申兆棟, 黃冬梅, 方長玲, 葉洪麗, 田良良, 伍 姿, 張 俊

(1. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院, 上海 201306; 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)部遠(yuǎn)洋與極地漁業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實驗室, 上海 200090)

中華絨螯蟹又稱大閘蟹、河蟹,是我國主要的淡水經(jīng)濟(jì)蟹類,廣泛分布于中國沿海及通海的河流湖泊中,主要有遼河、黃河和長江三大水系。中華絨鰲蟹營養(yǎng)豐富,肉質(zhì)鮮嫩,風(fēng)味優(yōu)良,尤其是以陽澄湖出產(chǎn)的大閘蟹最負(fù)盛名,是深受消費(fèi)者喜愛的食品[1],其蟹肉脂肪中富含不飽和脂肪酸(UFA),含量高達(dá)43%,其中二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)為主要含量[2]。有研究表明,飽和脂肪酸(SFA)會引起血清總膽固醇升高,單不飽和脂肪酸(MUFA)卻有保護(hù)心臟、降血糖、降低膽固醇、調(diào)節(jié)血脂和防止記憶下降等作用[3],同時多不飽和脂肪酸(PUFA)有降血脂、防止動脈硬化、提高人體免疫機(jī)能等重要功能[4]。中華絨螯蟹中脂肪酸的組成與含量能夠評估其營養(yǎng)價值與品質(zhì),因此建立一種高效、靈敏的脂肪酸含量測定分析方法尤為重要。

目前氣相色譜法是分析脂肪酸組成應(yīng)用最廣的方法[5,6],其具有分析時間短、分離效果好、檢出限低、靈敏度高的特點(diǎn)[7,8]。脂肪酸提取[9,10]的常用溶液有氯仿-甲醇(TCM-MeOH)、二氯甲烷-甲醇(DCM-MeOH)、甲基叔丁基醚-甲醇(MTBE- MeOH)、乙醚-石油醚-甲醇溶液(DEE-PET-MeOH)等。常用衍生方法有酸催化[11]和堿催化[12]等。不同文獻(xiàn)、不同實驗室采取的脂肪酸提取和甲酯化試劑各不相同,測定結(jié)果參差不齊,很難實現(xiàn)脂肪酸的準(zhǔn)確測定。目前,針對中華絨螯蟹中脂肪酸含量的檢測方法較少,還需要進(jìn)一步研究與開發(fā)。

因此,本文比較了4種常見的脂肪提取試劑及甲酯化試劑,確定了最合適的前處理方法,從而準(zhǔn)確獲得中華絨螯蟹的脂肪酸含量與組成特征。本方法的建立為中華絨螯蟹脂肪酸的測定提供了準(zhǔn)確可靠的理論數(shù)據(jù),是一種高效、靈敏、全面的分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

6890氣相色譜儀,配有氫離子火焰檢測器(FID)(美國Agilent公司); SG-8016A型數(shù)顯水浴恒溫振蕩器(上海碩光電子科技有限公司); BT25S型十萬分之一電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司);數(shù)顯型漩渦混合器(美國Tallboys公司)。

