUN、MAPK1、MAPK等。Th17細(xì)胞的分化需要促炎因子和核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的參與，在IL-6和TGF-β協(xié)同作用下，被持續(xù)激活的STAT3可解除由Foxp3介導(dǎo)的維甲酸相關(guān)孤兒受體(RORγt)的表達(dá)抑制作用[17]。STAT3直接作用于IL-21前體，促進(jìn)其產(chǎn)生。IL-21通過(guò)STAT3依賴的途徑，誘導(dǎo)Th17細(xì)胞中RORγt表達(dá)增加和IL-17分泌[18]。由此可知，瘤果黑種草子極有可能通過(guò)作用于IL-6、SATA3等靶標(biāo)減少Th17細(xì)胞產(chǎn)生IL-21和IL-17的炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而發(fā)揮改善風(fēng)濕病中關(guān)節(jié)炎性反應(yīng)及繼發(fā)性骨損傷的作用。

圖6 GO 生物過(guò)程富集分析Fig.6 GO biological process enrichment analysis

表4 KEGG通路富集分析Table 4 KEGG pathway enrichment analysis

圖7 KEGG通路富集分析Fig.7 KEGG pathway enrichment analysis

COPD是持續(xù)性的氣道炎性反應(yīng)所造成的進(jìn)行性不可逆的氣道阻塞[19-20]。COPD患者中Th17相關(guān)細(xì)胞因子IL-17A、IL-22和IL-23的表達(dá)增加[21]。IL-17A不僅參與中性粒細(xì)胞募集過(guò)程，還誘導(dǎo)肺實(shí)質(zhì)中巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子和趨化因子[22]。基于通路富集的結(jié)果，瘤果黑種草子可能通過(guò)影響Th17細(xì)胞的分化，進(jìn)而影響IL-17A的分泌，在COPD的發(fā)展進(jìn)程中起到抗炎治療作用。

在富集的重要靶標(biāo)中，CXCR是趨化因子受體，誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的定向遷移、活化與發(fā)育，有研究顯示在CXCR3配體誘導(dǎo)下COPD患者單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的趨化性增加，這可能與COPD中CXCR3表達(dá)的增加相關(guān)[23]。COPD病理特征是嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，因此由趨化因子/受體作用的細(xì)胞遷移至炎性反應(yīng)區(qū)域也是導(dǎo)致炎性反應(yīng)的機(jī)制之一。本文預(yù)測(cè)，瘤果黑種草子與CXCR的靶標(biāo)關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)，提示瘤果黑種草子經(jīng)由趨化因子受體途徑減少細(xì)胞炎性遷移的作用也可能是其發(fā)揮抗炎作用的機(jī)制之一。

除此之外，從生物過(guò)程富集分析和通路富集結(jié)果來(lái)看，瘤果黑種草子的發(fā)揮抗炎作用的核心通路還很多，主要體現(xiàn)在抵抗外來(lái)微生物的反應(yīng)、抗病毒、調(diào)控激酶激活通路以及應(yīng)對(duì)傷口反應(yīng)等多個(gè)方面。

綜上所述，本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的思路分析了瘤果黑種草子抗炎治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、COPD等疾病的機(jī)制，構(gòu)建了瘤果黑種草子活性分子-潛在靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)，找到了IL-6、STAT3等關(guān)鍵基因及Th17、CXCR通路，為深入研究瘤果黑種草子發(fā)揮藥理作用的新通路和新調(diào)控基因提供了依據(jù)。因該藥物至今缺乏代謝產(chǎn)物的研究信息，故本文在有效物質(zhì)基礎(chǔ)的分析方面有一定的局限性；此外，本文分析得到的重要靶標(biāo)及關(guān)鍵信號(hào)通路有待進(jìn)一步的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。