黃 健 馮育芳 邢 進(jìn) 魏 杰 李曉波 岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動物資源研究所，北京 102629)

四翼無刺線蟲是小鼠常見的體內(nèi)寄生蟲，是實(shí)驗(yàn)動物蠕蟲檢測項(xiàng)目中陽性率較高的，常造成群體大范圍傳染[1]。因該線蟲與隱匿管狀線蟲形態(tài)特征近似，不易分辨，對日常檢測造成一定困難。目前，該項(xiàng)目常用的檢測方法是依靠形態(tài)學(xué)進(jìn)行顯微鏡肉眼檢測，分子生物學(xué)的PCR方法已有報道。但形態(tài)學(xué)檢測需要檢測人員經(jīng)過寄生蟲形態(tài)學(xué)系統(tǒng)培訓(xùn)達(dá)到一定經(jīng)驗(yàn)要求，PCR方法需要高技能人員和精密的熱循環(huán)和電泳設(shè)備，通常在基層檢測中難以應(yīng)用[2]。因此，建立一種方便、快捷的檢測方法，對于四翼無刺線蟲的檢測十分有必要。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增方法(loop—mediated isothermal amplification，LAMP)是一種體外核酸擴(kuò)增技術(shù)[3]，可作為PCR的另一種替代方法，依靠識別目標(biāo)序列中特定的6個區(qū)域，設(shè)計內(nèi)部引物(FIP、BIP)和外部引物(F3、B3)[4]。此外，LAMP檢測不需要昂貴的熱循環(huán)設(shè)備，僅在恒溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增[5]，即可進(jìn)行簡單的視覺檢測對結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，特異性和敏感性強(qiáng)，效率高、擴(kuò)增速度快?，F(xiàn)已應(yīng)用于病原微生物的日常檢測中[6]。

本研究針對四翼無刺線蟲設(shè)計一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增方法對基因組DNA進(jìn)行檢測，目的是能為基層實(shí)驗(yàn)室提供一種快速診斷的新方法。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣本

四翼無刺線蟲和鞭毛蟲樣本均來自本實(shí)驗(yàn)室日常檢測的實(shí)驗(yàn)動物，以實(shí)驗(yàn)動物使用的“3R”原則為依據(jù)，經(jīng)安樂死處死后，取腸內(nèi)容物收集四翼無刺線蟲和鞭毛蟲樣本。

1.2 主要試劑與儀器

微量基因組DNA、糞便DNA提取試劑盒(OMEGA公司)；DNA Marker、瓊脂糖、RNase-free Water(TaKaRa公司)；DNA-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)試劑盒、LAMP熒光檢測試劑盒【榮研生物科技(中國)有限公司】。

1.3 基因組DNA的提取

四翼無刺線蟲基因組DNA：取單條蟲體，按試劑盒說明提取DNA，保存于-20 ℃冰箱。鞭毛蟲基因組DNA：取少于2 mg的糞便，按試劑盒說明提取DNA，同樣保存于-20 ℃冰箱，備用。

1.4 LAMP擴(kuò)增反應(yīng)方法建立

1.4.1LAMP引物設(shè)計和合成：參照NCBI GenBank中四翼無刺線蟲398 bp DNA序列(登錄號MG386202.1)，使用在線軟件PrimerExplorer V5 設(shè)計LAMP引物，F(xiàn)IP:5’-CCTTAATACCAGTAGGAAC AGCAATTTTTGATATGAGGACTCGTTTG-3’，BIP：5’-TGGTAGTAATATGGTGTTTCAGCCTAATACCAGTTAAA CCCCCTAA-3’，F(xiàn)3：5’-GGTCATCATATGTTTACTGT GG-3’，B3：5’-CCAAAACAGGA TTAGCAACC-3’。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4.2LAMP反應(yīng)體系及結(jié)果判定：25 μL LAMP反應(yīng)體系為：2×反應(yīng)液(含40 mmol Tris-HCL，pH 8.8)，20 mmol KCL，16 mmol MgSO4，20 mmol (NH4)2SO4，0.2% Tween20，125 μL，Bst DNA聚合酶1 μL，100 μmol內(nèi)引物FIP和BIP各0.4 μL，100 μmol外引物F3和B3各0.1 μL，Loopamp熒光目測檢測試劑(FD)1 μL，模板DNA 2 μL，加RNase-free Water至25 μL。移液器吹打混勻后，放入恒溫金屬浴62 ℃恒溫反應(yīng)60 min，最后80 ℃滅活5 min。取出觀察有無顏色變化，當(dāng)發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)時，呈綠色為陽性反應(yīng)，橙色為陰性反應(yīng)。取2 μL LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.5 特異性實(shí)驗(yàn)

應(yīng)用試劑盒提取四翼無刺線蟲和鞭毛蟲基因組DNA，分別對四翼無刺線蟲和鞭毛蟲基因組DNA、ddH20進(jìn)行LAMP擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，觀察熒光顯色情況和對LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，觀察擴(kuò)增結(jié)果。

