張文華, 洪 燈, 雷美康, 胡曉莉, 侯建波, 謝 文, 徐敦明, 伊雄海, 李 優(yōu)

(1. 杭州海關(guān)技術(shù)中心, 浙江 杭州 310016; 2. 浙江省檢驗檢疫科學(xué)技術(shù)研究院, 浙江 杭州 310016; 3. 廈門海關(guān)技術(shù)中心, 福建 廈門 361026; 4. 上海海關(guān)動植物與食品檢驗檢疫技術(shù)中心, 上海 200135)

克倫特羅(clenbuterol),化學(xué)名為1-(4-氨基-3,5-二氯苯基)-2-(叔丁基-D9-氨基)乙醇,是一種選擇性β2-腎上腺素受體激動劑,臨床上主要作為支氣管解痙藥物,對支氣管哮喘和伴有可逆性氣道阻塞的慢性支氣管炎均有良好效果[1]。臨床上使用的β2腎上腺受體類激動劑藥物為克倫特羅的外消旋體[2],其分子中含有1個手性碳原子[3],存在一對對映體,包括(+)-克倫特羅對映體和(-)-克倫特羅對映體(見圖1)。據(jù)文獻(xiàn)[4,5]報道,不同結(jié)構(gòu)對映體將會產(chǎn)生不同的藥理活性。研究發(fā)現(xiàn),克倫特羅外消旋體中不同結(jié)構(gòu)對映體之間的生物活性差異較大,其中(-)-克倫特羅在臨床上有療效,而(+)-克倫特羅則無療效,故對克倫特羅的手性分離具有重要意義[6,7]。為了進(jìn)一步研究克倫特羅對映體之間的生物活性差異,迫切需要建立一種克倫特羅對映體的高效分離方法。

圖 1 克倫特羅兩種對映體的結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structures of two clenbuterol enantiomers

目前克倫特羅對映體的檢測方法主要為高效液相色譜法(HPLC)[8,9]、毛細(xì)管電泳法[2,10]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11-14]等。其中HPLC分離度好,但有機(jī)試劑消耗量大;毛細(xì)管電泳法峰形良好,但分析時間長;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法準(zhǔn)確性高,但是儀器昂貴、成本高。近年來超高效合相色譜技術(shù)(UPC2)受到了廣泛關(guān)注,該技術(shù)以超臨界二氧化碳為流動相主體,依靠流動相的溶劑化能力來進(jìn)行分離、分析,并通過精確調(diào)節(jié)流動相比例、色譜柱溫度和系統(tǒng)背壓來精準(zhǔn)調(diào)控待測物手性化合物的保留時間和分離度[15]。超臨界流體為流動相使得UPC2的分離分析能力克服了氣相色譜法(GC)和HPLC的不足之處,既能分析不適用于GC的高沸點、低揮發(fā)、遇熱不穩(wěn)定的樣品,又能提高HPLC的分析速度和柱效。研究表明,UPC2技術(shù)更適合于分析傳統(tǒng)液相色譜難以處理的結(jié)構(gòu)類似物和同分異構(gòu)體,已被成功應(yīng)用于三唑類農(nóng)藥[16]、酚酸類化合物[17]、色素[18]、酚類精油[19]等化合物的拆分和測定。目前,UPC2技術(shù)應(yīng)用于克倫特羅對映體的拆分及含量測定未見有報道。

本研究建立了超高效合相色譜法拆分和測定克倫特羅對映體的方法。實驗考察了兩種克倫特羅對映體標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性,優(yōu)化了克倫特羅對映體的色譜分離條件,對所采購的克倫特羅外消旋體標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了拆分及測定。

1 實驗部分

1.1 儀器、材料與試劑

Acquity超高效合相色譜儀(美國Waters公司,帶有二極管陣列(PDA)檢測器); AE260電子天平(瑞士Mettler公司); R215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司); ELGA CLXXXUVM2超純水凈化系統(tǒng)(英國Elga公司); MS2渦旋混勻器(上海醫(yī)大儀器廠); N-EVAPTM111氮吹儀(日本東京理化公司)。

