畢月玲, 許 桐, 陳利琴,3*

(1. 天津市西青醫(yī)院藥劑科, 天津 300380; 2. 天津醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理與衛(wèi)生化學(xué)教研室, 天津 300070; 3. 天津市環(huán)境營養(yǎng)與人群健康重點實驗室, 天津 300070)

神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤是一類伴隨著兒茶酚胺類(CAs)物質(zhì)大量分泌的疾病[1]。由于兒茶酚胺類物質(zhì)在人體內(nèi)各種生理活動和免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)方面起到非常重要的作用,所以這類物質(zhì)除了能作為診斷神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤疾病的生物標(biāo)志物外,還與多種神經(jīng)系統(tǒng)和自身免疫性疾病有關(guān),例如阿爾茨海默病、抑郁癥、注意力缺陷多動障礙(ADHD)、精神分裂癥、帕金森病、焦慮和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等[2-4]。因此,生物樣本中這些分析物的測定對于支持疾病監(jiān)測和新的治療藥物開發(fā)具有重要的臨床意義。然而,生物樣本中兒茶酚胺類物質(zhì)含量極低,且其他內(nèi)源性物質(zhì)干擾測定,所以生物樣本中的此類痕量物質(zhì)分析往往面臨著巨大的困難,目標(biāo)物信號常常要么達(dá)不到儀器的檢出限,要么淹沒在復(fù)雜浩瀚的干擾物質(zhì)信號當(dāng)中。

兒茶酚胺類物質(zhì)主要包括腎上腺素(E)、去甲腎上腺素(NE)和多巴胺(DA)。另一種神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺(5-HT)也是近年來研究中使用較多的一類指標(biāo)[5,6]。這一類物質(zhì)化學(xué)極性強,在通常的C18等疏水性的固相介質(zhì)上幾乎無保留,所以說這類物質(zhì)的前處理是極具挑戰(zhàn)性的一類工作。而傳統(tǒng)的此類物質(zhì)樣品前處理方法一般都采用離線操作的方式進行,耗時費力且易造成損耗誤差,導(dǎo)致樣品前處理方法成為整個樣本分析流程的瓶頸問題[7]。而在線樣品前處理與高效色譜檢測方法聯(lián)用能夠為解決此瓶頸問題提供方法和思路,此聯(lián)用方法不僅可以減輕技術(shù)人員的勞動強度,實現(xiàn)分析過程高度自動化,節(jié)約分析成本;更主要的是可以減少甚至消除由于手工操作中個體差異所產(chǎn)生的誤差,提高分析測試的靈敏度、準(zhǔn)確度與重現(xiàn)性[8]。再者,在線樣品前處理和檢測聯(lián)用方式更容易實現(xiàn)試劑無毒化操作,減少對操作人員及環(huán)境的危害,從而促進綠色化學(xué)的發(fā)展。在線樣品前處理與高效色譜檢測方法聯(lián)用在具備多種檢測分析優(yōu)勢的基礎(chǔ)上,還能提高分析樣品的檢測通量,近年來在樣本分析領(lǐng)域得到了廣泛的發(fā)展應(yīng)用[9,10]。

基于電紡納米纖維固相萃取(packed-fiber solid phase extraction, PFSPE)的技術(shù)正在蓬勃發(fā)展,其核心是以納米纖維取代通行的顆粒狀微米級固相吸附材料進行樣品前處理。其可以針對待捕集目標(biāo)分子的理化性質(zhì),用高壓電紡技術(shù)紡制與之有選擇性相互作用的納米纖維,從而為建立極性分子的在線固相萃取分析平臺奠定基礎(chǔ)[11,12]。本文在已有研究基礎(chǔ)[13]上,將PFSPE技術(shù)引入在線樣品前處理體系,并拓寬分析目標(biāo)物質(zhì),開發(fā)在線樣品前處理方法。本研究只用普通的HPLC-FLD系統(tǒng)外加一個切換閥就可以同時實現(xiàn)NE、E、DA以及5-HT的在線前處理與分離檢測,不僅能為神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤標(biāo)志物的準(zhǔn)確、靈敏檢測提供更為高效的在線樣品前處理檢測體系,還可以拓寬在線樣品前處理技術(shù)的應(yīng)用范圍。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