37種脂肪酸甲酯單標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 mg/mL):丁酸甲酯(C4∶0)、己酸甲酯(C6∶0)、辛酸甲酯(C8∶0)、癸酸甲酯(C10∶0)、十一碳酸甲酯(C11∶0)、月桂酸甲酯(C12∶0)、十三碳酸甲酯(C13∶0)、豆蔻酸甲酯(C14∶0)、順-9-十四碳烯酸甲酯(C14∶1)、十五碳酸甲酯(C15∶0)、順-10-十五碳烯酸甲酯(C15∶1)、棕櫚酸甲酯(C16∶0)、順-9-十六碳烯酸甲酯(C16∶1)、十七碳酸甲酯(C17∶0)、順-10-十七碳烯酸甲酯(C17∶1)、硬脂酸甲酯(C18∶0)、反-9-十八碳烯酸甲酯(C18∶1n9t)、油酸甲酯(C18∶1n9c)、反亞油酸甲酯(C18∶2n6t)、亞油酸甲酯(C18∶2n6c)、花生酸甲酯(C20∶0)、γ-亞麻酸甲酯(C18∶3n6)、順-11-二十碳烯酸甲酯(C20∶1)、α-亞麻酸甲酯(C18∶3n3)、二十一烷酸甲酯(C21∶0)、順-11,14二十碳二烯酸甲酯(C20∶2)、山崳酸甲酯(C22∶0)、順-8,11,14-二十碳三烯酸甲酯(C20∶3n6)、芥酸甲酯(C22∶1n9)、順-11,4,17-二十碳三烯酸甲酯(C20∶3n3)、花生四烯酸甲酯(C20∶4n6)、二十三烷酸甲酯(C23∶0)、順-13,16二十二碳二烯酸甲酯(C22∶2)、二十四烷酸甲酯(C24∶0)、二十碳五烯酸甲酯(C20∶5n3)、二十四碳烯酸甲酯(C24∶1)、二十二碳六烯酸甲酯(C22∶6n3)(純度≥99%)和2種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 mg/mL):棕櫚酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)(純度≥99%)(美國NU-CHEK-PREP公司);甲醇、二氯甲烷、正己烷、正庚烷、甲基叔丁基醚(色譜純,美國Merck公司);氯仿、硫酸、氨水、石油醚、乙醚(分析純,美國Merck公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別將100 mg/mL的37種脂肪酸甲酯單標(biāo)準(zhǔn)溶液用正庚烷配制成10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于-18 ℃棕色玻璃瓶中保存,有效期6個月;分別移取0.5 mL 37種脂肪酸甲酯單標(biāo)準(zhǔn)儲備液,置于50 mL容量瓶中,用正庚烷配制成100 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于-18 ℃棕色玻璃瓶中保存,有效期6個月;分別將100 mg/mL的棕櫚酸、硬脂酸標(biāo)準(zhǔn)溶液用正庚烷配制成10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于-18 ℃棕色玻璃瓶中保存,有效期6個月。

將100 μg/mL的37種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,用正庚烷逐級稀釋成濃度為0.1、0.2、0.5、1、5和10 μg/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,于4 ℃棕色玻璃瓶中保存,有效期3個月。分別將10 mg/mL的棕櫚酸、硬脂酸標(biāo)準(zhǔn)溶液用正庚烷配制成1 mg/mL的單標(biāo)準(zhǔn)工作液,于4 ℃棕色玻璃瓶中保存,有效期3個月。

1.3 實驗方法

1.3.1樣品采集

中華絨螯蟹樣品于陽澄湖養(yǎng)殖塘捕撈(東經(jīng)120°45′19″,北緯31°25′25″),雌蟹和雄蟹各10只,平均重量為125.6 g,每個樣品分別用自封袋封裝編號并立即運(yùn)回實驗室。取其腿部及腹部肌肉混合均勻,將樣品放入-18 ℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2脂肪的提取

稱取1 g中華絨螯蟹肌肉樣品,置于玻璃管中,加入4 mL氯仿-甲醇(1∶1, v/v)、1 mL超純水,渦旋90 s,于4 ℃以10 000 r/min離心6 min,滴管吸取下層有機(jī)層溶液于玻璃管中,再向水層加入1 mL氯仿,重復(fù)提取一次,合并兩次提取液,氮?dú)獯蹈?得到干燥脂肪提取物。

1.3.3脂肪酸甲酯化

向提取物中,加入2 mL 含2%硫酸的甲醇溶液,于70 ℃水浴加熱50 min,完成后冷卻至室溫,再向樣品溶液中加入2 mL蒸餾水,然后分2次加入2 mL正己烷,充分混合萃取,靜置分層,取上層清液,再加入適量無水硫酸鈉吸附水分,即得中華絨螯蟹肌肉中脂肪酸甲酯化溶液,待氣相色譜分析。