乙腈、甲醇、甲酸、乙醇、異丙醇、正庚烷(色譜純,西班牙Scharlau公司);醋酸銨、氨水(優(yōu)級純);超純水;高純二氧化碳(99.999%);其他實驗所用試劑除特殊說明外均為分析純。

克倫特羅外消旋體標(biāo)準(zhǔn)品(CAS號:129138-58-5,純度≥98.0%, BePure公司)。兩種克倫特羅對映體標(biāo)準(zhǔn)品:(+)-克倫特羅、(-)-克倫特羅由上海勤路生物技術(shù)有限公司從克倫特羅外消旋體標(biāo)準(zhǔn)品(BePure公司)中分離純化獲得,純度均大于98.0%。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)儲備液及工作液的配制

1.2.1外消旋體標(biāo)準(zhǔn)儲備液

準(zhǔn)確稱取0.01 g(精確至0.1 mg)克倫特羅外消旋體標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇溶解并定容至10 mL,配成1.0 g/L的外消旋體標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

克倫特羅外消旋體的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液:準(zhǔn)確吸取一定量的外消旋體標(biāo)準(zhǔn)儲備液,用乙腈稀釋至10.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。

1.2.2對映體標(biāo)準(zhǔn)儲備液

分別準(zhǔn)確稱取0.01 g(精確至0.1 mg)(+)-克倫特羅和(-)-克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇溶解并定容至10 mL,配成1.0 g/L的對映體標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

兩種克倫特羅對映體的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:分別準(zhǔn)確吸取一定量的(+)-克倫特羅和(-)-克倫特羅對映體標(biāo)準(zhǔn)儲備液,用乙腈逐級稀釋至1.0、2.0、4.0、10.0、20.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 分析條件

色譜柱:Acquity Trefoil AMY1 (150 mm×3.0 mm, 2.5 μm);流動相:A為CO2, B為含0.5%(v/v) 10 mol/L醋酸銨的甲醇溶液;梯度洗脫程序:0～2.0 min, 7%B; 2.0～2.1 min, 7%B～18%B; 2.1～4.25 min, 18%B; 4.25～4.3 min, 18%B～7%B; 4.3～6.3 min, 7%B。系統(tǒng)背壓:13.8 MPa;流速:2.0 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL;柱溫:40 ℃;檢測波長:241 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的選擇

通過PDA檢測器掃描后,從色譜圖上提取克倫特羅對映體標(biāo)準(zhǔn)溶液的紫外光譜圖。如圖2所示,在209、241、296 nm處均有明顯的吸收峰,其中209 nm處的吸收最強,靈敏度相對較高,但在該波長下克倫特羅對映體出峰處雜質(zhì)干擾峰較多;241 nm處吸收較強,克倫特羅對映體出峰處干擾峰較少。綜合考慮,對克倫特羅藥品檢測而言,用吸光度較高且雜質(zhì)較少的241 nm波長檢測更具有優(yōu)勢,故本實驗選擇241 nm作為檢測波長。

圖 2 克侖特羅對映體標(biāo)準(zhǔn)溶液的光譜圖Fig. 2 Spectra of the standard solution of clenbuterol enantiomers

