陳 蕾 劉葉倩 趙紅霞 李 弘 吳碧茹 曾 勇 馬丹鳳 陳春茗 劉 林 任衛(wèi)瓊 易 健

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長沙 410007)(2.安徽省第二人民醫(yī)院，合肥 230041) (3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心，長沙 410208)(4.湖南省兒童醫(yī)院，長沙 410007)

近10年來，我國高血壓患病人數(shù)高達(dá)3.3億，該病并發(fā)癥多，可以造成心、腦、腎和血管等全身多個靶器官不同程度的損害[1-2]。患抑郁癥的概率為26%，其中男性24.6%，女性24.4%[3]。研究表明，其并發(fā)的抑郁癥是高血壓患者死亡的重要危險因素[4]，且高血壓病程越長，抑郁程度越深，兩者相互促進(jìn)[5]。

高血壓并發(fā)抑郁癥(hypertension complicated with depression，HD)的發(fā)生主要是長期的高壓狀態(tài)造成的情緒失調(diào)及長期服用降壓藥物致使的心理負(fù)擔(dān)加重，誘發(fā)情感障礙，導(dǎo)致并發(fā)抑郁癥[6]。目前，與HD有關(guān)的研究大多集中于臨床，主要是因為缺乏系統(tǒng)、規(guī)范且符合病證特點(diǎn)的HD動物模型及相關(guān)評價體系。故本實驗采用慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激聯(lián)合孤養(yǎng)的方法觀察自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)行為學(xué)、血清中5-HT及海馬神經(jīng)元的變化，以支持進(jìn)一步研究一種相對可靠的高血壓并發(fā)抑郁癥動物模型。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物： 自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2016-0006】采購20只8周齡SPF級健康雄性SHR大鼠，體質(zhì)量180～220 g；10只8周齡SPF級健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，質(zhì)量合格證編號：110011211102924524；以上實驗動物飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)創(chuàng)新中心實驗動物中心【SYXK(湘)2020-0003】，本實驗由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會審查，倫理審批號：2YFY20210316-01。飼養(yǎng)環(huán)境燈光12 h循環(huán)，室溫恒定22～ 24 ℃，濕度55%～65%，大鼠自由攝取食物與水。

1.1.2主要試劑與儀器： 生理、藥理電子刺激儀(YLS-9A型，濟(jì)南益延科技有限公司)；智能無創(chuàng)血壓計(BP-98A，北京軟隆生物有限公司)；組織脫水機(jī)(STP-120，Thermo Fisher)；包埋機(jī)(HistoStar，Thermo Fisher)；染色機(jī)(Gemini AS，Thermo Fisher)；病理組織漂烘儀染色機(jī)(PH60型，常州派斯杰有限公司)；熒光顯微鏡(BX43，Olympus)；酶標(biāo)儀(MK-3，Thermo Fisher)；5-HT酶聯(lián)免疫試劑盒(江蘇菲亞生物科技有限公司)；Nissl 染色液(DK0023，北京雷根生物有限公司)；蘇木精-伊紅染色試劑盒(北京九州柏林生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1動物分組、造模：SHR 20只，隨機(jī)均分為高血壓對照組和模型組，另設(shè)同數(shù)Sprague-Dawley(SD)大鼠為空白組。模型組以慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)聯(lián)合孤養(yǎng)的方法干預(yù)5周，其余組正常飼養(yǎng)。應(yīng)激包括：(1)噪音刺激4 h；(2)禁水24 h；(3)食物剝奪24 h；(4)晝夜顛倒24 h；(5)潮濕墊料24 h；(6)4 ℃冰水浴4 min；(7)傾籠45°24 h；(8)50 V電擊1 min。每天隨機(jī)抽取一種刺激方法進(jìn)行干預(yù)，方法(6)、(8)每周1次，且1周內(nèi)的干預(yù)方法不重復(fù)。