1.6 敏感性實(shí)驗(yàn)

將四翼無刺線蟲基因組DNA以 10倍梯度稀釋，分別為2.8～2.8×105ng/μL共6個梯度。取2 μL DNA加入LAMP反應(yīng)體系，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 LAMP檢測結(jié)果

四翼無刺線蟲DNA擴(kuò)增產(chǎn)物呈現(xiàn)綠色(陽性)，電泳后出現(xiàn)特征性的梯度條帶。對照反應(yīng)管為棕色(陰性)，電泳未顯示條帶。

2.2 LAMP反應(yīng)特異性驗(yàn)證

特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1，只有四翼無刺線蟲基因組DNA的LAMP產(chǎn)物呈現(xiàn)強(qiáng)烈的綠色，ddH2O和鞭毛蟲基因組DNA出現(xiàn)棕色。擴(kuò)增后產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，四翼無刺線蟲基因組DNA可擴(kuò)增出典型梯度條帶，其余對照均未出現(xiàn)條帶(圖2)。

1.鞭毛蟲；2.水；3.四翼無刺線蟲1.Giardia lamblia;2.ddH2O;3.aspiculuris tetraptera圖1 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 The specificity test

M.100 bp DNA Ladder Marker；1.四翼無刺線蟲；2.鞭毛蟲；3.水M.100 bp DNA Ladder Marker；1.Aspiculuris tetraptera；2.Giardia lamblia；3.ddH2O圖2 LAMP產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(特異性)Fig.2 Results of LAMP amplification products byAgarose gel electrophoresis(specificity test)

2.3 LAMP反應(yīng)敏感性驗(yàn)證

將四翼無刺線蟲DNA模板10倍梯度稀釋10～105倍共5個濃度，LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的綠色熒光顯示，LAMP反應(yīng)的擴(kuò)增水平可擴(kuò)增出102倍的稀釋DNA(圖3)，與瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果一致(圖4)。

1～6.原液～105倍稀釋；7.鞭毛蟲；8.水1～6.Crude solution～105 times dilution;7.Giardia lamblia;8.ddH2O圖3 敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.3 The sensibility test

M.100 bp DNA Ladder Marker；1～6.原液～105倍稀釋；7.鞭毛蟲；8.水M.100 bp DNA Ladder Marker;1-6.Crude solution-105times dilution;7.Giardia lamblia;8.ddH2O圖4 梯度稀釋DNA LAMP產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(敏感性)Fig.4 Results of LAMP amplification products byGradient dilution of DNA (sensibility test)

3 討論

四翼無刺線蟲(Aspiculuristetraptera)是蠕蟲的一種，屬于線蟲綱(Nematoda)，尖尾目(Oxyurida)，異線科(Heteroxynematidae), 無刺屬(AspiculurisSchulz)，又稱蟯蟲[7]。該種線蟲在全球各地均有報道，并且在實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)鼠中經(jīng)常被檢測到，在中國《實(shí)驗(yàn)動物 寄生蟲學(xué)等級及監(jiān)測》國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 14922.1—2001)和其他國實(shí)驗(yàn)動物檢測標(biāo)準(zhǔn)中，均是應(yīng)排除的寄生蟲之一。實(shí)驗(yàn)鼠感染蟯蟲后，對實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性將會產(chǎn)生影響，因此必須對鼠蟯蟲病的篩查給予重視。

目前，四翼無刺線蟲常用的檢測方法是依靠形態(tài)學(xué)進(jìn)行顯微鏡肉眼檢測，PCR方法已有報道。但形態(tài)學(xué)檢測需要檢測人員經(jīng)過寄生蟲形態(tài)學(xué)系統(tǒng)培訓(xùn)達(dá)到一定經(jīng)驗(yàn)要求，PCR方法需要高技能人員和精密的熱循環(huán)和電泳設(shè)備，實(shí)驗(yàn)結(jié)果假陽性較高[8]。與傳統(tǒng)PCR檢測法相比，LAMP檢測法操作簡便，因其為等溫反應(yīng)，可省去熱循環(huán)擴(kuò)增，不需要PCR儀，操作極為簡便[9]；耗時短，LAMP反應(yīng)體系可在恒溫條件下擴(kuò)增，僅耗時1 h左右，即可根據(jù)肉眼觀察的綠色熒光情況對LAMP產(chǎn)物的擴(kuò)增情況進(jìn)行結(jié)果判定，其擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳后，出現(xiàn)特征性的階梯狀條帶，不會出現(xiàn)雜帶而干擾結(jié)果的判斷；經(jīng)過熒光顯色法和瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，結(jié)果一致，因此，可選用熒光顯色法作為LAMP法的結(jié)果判定?？杀苊庖蜷_蓋電泳造成污染形成的假陽性結(jié)果[4]。

可見，四翼無刺線蟲的LAMP擴(kuò)增反應(yīng)具有簡便、快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)。作為一種快速診斷的新方法為基層實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場檢測工作提供新的檢測參考依據(jù)，為四翼無刺線蟲的檢測提供了一種新思路和新方法。