2.2 色譜柱的優(yōu)化

基于直鏈淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)與纖維素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)的手性固定相是應(yīng)用最為廣泛的兩類固定相,具有良好的手性識別能力和拆分能力,在手性識別能力方面互為補充[20]。本實驗選擇美國Waters公司的Acquity Trefoil CEL2 (150 mm×3.0 mm, 2.5 μm,填料為纖維素-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯))、Acquity Trefoil AMY1(150 mm×3.0 mm, 2.5 μm,填料為直鏈淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯))、Acquity Trefoil CEL1(150 mm×3.0 mm, 2.5 μm,纖維素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯))和大賽璐藥物手性技術(shù)(上海)有限公司的多糖衍生物耐溶劑型手性色譜柱CHIRALPAK IA-3(100 mm×4.6 mm, 3 μm,硅膠表面共價鍵合有直鏈淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯))、纖維素衍生物正相手性柱CHIRALPAK OJ-H(100 mm×4.6 mm, 5 μm,表面涂敷了手性多聚物(直鏈淀粉或纖維衍生物)的球形硅膠)共5種手性分離色譜柱對兩種克倫特羅對映體的拆分效果進(jìn)行考察。結(jié)果表明,采用OJ-H和CEL1手性色譜柱分離時,兩種克倫特羅對映體未能實現(xiàn)完全分離;采用CEL2和IA-3手性色譜柱分離時,分離度良好,但色譜峰形展寬明顯;而采用AMY1手性色譜柱分離時,分離度良好,且色譜峰形尖銳(見圖3),其拆分機(jī)理為克倫特羅對映體的官能團(tuán)與固定相上的手性空腔相互作用,通過“三點作用”方式[21]進(jìn)行手性識別,兩個對映體與固定相的作用力有差異,使得保留時間不同。AMY1手性固定相分子中的位阻基團(tuán)與(+)-克倫特羅對映體分子中的直鏈氨基烷基之間形成了強烈的位阻作用,導(dǎo)致兩者手性識別所需的分子間作用力被阻礙,其在手性固定相上的有效吸附也相應(yīng)被減弱,故(+)-克倫特羅對映體分子被流動相優(yōu)先洗脫而先出峰;而(-)-克倫特羅對映體分子具有適宜的空間構(gòu)型,如圖1結(jié)構(gòu)式所示,羥基無明顯的位阻效應(yīng),能容易與固定相的酯基形成氫鍵作用力,有利于產(chǎn)生“三點作用”,保留時間延長,因而可被拆分。OJ-H、CEL1和AMY1的固定相填料不同,在超臨界CO2-0.5%(v/v) 10 mol/L醋酸銨甲醇溶液流動相體系中,兩個克倫特羅對映體在OJ-H和CEL1柱上未達(dá)到基線分離;AMY1和IA-3的固定相相同,但AMY1固定相的內(nèi)徑和填料粒徑比IA-3小,故色譜峰形更尖銳。因此本實驗選擇AMY1手性色譜柱對克倫特羅對映體進(jìn)行分離。

圖 3 不同色譜柱對(+)-克倫特羅和(-)-克倫特羅分離效果的影響Fig. 3 Effect of different chromatographic columns on the separation of (+)-clenbuterol and (-)-clenbuterol

2.3 流動相中助溶劑的選擇

超高效合相色譜的有機(jī)溶劑消耗量少,采用超臨界CO2為主要流動相,通常使用少量有機(jī)溶劑作為助溶劑,以加強對目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫能力和選擇性。本實驗考察了0.5%(v/v)甲酸甲醇溶液、0.5%(v/v) 10 mol/L醋酸銨甲醇溶液、0.5%(v/v)氨水甲醇溶液等不同助溶劑對兩種克倫特羅對映體分離的影響。結(jié)果顯示,當(dāng)使用0.5%(v/v)甲酸甲醇溶液作為助溶劑時,兩種克倫特羅對映體未能出峰;當(dāng)使用0.5%(v/v) 10 mol/L醋酸銨甲醇溶液和0.5%(v/v)氨水甲醇溶液作為助溶劑時,兩種克倫特羅對映體的色譜峰均在4.0 min內(nèi)實現(xiàn)了完全分離,但0.5%(v/v)氨水甲醇溶液助溶劑時,兩個對映體色譜峰的信噪比(S/N)分別為28和20, 0.5%(v/v) 10 mol/L醋酸銨甲醇溶液作為助溶劑時,兩個對映體色譜峰的信噪比(S/N)分別為35和26(見圖4)。因此,本實驗室選擇0.5%(v/v) 10 mol/L醋酸銨甲醇溶液作為助溶劑。

圖 4 不同助溶劑對(+)-克倫特羅和(-)-克倫特羅分離效果的影響Fig. 4 Effect of different organic solvent mobile phases on separation of (+)-clenbuterol and (-)-clenbuterol