1.2.2動物行為學(xué)檢測：(1)大鼠一般情況：觀察大鼠毛發(fā)的色澤、枯榮，活躍程度、飲食情況、大小便狀態(tài)等。記錄各組大鼠造模前體質(zhì)量為初始值，以每周體質(zhì)量與初始值之差為變化量，計算變化量與初始值的比值為體質(zhì)量變化率(%)。(2)血壓測定：使用無創(chuàng)血壓儀，分別于造模前、14、35 d的8:00～12:00測量大鼠尾動脈壓，每只大鼠進(jìn)行3次測量，記錄平均值。(3)曠場實驗(Open-field test)：將大鼠從敞箱底面中央一格上方背對實驗人員放入，適應(yīng) 30 s，記錄 4 min。觀察大鼠后肢站立次數(shù)與某一肢體穿越格子次數(shù)。(4)糖水消耗實驗(sucrose preference test)：禁食禁水24 h，各鼠籠備1%濃度蔗糖水與蒸餾水各一瓶，每瓶200 mL，供大鼠自由飲用，1 h后調(diào)換二者位置，2 h后撤除水瓶，記錄2 h內(nèi)蔗糖水瓶糖水消耗量，計算各組大鼠糖水消耗率(%)。(5)強(qiáng)迫游泳實驗(forces swim test)：將大鼠置入水缸，適應(yīng)30 s后，記錄大鼠處于自然漂浮狀態(tài)的時間，此時大鼠僅露出鼻孔呼吸或四肢輕微擺動保持平衡。

1.2.3樣本采集：實驗結(jié)束后，所有動物禁食不禁水12 h，乙醚吸入麻醉，腹主動脈取血，靜置、離心、收集血清，-80 ℃凍存。迅速斷頭取腦，使用0.9%氯化鈉溶液洗去血污，4%多聚甲醛中固定。

1.2.4ELISA法檢測各組大鼠血清中5-HT含量：取出5-HT試劑盒室內(nèi)平衡溫度30 min，根據(jù)內(nèi)置說明書順序依次操作，酶標(biāo)儀檢測A值，換算各組大鼠血清中5-HT含量。

1.2.5HE染色觀察海馬組織病理狀態(tài)：全腦置4%多聚甲醛溶液固定。取海馬組織脫水、包埋。蠟塊以2 μm切片，烘漂儀脫去石蠟，染色機(jī)HE染色，中性樹膠封片。200倍熒光顯微鏡下觀察拍片。

1.2.6尼氏染色觀察海馬神經(jīng)元凋亡狀態(tài)：海馬組織蠟塊以5 μm切片并脫蠟至水，置入染缸。56 ℃溫箱浸染1 h，漂洗去染色液，依次置入分化液、無水乙醇、二甲苯，使用中性樹膠封片，400倍熒光顯微鏡觀察拍片。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況變化

與空白組比較，高血壓對照組大鼠毛發(fā)色澤、枯榮程度，飲食情況，二便狀態(tài)無異常，習(xí)性活躍，體質(zhì)量增長率顯著性增大(P<0.05)。與高血壓對照組比較，模型組大鼠毛發(fā)色澤暗淡枯槁，精神萎靡，膽小、喜蜷縮拱背，食欲差，二便增加，體質(zhì)量增長率顯著性降低(P<0.01)，見圖1。

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與高血壓對照組比較，#P<0.05，##P<0.01Note：Compared with control group, *P<0.05，**P<0.01;Compared with hypertension control group,#P<0.05，##P<0.01圖1 各組大鼠體質(zhì)量增長率比較Fig.1 Comparison of body weight growthrate of rats in each group

2.2 大鼠收縮壓變化

造模前、14 d與結(jié)束后，與空白組比較，高血壓對照組與模型組大鼠收縮壓顯著性升高(P<0.01)。模型組略高于高血壓對照組，但該差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

注：與空白組比較，*P<0.01；1 mmHg=0.133 kPaNote：Compared with control group, *P<0.01;1 mmHg=0.133 kPa圖2 造模前、14 d、造模結(jié)束后收縮壓變化Fig.2 Changes in systolic blood pressure beforemodeling, 14 days, and after modeling

2.3 造模14 d、結(jié)束后各行為學(xué)結(jié)果

2.3.1曠場實驗： 造模14 d后，與空白組比較，高血壓對照組曠場實驗活動次數(shù)顯著性增加(P<0.05)，模型組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；此時，模型組活動次數(shù)較高血壓對照組略低，但數(shù)據(jù)無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。造模結(jié)束后，與空白組比較，高血壓對照組活動次數(shù)顯著性增加(P<0.01)，模型組顯著性降低(P<0.05)，此時，模型組活動次數(shù)較高血壓對照組顯著性降低(P<0.01)，見圖3。

