劉 柳 張鳳玉 張 靜 張 浩

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院病原生物實驗室，齊齊哈爾 161006)

華支睪吸蟲(Clonorchissinensis)是我國重要的食源性寄生蟲之一，在我國分布廣泛。黑龍江省位于中國東北部，有黑龍江、松花江、烏蘇里江流經(jīng)，河流湖泊眾多，是我國華支睪吸蟲病的重要流行區(qū)[1]。黑龍江本地曾有多起肝吸蟲病暴發(fā)的記錄，感染病例屢見不鮮[2]。華支睪吸蟲自然感染的宿主較多，除人以外，食魚的鳥類、貓、狗感染較為普遍[3-4]。以往文獻(xiàn)中記載構(gòu)建動物模型常用兔、犬、貓、貍、大鼠等[5]，小鼠作為華支睪吸蟲感染的動物模型在國內(nèi)報道較少[6]，小鼠體內(nèi)與人體中自然感染的華支睪吸蟲的對比尚未見報道。本實驗室前期使用昆明小鼠成功構(gòu)建了動物模型，為驗證所獲蟲體在小鼠體內(nèi)發(fā)育程度，我們將小鼠感染所獲成蟲標(biāo)本與本實驗室歷年收集的人體感染成蟲標(biāo)本加以比較，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1臨床標(biāo)本：來自附屬醫(yī)院肝吸蟲患者手術(shù)及膽汁引流物中的送檢蟲體，經(jīng)鑒定為華支睪吸蟲的標(biāo)本18只。

1.1.2實驗動物：健康清潔級昆明小鼠 8只，6～8周齡，體質(zhì)量20～30 g，SPF 級環(huán)境喂養(yǎng)，實驗動物由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會批準(zhǔn)(倫理批準(zhǔn)號QMUAECC-2021-100)，并按照齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會批準(zhǔn)方案執(zhí)行。

1.1.3主要儀器與試劑：OLYMPUS CX31RBSF光學(xué)顯微鏡(Olympus公司)；Leica光學(xué)顯微鏡、Leica體視顯微鏡(Leica公司)；HH-BLL-500型恒溫箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；80目標(biāo)準(zhǔn)檢驗篩(浙江上虞市華豐五金儀器有限公司)。胃蛋白酶(北京中生瑞泰科技有限公司)，醋酸洋紅染液(Coolaber公司)。

1.2 方法

1.2.1囊蚴的采集與分離：選取陽性麥穗魚 Pseudorasbora parva，剪碎并采用人工消化法消化12 h[7]。過篩除渣后用清水洗滌并多次沉淀，直至上清液澄清。在體視顯微鏡下將華支睪吸蟲囊蚴匯聚到一起，并用小吸管吸出后保存在阿氏液(檸檬酸0.5 g、檸檬酸鈉8.0 g、葡萄糖20.5 g、氯化鈉4.2 g，加水溶解并稀釋至1 000 mL)中[7]置于4 ℃冰箱備用。

1.2.2動物感染：選取8只KM小鼠，抓住小鼠頭部及其后背皮膚，使其頭、頸和身體呈直線。灌胃針頭從小鼠的嘴角進(jìn)入，壓住舌頭，抵住上顎，輕輕向內(nèi)推進(jìn)，進(jìn)入食道后將存有囊蚴的阿氏液注射至胃，每只灌胃感染35～40只囊蚴。

1.2.3蟲體采集：灌胃感染3周后，隔天收集一次小鼠糞便，采用水洗沉淀法進(jìn)行檢查，直至在糞便沉淀物中發(fā)現(xiàn)蟲卵。采用脫頸法處死小鼠，分離、取出肝膽管和肝臟。剪開膽管，切開肝葉，雙手?jǐn)D壓使蟲體由肝膽管流出。將擠壓出的蟲體連同肝組織放在盛有0.9%氯化鈉溶液的培養(yǎng)皿內(nèi)，沉淀2 h后收集沉積于皿底的蟲體。

1.2.4標(biāo)本制備：獲得的蟲體由10%甲醛溶液進(jìn)行壓片固定，待蟲體形態(tài)穩(wěn)定后，將其保存在10%甲醛溶液中，固定24 h以上。固定后的蟲體用流水沖洗過夜，洗去其表面固定液。使用醋酸洋紅染 液染色8 h后進(jìn)行鹽酸乙醇分色、梯度乙醇脫水、透明、封片等步驟[8]。