2.4 系統(tǒng)背壓的選擇

UPC2采用超臨界狀態(tài)CO2作為流動相,通過調(diào)整系統(tǒng)背壓和溫度可有效改變CO2的密度,從而改變其對物質(zhì)的溶解能力、洗脫能力和選擇性。由于CO2的溫度超過31 ℃且壓力超過7.38 MPa以上,CO2才會進(jìn)入超臨界狀態(tài)。因此本實驗以0.5%(v/v) 10 mol/L醋酸銨甲醇溶液作為助溶劑,在柱溫40 ℃條件下考察系統(tǒng)背壓在10.3～20.7 MPa范圍內(nèi)對兩種克倫特羅對映體分離的影響。結(jié)果顯示,隨著系統(tǒng)背壓的升高,分析物的保留時間提前(見圖5)。4種條件下,兩種克倫特羅對映體的分離度分別為1.7、1.8、1.6、1.5，在系統(tǒng)背壓為13.8 MPa時的色譜峰分離度達(dá)到最佳，故本研究選擇背壓為13.8 MPa。

圖 5 不同系統(tǒng)背壓對(+)-克倫特羅和(-)-克倫特羅對映體分離效果的影響Fig. 5 Effect of different system backpressure on the separation of (+)-clenbuterol and (-)-clenbuterol

2.5 色譜柱溫度的選擇

在UPC2系統(tǒng)中,色譜柱溫度主要通過影響流動相密度,從而影響對目標(biāo)物的分離效果。隨著色譜柱溫度升高,CO2超臨界流體的黏度降低,密度減小,對目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫能力也隨之減小,保留時間延長?？紤]到Acquity Trefoil AMY1手性色譜柱的最高推薦運行溫度為40 ℃, CO2的溫度超過31 ℃且壓力超過7.38 MPa以上,CO2才會進(jìn)入超臨界狀態(tài)。因此本實驗考察了色譜柱溫在31～40 ℃范圍內(nèi)對克倫特羅對映體分離的影響。結(jié)果表明,隨著柱溫升高,目標(biāo)物的保留時間逐漸延長(見圖6)。3種柱溫條件下,兩種克倫特羅對映體的分離度分別為1.3、1.5、1.7，在柱溫為40 ℃時的色譜峰分離度達(dá)到最佳,4.0 min內(nèi)實現(xiàn)良好的基線分離,分析速度快。因此,選擇最佳色譜柱溫度為40 ℃。

圖 6 不同色譜柱溫度對(+)-克倫特羅和(-)-克倫特羅分離效果的影響Fig. 6 Effect of different column temperatures on the separation of (+)-clenbuterol and (-)-clenbuterol

2.6 定容試劑的選擇

使用5種定容試劑:甲醇、乙醇、乙腈、異丙醇、正庚烷對10 mg/L的克倫特羅對映體進(jìn)行拆分,結(jié)果如圖7所示,當(dāng)用甲醇作為定容試劑時,目標(biāo)峰中包含雜質(zhì)峰;當(dāng)用乙醇作為定容試劑時,目標(biāo)物峰形較差;當(dāng)用乙腈、異丙醇和正庚烷作為定容試劑時,兩種克倫特羅對映體的色譜峰均在4.0 min內(nèi)實現(xiàn)了完全分離,但相比異丙醇和正庚烷兩種定容試劑,乙腈作為定容試劑時,目標(biāo)物的色譜峰分離度更好,峰形更尖銳。因此,最后確定乙腈為本實驗定容試劑。

圖 7 不同定溶試劑對(+)-克倫特羅和(-)-克倫特羅分離效果的影響Fig. 7 Effect of different constant volume reagents on the separation of (+)-clenbuterol and (-)-clenbuterol

2.7 方法學(xué)考察

2.7.1線性范圍和靈敏度

將(+)-克倫特羅和(-)-克倫特羅的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按上述色譜條件進(jìn)行測定。以標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積(Y)為縱坐標(biāo),對應(yīng)質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,求得回歸方程和相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明,兩種克倫特羅對映體在1.0～20.0 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)大于0.999 7。當(dāng)信噪比為3(S/N=3)時,兩種克倫特羅對映體的儀器檢出限(LOD)分析結(jié)果見表1。