1.3.4氣相色譜條件

DM-2560色譜柱(100 m×0.25 mm×0.20 μm); FID溫度250 ℃;進(jìn)樣口溫度250 ℃;載氣:N2;分流比:10∶1;柱內(nèi)流速：1.2 mL/min;色譜柱升溫程序:初始溫度120 ℃,保持1 min,以15 ℃/min升溫至210 ℃,保持4 min,以5 ℃/min升溫至240 ℃,保持10 min;進(jìn)樣量：1 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的確定

中華絨螯蟹中的脂肪酸種類較多,構(gòu)成復(fù)雜,本工作考察了填料為二氰丙基聚硅氧烷-非鍵合固定液的強(qiáng)極性毛細(xì)管色譜柱DM-2560 (100 m×0.25 mm×0.20 μm)與填料幾乎等同于(5%苯基)-甲基聚硅氧烷的非極性苯基芳基聚合物的色譜柱DB-5MS (30 m×0.25 mm×0.20 μm)的分離效果。當(dāng)采用DB-5MS毛細(xì)管色譜柱時,二十二碳烯酸、二十碳三烯酸與花生四烯酸甲酯不能分離,只出現(xiàn)一個峰;當(dāng)采用DM-2560毛細(xì)管色譜柱時,37種脂肪酸甲酯在52 min內(nèi)得到良好分離,且峰形良好(見圖1),說明面對較多較復(fù)雜的脂肪酸時,選擇長度較長、極性較強(qiáng)的DM-2560毛細(xì)管色譜柱才能達(dá)到良好的分離效果。因此實驗采用DM-2560毛細(xì)管色譜柱進(jìn)行分離。

圖 1 37種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 μg/mL)的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of the 37 fatty acid methyl esters (1 μg/mL) in mixed standard solutions 1. methyl butyrate (C4∶0); 2. methyl hexanoate (C6∶0); 3. methyl caprylate (C8∶0); 4. methyl decanoate (C10∶0); 5. methyl undecanoate (C11∶0); 6. methyl laurate (C12∶0); 7. methyl tridecarbonate (C13∶0); 8. methyl myristate (C14∶0); 9. tetradecenoic acid methyl ester (C14∶1); 10. methyl pentadecanoate (C15∶0); 11. pentadecenoic acid methyl ester (C15∶1); 12. methyl palmitate (C16∶0); 13. methyl hexadecenoate (C16∶1); 14. methyl heptadecarbonate (C17∶0); 15. methyl heptadecenoate (C17∶1); 16. methyl stearate (C18∶0); 17. trans-9-octadecenoic acid methyl ester (C18∶1n9t); 18. methyl oleate (C18∶1n9c); 19. trans- linoleic acid methyl ester (C18∶2n6t); 20. methyl linoleate (C18∶2n6c); 21. arachidic acid methyl ester (C20∶0); 22. γ-methyl linolenate (C18∶3n6); 23. methyl eicosenoate (C20∶1); 24. α-methyl linolenate (C18∶3n3); 25. methyl heptadecanoate (C21∶0); 26. eicosadienoic acid methyl ester (C20∶2); 27. methyl behenate (C22∶0); 28. cis-8,11,14-eicosatrienoic acid methyl ester (C20∶3n6); 29. methyl erucate (C22∶1n9); 30. cis-11,14,17-eicosatrienoic acid methyl ester (C20∶3n3); 31. methyl arachidonate (C20∶4n6); 32. methyl tridecanoate (C23∶0); 33. docosaedienoic acid methyl ester (C22∶2); 34. tetracosanoic acid methyl ester (C24∶0); 35. methyl eicosapentaenoate (EPA, C20∶5n3); 36. methyl tetradecenoate (C24∶1); 37. methyl docosahexaenoate (DHA, C22∶6n3).