1.2.5觀察測量：將制備的人體與小鼠內(nèi)的華支睪吸蟲標(biāo)本在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察測量。觀測指標(biāo)包括：蟲體大??；口、腹吸盤直徑；生殖、消化、排泄系統(tǒng)以及蟲卵大小等。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

實驗的8只小鼠均感染成功，感染至第15天時小鼠開始出現(xiàn)精神萎靡，腹部逐漸隆起；感染至第23天時在小鼠糞便中檢出蟲卵。剖殺后在小鼠肝膽管獲取成蟲，所獲得的蟲體呈扁平狀，顏色為乳白色半透明，前端狹窄而尖銳，后端較闊而頓。體前端具有口吸盤，體末端具有排泄孔，體中部可見清晰的腹吸盤、子宮、睪丸等內(nèi)部器官。將蟲體固定并進(jìn)行醋酸洋紅染色后，觀察發(fā)現(xiàn)其各項特征均與文獻(xiàn)中記載的華支睪吸蟲[9]相符。將其與來自臨床的標(biāo)本觀察比較，結(jié)果如下。

2.1 形態(tài)比較

2.1.1外部形態(tài)比較：華支睪吸蟲成蟲期體形狹長，背腹扁平，前端稍窄，后端鈍圓，形態(tài)似葵花子，體表無棘。人體內(nèi)獲得的華支睪吸蟲較為圓頓(圖1A)，而小鼠體內(nèi)獲得的華支睪吸蟲較為狹長(圖1B)?？谖P位于體前側(cè)，腹吸盤位于體前約1/4處，口吸盤略大于腹吸盤。

注：A.人體內(nèi)華支睪吸蟲成蟲(×10)；B.小鼠華支睪吸蟲成蟲(×10)Note: A.Adult Clonorchis sinensis in humans (×10)B.Adult Clonorchis sinensis in mice (×10)圖1 華支睪吸蟲成蟲對比圖Fig.1 Comparison of Clonorchis sinensis

2.1.2生殖系統(tǒng)：雌雄同體，生殖器官發(fā)達(dá)。睪丸2個呈多分支狀，前后排列于華支睪吸蟲體后部，其長度約占蟲體總長度的1/ 4；兩睪丸各有一條輸精管引出前行，兩條輸精管匯合成儲精囊；受精囊位于睪丸前端，呈不規(guī)則橢圓形，受精囊上有一條彎曲的勞氏管；卵巢分3葉，位于睪丸與受精囊前側(cè)(圖2A～B)。卵巢引出輸卵管，通向卵膜及迂回子宮；子宮長而彎曲上至腹吸盤前，通于雌性生殖孔，開口于腹吸盤前側(cè)，通于雌性生殖孔；卵黃腺分布于蟲體兩側(cè)，可見其中充滿卵黃細(xì)胞。

2.1.3消化系統(tǒng)：口位于口吸盤中央，由口入為短而圓的咽，咽后通到短細(xì)的食道，食道后分為兩只腸管。兩只腸管延長到體后端，末端為封閉的盲管，不匯合，位于排泄囊兩側(cè)(圖2C～D)。

2.1.4排泄系統(tǒng)：排泄孔開口于蟲體末端，其上端為排泄囊，呈長管狀(圖2C～D)，排泄物可從其排出體外。

2.1.5蟲卵：蟲卵充盈在子宮內(nèi)部，呈卵圓形。上端稍窄且有卵蓋，稍隆起，蓋周圍卵殼增厚形成肩峰，卵后端大而圓，有一似結(jié)節(jié)狀突起(圖2E～F，圖3)。

注：A.人體內(nèi)華支睪吸蟲卵巢、受精囊(×50);B.小鼠內(nèi)華支睪吸蟲卵巢、受精囊(×50) ;C.人體內(nèi)華支睪吸蟲排泄囊、排泄孔、腸支末端(×50);D.小鼠內(nèi)華支睪吸蟲排泄囊、排泄孔、腸支末端(×50);E.人體內(nèi)華支睪吸蟲子宮內(nèi)蟲卵(×100);F.小鼠內(nèi)華支睪吸蟲子宮內(nèi)蟲卵(×100)Note: A.C.sinensis ovaries and fertilization vesicles in humans (×50);B.mouse C.sinensis ovaries and fertilization vesicles (×50);C.C.sinensis excretory sacs, excretory holes, and end of intestinalbranches in humans (×50)；D.mouse C.sinensis excretory sac,excretory hole, end of intestinal branch(×50); E.C.sinensisendometrium eggs in human (×100);F.mouse C.sinensis endometrium eggs (×100)圖2 華支睪吸蟲內(nèi)部結(jié)構(gòu)Fig.2 Internal structure of Clonorchis sinensis