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與高血壓對照組比較，#P<0.01Note：Compared with control group, *P<0.05，**P<0.01;Compared with hypertension control group,#P<0.01圖3 造模14 d、結(jié)束后曠場實驗結(jié)果Fig.3 The results of the open field testafter 14 days of modeling

2.3.2糖水偏好實驗： 造模14 d后，3組間糖水消耗率比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。造模結(jié)束后，與空白組比較，高血壓對照組該指標(biāo)無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，模型組糖水消耗率顯著性降低(P<0.01)；與高血壓對照組比較，模型組糖水消耗率顯著性降低(P<0.01)，見圖4。

注：與空白組比較，*P<0.01；與高血壓對照組比較，#P<0.01Note：Compared with control group, *P<0.01;Compared with hypertension control group,#P<0.01圖4 14 d、造模結(jié)束后糖水消耗實驗結(jié)果Fig.4 Experimental results of sugar water consumptionafter 14 days of modeling and after modeling

2.3.3強(qiáng)迫游泳實驗： 與空白組比較，高血壓對照組不動時間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。與空白組和高血壓對照組比較，模型組大鼠顯著性延長(均P<0.01)，見圖5。

注：與空白組比較，*P<0.01；與高血壓對照組比較，#P<0.01Note：Compared with control group, *P<0.01;Compared with hypertension control group,#P<0.01圖5 造模結(jié)束強(qiáng)迫游泳實驗結(jié)果Fig.5 Results of forced swimming experiment after modeling

2.4 ELISA測定各組大鼠血清中5-HT的含量變化

與空白組比較，高血壓對照組大鼠血清中5-HT含量無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。與空白組和高血壓對照組比較，模型組血清中該指標(biāo)顯著性降低(P<0.01，P<0.05)，見圖6。

注：與空白組比較，*P<0.01；與高血壓對照組比較，#P<0.05Note：Compared with control group, *P<0.01;Compared with hypertension control group,#P<0.05圖6 各組大鼠血清5-HT含量變化Fig.6 Changes in serum 5-HTcontent of rats in each group

2.5 HE 染色觀察各組大鼠海馬組織病理形態(tài)改變

空白組海馬神經(jīng)元核仁清晰，形態(tài)圓整，排列整齊；高血壓對照組部分海馬神經(jīng)元出現(xiàn)核固縮，細(xì)胞萎縮；模型組海馬神經(jīng)元存在一定程度的損傷，具體表現(xiàn)為神經(jīng)元細(xì)胞核染色加深，胞體固縮，排列疏松，部分細(xì)胞凋亡，見圖7。

圖7 HE染色觀察海馬神經(jīng)元病理變化Fig.7 HE staining to observe the pathological changes of hippocampal neurons

2.6 尼氏染色觀察各組大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡情況

空白組海馬神經(jīng)元形態(tài)完整，尼氏小體數(shù)量多且密集；高血壓對照組神經(jīng)元形態(tài)正常，尼式小體數(shù)量多；模型組神經(jīng)元密度降低，胞質(zhì)著色較淺，尼氏小體減少，見圖8。

圖8 尼式染色觀察海馬神經(jīng)元凋亡情況Fig.8 Nissl staining to observe the hippocampal neuron apoptosis

3 討論

目前，抑郁癥動物模型大致分為應(yīng)激模型、手術(shù)造模、藥物造模和遺傳造模四類[7]。其中，慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激(CUMS)模型，以持續(xù)數(shù)周每天人為給予實驗動物不同種不可預(yù)知刺激為手段，模擬人類社會環(huán)境中不可拒絕的壓力誘導(dǎo)嚙齒類動物的抑郁行為[8]。孤養(yǎng)模型通過將大鼠長期單籠飼養(yǎng)，以模擬被動的社會孤立應(yīng)激誘導(dǎo)動物的抑郁行為[9]。SHR與人類原發(fā)性高血壓相似程度高且模型成熟穩(wěn)定，是研究高血壓病常用的動物模型。故本實驗采用慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激聯(lián)合孤養(yǎng)SHR大鼠，貼合高血壓并發(fā)抑郁癥患者生理與心理的病癥特點(diǎn)，且可有效避免單一造模的假陽性結(jié)論，探索穩(wěn)定的動物高血壓并發(fā)抑郁癥模型。