2.2 脂肪提取試劑的選擇

面對種類繁多的提取試劑,本文將常見的脂肪提取試劑進(jìn)行了比較,氯仿-甲醇溶液對脂蛋白、磷脂提取效率較高;二氯甲烷與氯仿性質(zhì)相似但危險性較小;甲基叔丁基醚能與油脂能很好地混合;乙醚溶解脂肪能力強(qiáng),應(yīng)用較多,但乙醚能被2%的水飽和,含水乙醚提取脂肪的能力降低,并能使非脂成分溶解,從而被提取出來,使結(jié)果偏高,石油醚比乙醚溶解能力弱但允許含微量水分,兩者混合使用效果更好。因此實驗以中華絨螯蟹肌肉組織中含量較高的13種脂肪酸作為主要研究對象,通過不同的提取試劑比較這13種主要的脂肪酸的提取效果,來確定中華絨螯蟹脂肪酸的提取試劑,分別考察了氯仿-甲醇(1∶1, v/v)、二氯甲烷-甲醇(1∶1, v/v)、甲基叔丁基醚-甲醇(1∶1, v/v)、乙醚-石油醚-甲醇(1∶1∶2, v/v/v)對脂肪酸的提取效果。由圖2可以看出,經(jīng)氯仿-甲醇(1∶1, v/v)提取后,中華絨螯蟹中主要脂肪酸含量均明顯高于其他3種試劑。因此本文采用氯仿-甲醇來提取中華絨螯蟹中的脂肪酸。

圖 2 不同提取試劑對脂肪酸含量的影響Fig. 2 Effect of different extraction reagents on the fatty acid contents TCM: chloroform; DCM: dichloromethane; MTBE: methyl tert-butyl ether; DEE: ether; PET: petroleum ether.

圖 3 氯仿和甲醇的體積比對脂肪酸含量的影響Fig. 3 Effect of volume ratios of chloroform and methanol on the fatty acid contents

確定了氯仿-甲醇體系后,實驗具體考察了氯仿與甲醇的體積比(1∶1、2∶1、1∶2)對提取效果的影響。從圖3可以看出,氯仿-甲醇體積比為1∶1時提取的脂肪酸含量最高;氯仿含量過多,13種主要脂肪酸含量反而降低;氯仿含量過少，脂肪酸含量降低的更加明顯。因此,確定氯仿-甲醇的體積比為1∶1。

2.3 脂肪酸衍生化試劑的選擇

在氯仿-甲醇溶液(1∶1, v/v)為提取試劑、70 ℃水浴的條件下,為研究不同甲酯化試劑的甲酯化效果,比較了含2%硫酸的甲醇溶液甲酯化50 min、含2%氫氧化鉀的甲醇溶液甲酯化50 min以及酸堿結(jié)合甲酯化(先加入含2%硫酸的甲醇酯化25 min,再加入含2%氫氧化鉀的甲醇酯化25 min)3種甲酯化方法對中華絨螯蟹干粉樣品中脂肪酸含量的影響。從圖4可以得出,中華絨螯蟹中的主要脂肪酸通過含硫酸的甲醇溶液甲酯化后含量顯著高于其他兩種甲酯化方法。

圖 4 不同甲酯化方法對脂肪酸含量的影響Fig. 4 Effect of different methyl esterification methods on the fatty acid contents

為探究先提取后甲酯化“兩步”反應(yīng)與直接甲酯化“一步”反應(yīng)的甲酯化效果,同時對比了不經(jīng)氯仿-甲醇(1∶1, v/v)提取,直接用含2%硫酸的甲醇甲酯化50 min的效果。從圖4可以看出,“兩步”反應(yīng)雖然消耗更多的時間和試劑,但能更大程度提取并甲酯化中華絨螯蟹中的脂肪酸。因此本實驗采用先提取后甲酯化的方法。

實驗確定硫酸甲醇溶液為甲酯化試劑后,進(jìn)一步探究含不同體積分?jǐn)?shù)(1%、2%、5%、10%)的硫酸甲醇溶液的甲酯化效果。結(jié)果如圖5所示,當(dāng)硫酸體積分?jǐn)?shù)為2%時主要脂肪酸含量達(dá)到最大值,此后增加硫酸的體積分?jǐn)?shù),脂肪酸含量反而降低。因此,本文最終確定采用含2%硫酸的甲醇溶液。

圖 5 硫酸的體積分?jǐn)?shù)對脂肪酸含量的影響Fig. 5 Effect of volume fractions of sulfuric acid on the fatty acid contents

