吳 娜 肖福川 張銘昊 陳柏安1,,3 盧 靜1,,3

(1.首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物部，北京 100069)(2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗動物學(xué)學(xué)系，北京 100069) (3. 首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)再生修復(fù)研究北京市重點實驗室，北京 100069)

實驗中常用的嚙齒類動物屬于群居動物，它們之間需要正常的社會接觸，長期隔離飼養(yǎng)容易產(chǎn)生異常的行為和生理特征。社會隔離是社會型生物隔離于其他同類或社會群體，無法達成社交需求的情形狀況。有研究表明，社會隔離會導(dǎo)致成年雄性C57BL/6小鼠攻擊性增強[1]，導(dǎo)致昆明小鼠和BALB/c小鼠的認知缺陷和攻擊性增加，與昆明小鼠相比，BALB/c小鼠在相同年齡和隔離時間時表現(xiàn)出較弱的空間/非空間記憶和較低的攻擊性[2]。有研究認為社會隔離會導(dǎo)致小鼠身體活動減少[3]，相反，也有研究認為小鼠社會隔離增加了多動癥和探索行為[4]。隔離飼養(yǎng)的大鼠在新環(huán)境中表現(xiàn)出多動癥[5]，攻擊行為增加[6]，也有報道稱，與群居飼養(yǎng)的大鼠相比，隔離飼養(yǎng)的大鼠變得不那么活躍，產(chǎn)生抑郁樣行為[7-8]。綜上所述，嚙齒類動物在成長過程中，如果長期處于被隔離或孤立狀態(tài)，就會在認知、情緒、行為等方面的發(fā)展上產(chǎn)生明顯的障礙。但由于研究需要，部分實驗需將動物單獨飼養(yǎng)，致使其社會隔離。然而社會隔離實驗結(jié)果各異，隔離養(yǎng)育引起的社會認知功能改變是矛盾的。我們認為可能與實驗中使用的實驗動物的品種、品系、性別及隔離時間不同有關(guān)。本研究選擇C57BL/6小鼠作為研究對象，因其是實驗中最常用的小鼠品系，并且大多基因編輯小鼠都是C57BL/6基因背景來源。本研究旨在綜合檢測和評價社會隔離對C57BL/6小鼠日?；顒訄?zhí)行能力、學(xué)習(xí)記憶能力、自主運動能力和探究行為的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物與分組：SPF級2月齡 C57BL/6小鼠60只，雌雄各半，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，實驗動物許可證號【SCXK(京) 2019-0008】。實驗期間動物在首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物部屏障環(huán)境【SYXK(京) 2015-0012】飼養(yǎng)，經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會審查，倫理審批號：AEEI-2015-020 。將 60只小鼠隨機分為2組，每組30只，雌雄各半，對照組群居(5只/籠)飼養(yǎng)，隔離組單籠(1只/籠)飼養(yǎng)。

1.1.2試劑與儀器：壓縮紙片規(guī)格為 7.5 cm×8 cm，3 g/片，由中生北動(北京)科技發(fā)展有限公司定制。Morris水迷宮由正圓柱體水池、可以改變位置調(diào)整高度的透明水下隱蔽平臺、具有追蹤軌跡功能的計算機實時監(jiān)測分析系統(tǒng)labmaze組成，水池參數(shù)為：直徑122 cm；高51 cm；平臺直徑5 cm，水池壁顏色為深灰色，圓形隱蔽平臺為透明材料制成。曠場設(shè)備由頂部開放的實驗箱和追蹤軌跡功能的計算機實時監(jiān)測分析系統(tǒng)supermaze組成，實驗箱是灰色有機玻璃制作的 40 cm×40 cm×40 cm的深灰色無蓋箱體，底面9等分，在其正上方1.5 m處安放燈泡照明，使觀察箱中心光照強度為400 lx。

1.2 方法

1.2.1筑巢實驗：隔離組小鼠單籠飼養(yǎng)8周后，每個籠子里放一個3 g 的方形壓縮棉片；對照組同齡群居小鼠暫時分開，單籠飼養(yǎng)，每個籠子里也放一個3 g 的方形壓縮棉片。48 h后，稱量所有未使用的壓縮棉片質(zhì)量，精確到 0.1 g，對照組小鼠恢復(fù)群居飼養(yǎng)。用筑巢五分評級量表評估筑巢情況，筑巢實驗可用來評估實驗動物的日常活動執(zhí)行能力[9-10]。