UltiMate3000雙三元高效液相色譜儀、FLD-3100熒光檢測器、Chromeleon 7.2 SR5色譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)(美國Thermo Scientific公司)。DW-P403-1AC高壓電源(天津東文高壓電源廠),微量注射泵WZ-50C6(浙江史密斯醫(yī)學(xué)儀器有限公司), 1-14小型臺式離心機(美國Sigma-Aldrich公司), Milli-Q Integral超純水系統(tǒng)(法國密理博公司)。

NE、E、DA、5-HT、3,4-二羥基苯乙胺氫溴酸(DHBA)、二苯硼酸2-氨基乙基酯(DPBA)均購自美國Sigma-Aldrich公司。甲醇、乙腈、冰乙酸(色譜純,天津市康科德科技有限公司),聚苯乙烯(PS,相對分子質(zhì)量1.8×105,上?；瘜W(xué)試劑研究所),二苯并-18-冠-6醚(天津希恩思生化科技有限公司)。二苯并-18-冠-6醚聚合物樹脂冠醚(PCE)由天津醫(yī)科大學(xué)衛(wèi)生化學(xué)實驗室合成提供。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)樣品制備和尿液樣本處理

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:分別配制加超純水溶解的1.0 mg/mL的NE、E、DA以及5-HT的母液(E標(biāo)準(zhǔn)品需先用30 μL 0.1 mol/L鹽酸溶解),再吸取各母液適量,充分混勻配制成100 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,密封、避免光照、于冰箱-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

內(nèi)標(biāo)(IS)溶液:取內(nèi)標(biāo)物質(zhì)DHBA適量,加入超純水溶解,配制成1.0 mg/mL的IS儲備液,密封、避免光照、于冰箱中-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

DPBA溶液:取DPBA適量加水配制成2.0 mg/mL溶液以備后用。

磷酸鹽緩沖液(PBS):先配制0.2 mol/L的NaH2PO3水溶液和Na2HPO3水溶液,二者按61∶39、81∶19、183∶17、947∶53的體積比分別混合,對應(yīng)緩沖液的pH分別為7.0、7.4、7.8和8.0。

人工尿液(AU):參考文獻[14]中的配比進行人工尿液的配制,尿酸的加入量參考文獻[15],得到尿酸溶解完全的人工尿液。

尿液樣本:新鮮收集的尿液采用0.22 μm的水膜過濾,再加入等體積的PBS(pH 7.8)與之混勻。

1.3 聚冠醚復(fù)合納米纖維的制備

參考文獻[11]制備聚合冠醚復(fù)合納米纖維。取3.6 g(0.01 mol)二苯并-18-冠-6醚溶于20 mL甲酸溶液中;在三口燒瓶中加入0.6 g多聚甲醛,加入20 mL甲酸,加熱(50 ℃)攪拌使其溶解,然后將配好的20 mL二苯并-18-冠-6醚的甲酸溶液經(jīng)恒壓漏斗緩慢滴加到三口燒瓶中,保持50 ℃繼續(xù)攪拌4～5 h,觀察有絮狀物析出,室溫下繼續(xù)攪拌約20 h,有棕灰色固體沉淀產(chǎn)生,抽濾固體,用30 mL蒸餾水反復(fù)洗滌2～3次,置于送風(fēng)干燥箱中徹底烘干,得到固體產(chǎn)品即為聚合冠醚。