圖 6 不同水浴時間對脂肪酸含量的影響Fig. 6 Effect of different bath time on the fatty acid contents

2.4 甲酯化水浴時間的優(yōu)化

實驗考察了不同水浴時間(30、40、50、60和70 min)對脂肪酸甲酯化的影響。結(jié)果如圖6所示,中華絨螯蟹肌肉中的主要脂肪酸含量隨著水浴時間的增加而增加,最終在50 min時達(dá)到最大值,此后增加水浴時間,脂肪酸含量反而降低。因此本文優(yōu)化后的甲酯化的水浴時間為50 min。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1線性范圍、檢出限及定量限

對37種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定,以脂肪酸甲酯的質(zhì)量濃度(x, μg/mL)為橫坐標(biāo),峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見表1)。結(jié)果表明,脂肪酸甲酯在0.5～100 μg/mL線性范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)(R2)為0.998 1～0.999 9。

表 1 37種脂肪酸甲酯的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

分別對37種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級稀釋,進(jìn)樣測定,分別以3倍和10倍信噪比時的含量為檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。結(jié)果顯示,37種脂肪酸甲酯的LOD和LOQ分別為0.01～0.02 mg/100 g和0.04～0.06 mg/100 g(見表1)。

2.5.2加標(biāo)回收率和精密度

中華絨螯蟹中脂肪酸種類豐富,實驗選取了含量較高的棕櫚酸和硬脂酸,進(jìn)行了加標(biāo)回收率試驗。稱取1 g空白中華絨螯蟹肌肉樣品,在1、2、10 mg/100 g 3個加標(biāo)水平下加入棕櫚酸、硬脂酸兩種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個水平平行5次。結(jié)果發(fā)現(xiàn),這兩種脂肪酸平均加樣回收率為76%～97.5%, RSD為3.31%～7.90%(見表2),表明方法準(zhǔn)確度高,精密度良好。

表 2 在3個加標(biāo)水平下棕櫚酸、硬脂酸的回收率及 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)

2.6 實際樣品檢測

準(zhǔn)確稱取1 g中華絨螯蟹肌肉樣品5份,測定其中各脂肪酸含量(見表3)。結(jié)果表明,共檢出31種脂肪酸,碳鏈長度為12～24,脂肪酸總含量達(dá)到281.03 mg/100 g, DHA、EPA、油酸、亞油酸、棕櫚酸等是中華絨螯蟹肌肉中的主要脂肪酸。其中飽和脂肪酸占總脂肪酸的17.01%,單不飽和脂肪酸為24.72%,多不飽和脂肪酸為58.27%,中華絨螯蟹中脂肪酸的營養(yǎng)價值主要指標(biāo)為EPA和DHA,含量高達(dá)43.89%。各類脂肪酸特征和Jiang等[13]和王瀟等[14]結(jié)果相似,其中多不飽和脂肪酸ω-3與ω-6(不飽和脂肪酸中第一個雙鍵的位置命名的一系列脂肪酸)的比值為4.74,遠(yuǎn)高于國際糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的ω-3/ω-6日常膳食比(0.1～0.2)[15],較高的ω-3/ω-6能有效降低血脂,抑制血小板凝集,降低心血管疾病的發(fā)病率[16]。綜上所述,中華絨螯蟹中脂肪酸種類豐富,脂肪酸不飽和度高,具有降血脂、軟化血管、抑制冠心病和血栓形成等功能,是優(yōu)質(zhì)的食用資源。

表 3 中華絨螯蟹肌肉中脂肪酸含量與百分比(n=5)

3 結(jié)論

本研究建立了測定中華絨螯蟹肌肉中總脂肪酸組成的氣相色譜分析方法。該方法測得中華絨螯蟹肌肉中31種脂肪酸,其中DHA、EPA等為中華絨螯蟹肌肉中主要脂肪酸。該方法操作簡便,定性可靠,定量準(zhǔn)確,能夠反映中華絨螯蟹肌肉中豐富多樣的脂肪酸組成與含量,具有一定的優(yōu)越性。