表 1 克倫特羅對映體的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

2.7.2精密度

取10.0 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,重復(fù)進(jìn)樣6次,按1.3節(jié)色譜條件進(jìn)行測定,計算結(jié)果表明(+)、(-)-克倫特羅對映體峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD,n=6)分別為0.65%和0.76%,該測定方法的精密度符合GB/T 32465-2015[22]的要求,能夠滿足克倫特羅對映體的拆分和測定要求。

2.8 克倫特羅對映體標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性的考察

分別準(zhǔn)確移取1.0 mL的10 mg/L克倫特羅對映體的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液于7個帶劃痕的1.5 mL UPC2專用進(jìn)樣小瓶中,上機(jī)進(jìn)行測定,檢測后再轉(zhuǎn)移至7個帶鋁蓋密封的進(jìn)樣小瓶中,并用封口膜封好后于-18 ℃下保存放置。將新配制的質(zhì)量濃度為10.0 mg/L的兩種克倫特羅對映體標(biāo)準(zhǔn)溶液,與分別儲存1、3、5、7、14、30、60天后的10.0 mg/L克倫特羅對映體的測定結(jié)果作圖比較,以新配制標(biāo)準(zhǔn)溶液作為100%,克倫特羅對映體標(biāo)準(zhǔn)溶液變化小于10%作為基準(zhǔn)。結(jié)果顯示,兩種克倫特羅對映體測定結(jié)果都是呈逐漸降低趨勢(見圖8),其中兩種克倫特羅對映體于-18 ℃下放置60天時含量降低了20%以上,放置30天時含量變化小于10%,而放置7天時含量變化小于5%,表明兩種克倫特羅對映體在30天內(nèi)比較穩(wěn)定。

圖 8 (+)-克倫特羅和(-)-克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液60天內(nèi)的 穩(wěn)定性考察(乙腈溶液)Fig. 8 Stability test for (+)-clenbuterol and (-)- clenbuterol in acetonitrile during 60 d

圖 9 克倫特羅外消旋體的拆分Fig. 9 Separation of standard clenbuterol racemate

2.9 方法的應(yīng)用

采用本文建立的方法對所采購的克倫特羅外消旋體標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行拆分及測定。如圖9所示,兩種克倫特羅對映體的分離效果良好,在4.0 min內(nèi)實現(xiàn)了有效拆分,分離度為1.7,符合R≥1.5完全分離的要求[23]。按照色譜峰的保留時間順序,依次為(+)-克倫特羅、(-)-克倫特羅。根據(jù)上述所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線,采用外標(biāo)定量法計算1.2.1節(jié)中克倫特羅外消旋體標(biāo)準(zhǔn)中間溶液10.0 mg/L的兩種克倫特羅對映體含量,其中(+)-克倫特羅的含量為5.6 mg/L, (-)-克倫特羅的含量為5.5 mg/L。計算結(jié)果與文獻(xiàn)[12]報道的工業(yè)品克倫特羅外消旋體中(+)-克倫特羅與(-)-克倫特羅的比例為1.02∶1.00基本相符。

3 結(jié)論

本文采用超高效合相色譜技術(shù)對克倫特羅對映體進(jìn)行分離,考察了手性色譜柱、助溶劑、系統(tǒng)背壓、柱溫、定容試劑對克倫特羅對映體分離的影響,最終確定分離條件為:手性色譜柱為Acquity Trefoil AMY1 (150 mm×3.0 mm, 2.5 μm),助溶劑為0.5%(v/v) 10 mol/L醋酸銨甲醇溶液,流速為2.0 mL/min,檢測波長241 nm,柱溫40 ℃,系統(tǒng)背壓為13.8 MPa。最佳實驗條件下的運行時間僅為4.0 min,能夠?qū)崿F(xiàn)對克倫特羅對映體的基線分離,為其他手性化合物的拆分、藥效精細(xì)分析和產(chǎn)品質(zhì)量評定提供了可靠的技術(shù)支持。