靜電紡絲過程如下:配制5%(v/v)PCE的二甲基亞砜(DMSO)溶液和15%(v/v)聚苯乙烯(PS)的二甲基甲酰胺-四氫呋喃(DMF-THF, 4∶6, v/v)溶液,將兩種溶液按照4∶10(v/v)混勻作為紡絲前體溶液。將該溶液裝入玻璃注射器中,其不銹鋼針頭與高壓電源的陽極相連,鋁箔收集設(shè)備與高壓電源的陰極相連,二者距離為15 cm,電壓為20 kV,進液速率為2.0 mL/h, PCE-PS溶液在高壓電場下噴射形成復(fù)合納米纖維。

1.4 PFSPE柱的制備

采用不銹鋼細(xì)棒(直徑為0.5 mm)將適量PCE-PS復(fù)合納米纖維約10 mg分次填充于金屬柱筒(10 mm×2.1 mm)中,壓緊填實,裝上兩端篩板后放入外套管中組裝。將組裝好的PFSPE柱與UltiMate3000高效液相色譜儀相連接。

1.5 PFSPE-HPLC在線聯(lián)用程序

采用儀器自帶的雙位十通切換閥設(shè)計了PFSPE-HPLC在線聯(lián)用的程序,該程序分為3部分:(1)樣品富集過程(見圖1a),樣品經(jīng)自動進樣器注入PFSPE柱中進行富集凈化;(2)樣品洗脫轉(zhuǎn)移過程(見圖1b),通過切換十通閥的閥位至2-1,樣品被洗脫液洗脫,轉(zhuǎn)移到分析柱中;(3)樣品分析過程(見圖1a),閥位再次切換回10-1,在分析柱中進行目標(biāo)物的分離和檢測,同時PFSPE柱再平衡,預(yù)備下針進樣。程序的總運行時間為16.00 min。

圖 1 PFSPE-HPLC在線聯(lián)用程序設(shè)計示意圖Fig. 1 Schematic diagram of PFSPE-HPLC online program design

1.6 色譜條件

色譜柱選用YMC-Pack pro C18色譜柱(100 mm×3.0 mm, 5 μm);柱溫設(shè)為35 ℃;熒光檢測器的激發(fā)波長(λex)設(shè)為286 nm,發(fā)射波長(λem)設(shè)為318 nm;流動相A:準(zhǔn)確稱量0.45 g庚烷磺酸鈉、7.6 g檸檬酸、7.3 g磷酸二氫鈉、0.1 g EDTA、1.9 g氫氧化鈉于燒杯中,再加入55 mL乙腈,用超純水定容至1 L,充分混勻,抽濾,超聲脫氣10 min,此時溶液的pH為4.15;流動相B: 1 mol/L冰醋酸;流速設(shè)為0.5 mL/min;進樣量為100 μL。最佳梯度洗脫時間程序方法見表1。

表 1 最佳梯度洗脫時間程序方法

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用人工尿液配制1、5、10、20、50、100、200 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)混合溶液(其中IS的質(zhì)量濃度均為25 ng/mL),依次注入PFSPE-HPLC在線聯(lián)用系統(tǒng)中,測定各個質(zhì)量濃度下的各目標(biāo)物峰面積。以質(zhì)量濃度X(ng/mL)為橫坐標(biāo),各目標(biāo)物與IS的峰面積比值Y為縱坐標(biāo),分別繪制NE、E、DA和5-HT的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 加標(biāo)回收率試驗

采用人工尿液加標(biāo)以及健康人尿液測試基底值后加標(biāo)進行加標(biāo)回收率試驗。

尿液基質(zhì):吸取0.5 mL人工尿液或?qū)嶋H尿液,按照體積比1∶1加入pH 7.8的PBS后,再加入2.5 μg/mL的IS溶液10 μL和2.0 mg/mL DPBA溶液50 μL,混勻。

人工尿液加標(biāo)分為低、中、高3個水平(10、50、100 ng/mL)。吸取0.5 mL人工尿液,按照體積比1∶1加入pH 7.8的PBS后,分別加入10 μL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(1、5、10 μg/mL),再加入2.5 μg/mL的IS溶液10 μL和2.0 mg/mL DPBA溶液50 μL,混勻。