Wistar-Kyoto(WKY)大鼠與SHR大鼠均由Wistar品系繁殖而來，同屬變異系大鼠，常用作SHR大鼠的正常血壓對照組[10]。同時，WKY大鼠在各種行為學(xué)檢測中表現(xiàn)較差，展現(xiàn)出高水平的內(nèi)源性抑郁樣行為特點(diǎn)[11]。1963年由Okamoto等發(fā)現(xiàn)，并由Paré WP驗證為一種內(nèi)源性抑郁癥動物模型[12]，這使其不適宜作為行為學(xué)檢測的正常對照組。故本實驗中使用SD大鼠作為慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激聯(lián)合孤養(yǎng)SHR大鼠這一復(fù)合模型的正常對照。

CUMS聯(lián)合孤養(yǎng)模型的核心標(biāo)準(zhǔn)是實驗動物出現(xiàn)獎賞行為和快感缺乏，主要包括糖水消耗率減少、顱內(nèi)自我刺激閾值增加、體質(zhì)量和食欲下降、前額葉皮層和海馬區(qū)萎縮、細(xì)胞凋亡等[8]。本實驗結(jié)果顯示，造模結(jié)束后，模型組大鼠收縮壓顯著性升高，毛發(fā)色澤暗淡枯槁，精神萎靡，膽小、喜蜷縮拱背，食欲差，體質(zhì)量增長率顯著性降低，即一般情況最差。水平活動與直立次數(shù)明顯降低，即其對未知環(huán)境的探索能力和興趣明顯下降。糖水消耗率顯著性降低，即獎賞行為表現(xiàn)最差。強(qiáng)迫游泳不動時間顯著性延長，即絕望程度最深。提示，SHR大鼠慢性應(yīng)激后，存在體質(zhì)量降低、活動性和探索能力降低和獎賞行為缺乏等抑郁行為。

單胺神經(jīng)遞質(zhì)水平下調(diào)亦是抑郁癥模型的重點(diǎn)評價指標(biāo)。經(jīng)典的“單胺假說”認(rèn)為，中樞神經(jīng)系統(tǒng)5-羥色胺系統(tǒng)缺陷是抑郁癥潛在的病理生理學(xué)基礎(chǔ)[13]。血清5-HT水平可反映顱內(nèi)5-HT的水平變化[14]，持續(xù)低水平的5-HT會影響到大腦調(diào)節(jié)情緒的功能區(qū)，產(chǎn)生抑郁等負(fù)面情緒，導(dǎo)致抑郁癥的發(fā)生[15]。本實驗結(jié)果顯示，模型組5-HT含量顯著性降低。提示，SHR大鼠給予慢性應(yīng)激后機(jī)體存在抑郁狀態(tài)。

海馬對HPA軸的負(fù)反饋調(diào)節(jié)、海馬齒狀回的顆粒下層和嗅球具有神經(jīng)可塑性，使其成為與抑郁癥相關(guān)的關(guān)鍵大腦區(qū)域[16]。慢性應(yīng)激可引起海馬區(qū)細(xì)胞凋亡，影響海馬細(xì)胞的完整性[17]。研究表明，抑郁癥患者的海馬區(qū)細(xì)胞凋亡[18]。在本實驗中，與空白組比較，模型組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞核染色加深，胞體固縮，部分細(xì)胞凋亡，排列疏松，尼氏小體數(shù)量減少。提示，SHR大鼠給予慢性應(yīng)激后，海馬神經(jīng)元存在一定程度的損傷。

綜上所述，從整體上來說，采用CUMS聯(lián)合孤養(yǎng)的方法干預(yù)SHR大鼠，可使SHR大鼠行為學(xué)、血清中5-HT與海馬區(qū)神經(jīng)元呈現(xiàn)抑郁樣改變。從行為學(xué)指標(biāo)、生化指標(biāo)、神經(jīng)病理學(xué)等多個層面展示了與臨床高血壓并發(fā)抑郁癥的相似性，為后續(xù)實驗的開展提供了一定的實踐依據(jù)。