1.2.2Morris水迷宮實驗：水池被N,E,S,W 4個等分點劃分為：東北NE、東南SE、西北NW和西南SW 4個象限。對應(yīng)N,E,S,W 4個點同一高度分別粘貼黑色三角形、正方形、圓形、五角星，在SE象限安裝水下隱蔽平臺，水池蓄水至沒過平臺1 cm，使用無毒食用漂白劑將水染成不透明白色液體，混合均勻且穩(wěn)定后確保平臺不可見。在NW象線池壁上標(biāo)記一位置，與隱蔽平臺圓心與水池圓心在同一直線上，此位置為實驗小鼠入水點。將小鼠頭朝池壁放入水中，訓(xùn)練時間90 s，記錄動物找到水下平臺的時間，如果90 s內(nèi)小鼠未爬上隱蔽平臺，視其潛伏期為90 s，在90 s后停止圖像采集，將小鼠引導(dǎo)至隱蔽平臺上20 s進行學(xué)習(xí)記憶。每只動物連續(xù)訓(xùn)練5 d，第6天將平臺撤除，開始60 s的探查實驗，記錄動物穿過平臺次數(shù)、進入目標(biāo)象限次數(shù)、在目標(biāo)象限停留時間和游泳距離等作為空間記憶的檢測指標(biāo)。Morris水迷宮實驗廣泛運用于認知功能障礙及神經(jīng)退行性疾病(如阿爾茨海默病、帕金森病、精神分裂癥等)行為學(xué)研究中，被學(xué)界廣泛認可和應(yīng)用，可以綜合評價小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力[11]。

1.2.3曠場實驗：設(shè)定相關(guān)參數(shù)和記錄時間(5 min)，實驗在安靜的環(huán)境下進行，將小鼠放置在中央格，同時進行攝像和計時，5 min后自動停止攝像。計算機自動記錄運動總距離、平均速度、中央格停留時間和穿格次數(shù)等指標(biāo)。每只動物實驗結(jié)束后，清除實驗箱內(nèi)動物的大小便，用75%乙醇擦洗箱底和四壁，以清除氣味。曠場行為實驗可用來評估實驗動物的自主運動能力和探究行為[12]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 社會隔離對小鼠日?；顒訄?zhí)行能力的影響

筑巢結(jié)果顯示，對照組群居飼養(yǎng)的C57BL/6小鼠大多數(shù)可以撕碎70%以上棉片，巢穴比較完整(圖1A)，社會隔離8周的C57BL/6小鼠大多數(shù)可以撕碎50%～70%棉片，巢穴不完整(圖1B)。社會隔離8周的C57BL/6小鼠筑巢得分(2.83±1.01)顯著低于對照組群居飼養(yǎng)的C57BL/6小鼠(3.82±1.13)(圖1C，P<0.01)，說明社會隔離導(dǎo)致C57BL/6小鼠日常活動執(zhí)行能力下降。

注：A：對照組典型圖；B：隔離組典型圖；C：筑巢得分，*P<0.01Note：A: Typical diagram of control group; B: Typical diagram ofisolation group;C: Nesting score，*P<0.01圖1 筑巢實驗結(jié)果Fig.1 Nesting experiment results

2.2 社會隔離對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

Morris水迷宮結(jié)果顯示：在定位航行訓(xùn)練階段，隨訓(xùn)練時間的延長，對照組尋找站臺的潛伏期逐漸縮短，隔離組前兩天增加，之后逐漸縮短，兩組動物間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖2A)。在探索測試和記憶保留測試階段，與未隔離組(2.00±1.97)相比，隔離組(0.93±2.07)穿過平臺所在區(qū)域次數(shù)較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖2B，P<0.05)。進入目標(biāo)象限次數(shù)隔離組(2.10±2.71)較未隔離組(5.27±2.96)更少，差異極有統(tǒng)計學(xué)意義(圖2C，P<0.01)。目標(biāo)象限停留時間百分比隔離組(14.29±18.31)較未隔離組(27.95±17.14)更低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖2D，P<0.01)。目標(biāo)象限游泳距離百分比隔離組(16.05±15.79)較未隔離組(29.55±15.66)更低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖2E，P<0.01)。兩組典型軌跡圖顯示，對照組穿過平臺所在區(qū)域次數(shù)較多，表現(xiàn)出多次尋找平臺，相對的社會隔離組小鼠穿過平臺所在區(qū)域次數(shù)較少，學(xué)習(xí)記憶效果較差(圖2F)。

注：A：潛伏期；B：穿過平臺所在區(qū)域次數(shù)；C：進入目標(biāo)象限次數(shù)；D：目標(biāo)象限停留時間百分比；E：目標(biāo)象限游泳距離百分比；*P<0.05，**P<0.01;F：典型軌跡圖Note:A: Incubation period; B: Times of passing through the area where the platform is located; C: Number of times to enter the target quadrant; D: Percentage of residence time in target quadrant; E: Percentage of swimming distance in target quadrant;*P<0.05,**P<0.01;F: Typical trajectory diagram圖2 Morris水迷宮實驗結(jié)果Fig.2 Morris water maze results

2.3 社會隔離對小鼠自主運動能力和探究行為的影響

曠場結(jié)果顯示，隔離組小鼠的運動總路程(26 030±4 629)與對照組(21 575±4 475)相比增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3A，P<0.01)。隔離組小鼠的平均運動速度(86.82±15.39)與對照組(74.10±14.89)相比增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3B，P<0.01)。隔離組小鼠的穿格總次數(shù)(108.03±25.14)與對照組(86.33±25.63)相比增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3C，P<0.01)。隔離組小鼠的靜止時間(17.68±7.62)與對照組(25.5±15.54)相比減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3D，P<0.05)。隔離組小鼠在中央?yún)^(qū)域停留時間(9.57±6.38)與對照組(10.31±6.37)相比，無統(tǒng)計學(xué)差異(圖3E)。隔離組小鼠的典型運動軌跡圖與對照組相比更復(fù)雜，運動距離更遠(圖3F)。