實際尿液加標(biāo)100 ng/mL。吸取0.5 mL尿液,按照體積比1∶1加入pH 7.8的PBS后,加入10 μL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 μg/mL),再加入2.5 μg/mL的IS溶液10 μL和2.0 mg/mL DPBA溶液50 μL,混勻。

分別取人工尿液和實際尿液基質(zhì)及其加標(biāo)溶液各100 μL進樣分析,記錄各峰面積。計算加標(biāo)回收率:加標(biāo)回收率=(測定值-基質(zhì)本底值)/加標(biāo)水平×100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 PFSPE-HPLC在線聯(lián)用程序的優(yōu)化

PFSPE-HPLC在線聯(lián)用程序的重要操作參數(shù)是流速、流動相梯度,以及富集、轉(zhuǎn)移時間、分析和平衡時間。如果富集時間過短,會導(dǎo)致目標(biāo)物質(zhì)沒有吸附充分,過長會導(dǎo)致不必要的運行時間。轉(zhuǎn)移時間過短會導(dǎo)致目標(biāo)物質(zhì)沒有充分轉(zhuǎn)移。分析時間過短則會造成目標(biāo)物質(zhì)不能全部出峰,過長也會導(dǎo)致運行時間過長。凈化平衡時間過短也會造成PFSPE柱和分析柱未平衡完全。此外,色譜柱的填料、粒度、內(nèi)徑及柱長等都會影響其柱效,進而影響分離度及靈敏度等。因此,本實驗對以上影響因素都進行了優(yōu)化,最終優(yōu)化的條件見1.5、1.6節(jié),NE、E、DA、5-HT和IS的分離色譜圖如圖2所示,在此優(yōu)化條件下,雜質(zhì)峰較少,基線較為平穩(wěn),分離較充分,有利于準(zhǔn)確的定性定量分析。

圖 2 最佳梯度洗脫時間程序方法下的100 ng/mL NE、E、 DA、5-HT和IS標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)混合水標(biāo)液分離色譜圖Fig. 2 Separation chromatograms of 100 ng/mL NE, E, DA, 5-HT and IS mixed standard solution dissolved in water under optimal gradient elution time program method NE: norepinephrine; E: epinephrine; IS: internal standard, 3,4-dihydroxybenzylamine hydrobromide; DA: dopamine; 5-HT: serotonin.

2.2 絡(luò)合劑DPBA加入量的影響

由于DPBA和兒茶酚胺基團之間存在可逆的絡(luò)合作用[5,16],而絡(luò)合反應(yīng)產(chǎn)物可以提高在PFSPE柱上的吸附效率,所以本試驗測試了DPBA加入量對分析物的檢測影響。采用人工尿液配制加標(biāo)溶液1 mL(NE、E、DA和5-HT的質(zhì)量濃度為100 ng/mL, IS為25 ng/mL),加入不同體積的DPBA(2 mg/mL)。從圖3可知,DPBA的加入對于CAs的作用非常明顯,而對5-HT的作用有限?？傮w而言,加入量為50 μL的條件下,各目標(biāo)物質(zhì)的峰面積最高,說明此條件為DPBA的最佳加入量。因此后續(xù)實驗都采取此條件,加入50 μL DPBA。

圖 3 絡(luò)合試劑DPBA(2 mg/mL)加入量對分析物 提取效果的影響(n=3)Fig. 3 Effect of the amount of complexing agent diphenylborinic acid 2-aminoethyl ester (DPBA, 2 mg/mL)on extraction of analytes (n=3)