圖3 華支睪吸蟲子宮內(nèi)蟲卵(×400)Fig.3 Clonorchis sinensis endometrium eggs (×400)

2.2 測量比較

將華支睪吸蟲壓片至最薄最長狀態(tài)后進(jìn)行測量，寄生于人體內(nèi)的華支睪吸蟲成蟲長為(21.57±5.68)mm，寄生于小鼠體內(nèi)的華支睪吸蟲成蟲長為(10.22±1.57)mm，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=25.058，P<0.05)，未壓片前的華支睪吸蟲處于蟲體緊縮狀態(tài)，由于各個蟲體的蜷縮程度不同，不利于數(shù)據(jù)的測量統(tǒng)計，也不利于染色與內(nèi)部結(jié)構(gòu)的觀察，所以將蟲體進(jìn)行壓片后進(jìn)行數(shù)據(jù)測量。(請討論壓片固定對蟲體大小的影響)；寄生于人體內(nèi)的華支睪吸蟲寬為(6.29±1.04)mm，寄生于小鼠體內(nèi)的華支睪吸蟲寬為(3.25±0.14)mm，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=14.058，P<0.05)。根據(jù)數(shù)據(jù)測量結(jié)果(表1)以及SPSS22.0統(tǒng)計軟件分析可知，人體及小鼠內(nèi)寄生的華支睪吸蟲大小、口吸盤、腹吸盤、咽、子宮、卵巢、受精囊、睪丸以及蟲卵的P值均小于0.05，即可認(rèn)為人體內(nèi)和小鼠體內(nèi)寄生的華支睪吸蟲形態(tài)存在明顯差異。

表1 人體內(nèi)和小鼠內(nèi)寄生華支睪吸蟲各部位數(shù)據(jù)比較Table 1 Comparison of data on parasitic of Clonorchissinensis in humans and

3 討論

肝吸蟲病在我國大部分省份都有發(fā)生和流行[10]，人體作為華支睪吸蟲終宿主感染較為普遍。以往研究中小鼠作為實驗動物相關(guān)報道較少。小鼠價格低廉，方便飼養(yǎng)，對外部環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，本實驗通過探究華支睪吸蟲在其體內(nèi)發(fā)育的成熟度，來驗證小鼠是否適合作為華支睪吸蟲的終宿主，對之后華支睪吸蟲動物感染模型的建立具有重要意義。

在本次實驗研究中，KM小鼠感染至23 d即可在糞便中查到蟲卵，與參考文獻(xiàn)[11]報道小鼠的糞便查出蟲卵時間為25 d相近，也與國外報道[12]小鼠感染過程查出糞便時間為17～30 d基本一致。在實驗過程中觀察到，自然狀態(tài)下華支睪吸蟲較壓完片后的蟲體大小存在明顯差異。因此在制作華支睪吸蟲標(biāo)本的過程中，用蓋玻片輕輕擠壓使標(biāo)本達(dá)到最薄最長狀態(tài):其一是為了減少壓片固定對蟲體大小的影響，其二是方便觀察蟲體的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。分析人體及小鼠體內(nèi)獲得的華支睪吸蟲外部形態(tài)觀察到內(nèi)部結(jié)構(gòu)的測量結(jié)果，兩者外部與內(nèi)部的形態(tài)以及蟲卵外觀基本無差異，與參考文獻(xiàn)[13]的研究結(jié)果相仿，但兩者的各結(jié)構(gòu)測量數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計學(xué)差異。其數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果顯示，寄生于小鼠體內(nèi)華支睪吸蟲外部與內(nèi)部結(jié)構(gòu)的測量數(shù)據(jù)均小于寄生于人體內(nèi)的華支睪吸蟲，這與參考文獻(xiàn)[14]描述的動物源的成蟲一般都小于人體中寄生的成蟲的觀點較為統(tǒng)一。有研究結(jié)果顯示[15-16]，隨著小鼠感染時間的延長，蟲體各部位的長和寬是逐漸增大的，那么繼續(xù)延長感染時間，小鼠體內(nèi)獲得的蟲體是否會繼續(xù)增大，人工感染得到的華支睪吸蟲子宮內(nèi)蟲卵是否也具有像人體中獲得的華支睪吸蟲蟲卵有感染性，值得我們進(jìn)一步探究。這將作為下一步研究的工作重點。