注：A：總路程；B：平均速度；C：穿格總次數(shù)；D：靜止時間；E：中間區(qū)域停留時間，*P<0.05，**P<0.01；F：典型運動軌跡Note:A：Total distance；B：Average speed；C：Number of transitions；D：Rest time；E：Intermediate area residence time，*P<0.05，**P<0.01；F：Typical trajectory圖3 曠場實驗結(jié)果Fig.3 the open field test

3 討論

實驗用嚙齒類動物是社會性物種，社會互動和組織與生存和繁殖成功密切相關(guān)。社會隔離作為一種慢性應(yīng)激，可以使其產(chǎn)生心理、精神異常。有研究表明，青春期的社會隔離會導(dǎo)致持續(xù)的缺陷，包括情緒和認知失調(diào)，斷奶后的小鼠社會隔離會導(dǎo)致注意力減少、社會聯(lián)系行為受損和條件性恐懼記憶受損[3]；斷奶后單獨飼養(yǎng)8周的小鼠，即使再社會化后，也表現(xiàn)出社會認知缺陷[13]。斷奶后的社會隔離還可以導(dǎo)致長期恐懼記憶的遺忘，這是由于EphB2介導(dǎo)的海馬CA1區(qū)突觸功能下調(diào)引起的[14]。從青春期到成年早期(產(chǎn)后28～70 d)的小鼠，6周的社會隔離后雌性小鼠在高架迷宮實驗中產(chǎn)生了一種抗焦慮表型，在其他關(guān)于回避行為或恐懼條件反射等實驗中沒有影響[15]。有研究表明，隔離飼養(yǎng)的小鼠在曠場行為實驗中表現(xiàn)出多動癥[16]，青春期Wistar雄性大鼠和年輕的成年大鼠在曠場行為實驗中的運動能力也增強[5]。也有研究表明，早期社會隔離降低了雌性ICR小鼠的運動性[17]。通過各種行為測試，大量研究調(diào)查了社會隔離飼養(yǎng)對實驗室嚙齒動物學(xué)習(xí)和記憶能力的影響。大多數(shù)研究表明，社會隔離飼養(yǎng)會損害嚙齒類動物學(xué)習(xí)和記憶，產(chǎn)生社會認知缺陷，然而，證據(jù)并不一致。我們認為這可能是因為社會隔離期、動物的物種/種類、性別和發(fā)育階段以及所使用的行為任務(wù)的不同導(dǎo)致的。

本研究通過筑巢實驗、Morris水迷宮實驗和曠場實驗，對C57BL/6小鼠日?；顒訄?zhí)行能力、空間學(xué)習(xí)記憶能力和在陌生環(huán)境中的自主行為與探究行為進行了測試。在筑巢實驗中，社會隔離8周的C57BL/6小鼠筑巢得分顯著低于群居飼養(yǎng)的C57BL/6小鼠，說明社會隔離導(dǎo)致C57BL/6小鼠日常活動執(zhí)行能力下降。在Morris水迷宮實驗中，本研究發(fā)現(xiàn)隨訓(xùn)練時間的延長，對照組C57BL/6小鼠尋找站臺的潛伏期逐漸縮短，隔離組C57BL/6小鼠前兩天增加，之后逐漸縮短，兩組動物間有顯著差異。與對照組相比，隔離組穿過平臺所在區(qū)域次數(shù)和進入目標(biāo)象限次數(shù)更少，目標(biāo)象限停留時間和游泳距離更短，說明社會隔離導(dǎo)致C57BL/6小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降。在曠場實驗中，與對照組相比，隔離組C57BL/6小鼠的運動總路程、平均速度和穿格總次數(shù)增加，靜止時間減少，該結(jié)果表明，社會隔離增加了C57BL/6小鼠的自主運動能力和探究行為，可能是因為社會隔離增強了C57BL/6小鼠的焦慮行為。

本研究結(jié)果表明，8周齡成年小鼠社會隔離飼養(yǎng)8周會導(dǎo)致日?；顒訄?zhí)行能力和空間學(xué)習(xí)記憶能力下降，對陌生環(huán)境中的自主行為與探究行為增強，與對照組相比，均有統(tǒng)計學(xué)差異。本研究結(jié)果提示，如果實驗中需要使用C57BL/6小鼠進行筑巢、Morris水迷宮或曠場實驗，那么C57BL/6小鼠不適合單籠飼養(yǎng)。單籠飼養(yǎng)C57BL/6小鼠會造成其社會隔離，導(dǎo)致C57BL/6小鼠日?；顒訄?zhí)行能力、空間學(xué)習(xí)記憶和探究行為的變化，影響實驗結(jié)果，建議5只左右社會群居飼養(yǎng)。