2.3 PBS的影響

在普通膳食條件下,正常人的尿液偏酸性,pH均值保持在6.3左右[17]。由于DPBA絡(luò)合實驗需要在近中性條件下反應(yīng)為佳,所以采用PBS對尿液pH進行調(diào)節(jié)。本實驗測試了不同pH的PBS以及人工尿液與不同pH的PBS等體積混合溶液中的各分析物響應(yīng)值。如圖4所示,在單純PBS中,pH 7.0條件下各分析物的峰響應(yīng)值最大。而在人工尿液與PBS等體積混合的溶液中,pH 7.8條件下各分析物的峰響應(yīng)值最佳。此結(jié)果也說明采用一定量的PBS調(diào)節(jié)人工尿液的pH至近中性后,各分析物能夠得到較好的提取。

圖 4 PBS對分析物檢測的影響(n=3)Fig. 4 Influence of PBS on the detection of analytes (n=3)PBS: phosphate-buffered saline solution; AU: artificial urine.

此外,在4種體積比條件下混合人工尿液和pH 7.8的PBS,各分析物的峰響應(yīng)值差異較小,1∶1條件下各分析物的峰響應(yīng)值稍好于其他3種配比條件,說明此條件已達(dá)到最佳吸附pH條件,所以在后續(xù)的實驗中人工尿液或?qū)嶋H尿液的pH調(diào)節(jié)都采用pH 7.8的PBS等體積比混合。

2.4 PFSPE柱的穩(wěn)定性及重復(fù)使用次數(shù)

前期實驗中發(fā)現(xiàn),PFSPE柱經(jīng)上百次使用后,納米纖維只有略微的機械變形,直徑無顯著變化,納米結(jié)構(gòu)保持完整,可以重復(fù)使用[15]。本實驗對PFSPE柱的重復(fù)使用次數(shù)進行了統(tǒng)計,以進一步考察PFSPE柱的穩(wěn)定性。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),該PFSPE柱在PFSPE-HPLC系統(tǒng)中可以進行近200次CAs和5-HT的在線自動化富集和分析。取1.2節(jié)配制的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液加超純水稀釋至100 ng/mL(IS質(zhì)量濃度為25 ng/mL)進樣100 μL, NE、E、DA、5-HT及IS的峰面積及NE、E、DA、5-HT與IS的峰面積比隨使用次數(shù)的變化見圖5(統(tǒng)計到95次),圖中顯示出NE、E、DA及IS的峰面積均隨使用次數(shù)的增加先下降后上升,然后緩慢下降到一定水平,再在該水平的基礎(chǔ)上有長時間的小幅波動,最后又繼續(xù)下降。而5-HT的峰面積能夠在較長時間內(nèi)保持較好的穩(wěn)定性(5-HT和CAs類化學(xué)結(jié)構(gòu)有差異,所以變化趨勢有可能不一致)。這些都說明PFSPE柱具有一定的重復(fù)使用性和較好的穩(wěn)定性,可以在一定時間內(nèi)保持穩(wěn)定,建議使用過程中隨時采用標(biāo)準(zhǔn)溶液進行質(zhì)控,以保持對PFSPE性能的了解,確保標(biāo)準(zhǔn)溶液和實際尿液的測試條件盡量在較短時間內(nèi)保持一致,減少因PFSPE前處理柱的性能因素而導(dǎo)致的實驗誤差。

圖 5 PFSPE柱的重復(fù)使用次數(shù)對分析物檢測的影響(n=95)Fig. 5 Influence of reuse times of PFSPE column on the detection of analytes (n=95)

2.5 方法學(xué)

2.5.1標(biāo)準(zhǔn)曲線

本實驗采用內(nèi)標(biāo)法定量。在1～200 ng/mL的范圍內(nèi),NE、E、DA、5-HT的色譜峰清晰可見。以NE、E、DA、5-HT與IS的色譜峰面積比值(Y)對各單胺的質(zhì)量濃度(X)做線性回歸,結(jié)果顯示NE、E和DA在1～200 ng/mL之間呈線性,5-HT在5～200 ng/mL之間呈線性,且線性關(guān)系良好(相關(guān)系數(shù)r≥0.996)。檢出限為1 ng/mL (S/N=3, CAs)和2.5 ng/mL (S/N=3, 5-HT),定量限為2.5 ng/mL (S/N=10, CAs)和5 ng/mL (S/N=10, 5-HT)。NE、E、DA、5-HT的線性方程分別為:Y=0.008 9X+0.033 5 (NE,r=0.999 3),Y=0.007 3X+0.055 8(E,r=0.996 1),Y=0.013 6X+0.004 2(DA,r=0.999 7),Y=0.005 2X+0.003 0(5-HT,r=0.999 8)。

2.5.2加標(biāo)回收率

人工尿液和實際尿液加標(biāo)回收試驗結(jié)果見表2, NE、E、DA及5-HT的加標(biāo)回收率分別為87.0%～117.7%、87.6%～110.7%、83.5%～110.0%及98.7%～111.7%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于10%。回收率和精密度都符合測試要求,說明該檢測方法適用于尿液樣本中NE、E、DA及5-HT的定量分析。

表 2 人工尿液和實際尿液樣品的加標(biāo)回收率(n=6)

2.6 實際尿液樣本的檢測

取健康人的隨機尿中段尿1份,按照1.8小節(jié)項下的操作配成尿液基質(zhì),進樣100 μL,計算尿液基質(zhì)中NE、E、DA及5-HT對IS的峰面積比值,將峰面積比值代入到各分析物的標(biāo)準(zhǔn)曲線中求出尿液中NE、E、DA及5-HT的質(zhì)量濃度。

由圖6可知,實際尿液樣本中的NE、E、DA、5-HT經(jīng)PFSPE柱在線富集和凈化后能夠在HPLC-FLD系統(tǒng)中得到較好的分離與檢出,峰形優(yōu)良,與雜質(zhì)分離效果好,便于NE、E、DA及5-HT的定性定量分析。該方法中,樣品在線富集凈化及檢測所需的時間在16 min內(nèi),方便快捷、大大節(jié)省人力物力。實際尿液樣本中NE、E、DA和5-HT的質(zhì)量濃度分別為100.0、45.9、311.7和197.8 ng/mL。3種CAs和5-HT的含量范圍與文獻[18]報道中的數(shù)值范圍基本吻合,說明此方法能夠應(yīng)用于測定尿液中的NE、E、DA和5-HT的含量。

圖 6 檢測實際尿液的色譜圖Fig. 6 Chromatograms for the determination of actual urine

3 結(jié)論

本研究采用靜電紡絲法制備聚合冠醚復(fù)合納米纖維,將其作為SPE的吸附劑裝填固相萃取柱,同時選擇雙泵柱切換閥系統(tǒng),設(shè)計在線聯(lián)用程序,將PFSPE與HPLC-FLD進行在線聯(lián)用。該方法成功應(yīng)用于人體尿液中NE、E、DA及5-HT的檢測,能夠有效地富集目標(biāo)分析物和凈化尿液中的內(nèi)源性雜質(zhì),該方法加標(biāo)回收率高,精密度良好,在1～200 ng/mL范圍內(nèi)有著良好的線性。此外,聚冠醚復(fù)合納米纖維的穩(wěn)定性較好,10 mg裝填量的PFSPE柱可以重復(fù)使用近百次,相比離線操作一次使用2～3 mg,使用效率成百倍提高,大大節(jié)省物力。

總之,本研究建立的PFSPE-HPLC在線聯(lián)用方法是一種更簡便、有效、環(huán)境友好的檢測方法。該方法能夠集樣品前處理與分析檢測于一體,分析的自動化程度高,在很大程度上擴展了PFSPE樣品前處理技術(shù)的應(yīng)用。此外,該聚冠醚復(fù)合納米纖維可以重復(fù)使用,因此可長時間自動運行,實現(xiàn)大批量尿液中NE、E、DA及5-HT的在線自動化富集和分析。該方法展現(xiàn)出很大的臨床應(yīng)用前景,適用于臨床尿液樣本中NE、E、DA及5-HT的檢測,可以為相關(guān)疾病提供輔助診斷技術(shù)支持。