黃 蓉, 程 雷*, 肖雨詩, 曹 強(qiáng), 劉 娜, 陳世恒, 吳立冬

(1. 北京工商大學(xué), 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心, 食品營養(yǎng)與人類健康北京高精尖創(chuàng)新中心, 北京 100048; 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點實驗室, 北京 100141; 3. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306; 4. 中核集團(tuán)北京化工冶金研究院, 北京 101149)

為了增加食物的視覺美感,合成色素常常被添加到食品中。胭脂紅是一種色澤鮮艷的偶氮類色素,其在食品中的使用范圍和限量標(biāo)準(zhǔn)在GB 2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中有嚴(yán)格規(guī)定,飲料類食品中胭脂紅不能超過0.05 g/kg。但仍有不良商家為了追求利益而忽視這些標(biāo)準(zhǔn)。過量的偶氮類色素被人體攝入后,會對肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)造成危害,甚至?xí)黾影衅鞴僦禄?、致癌、致突變的風(fēng)險[1-3]。因此,建立一套簡單、高效的針對食品中胭脂紅含量的檢測體系,對食品質(zhì)量監(jiān)管及消費者身體健康有重大意義。

在建立檢測色素分析方法的過程中,研究者相繼開發(fā)出多種應(yīng)用于食品著色劑含量的成熟檢測手段,如薄層色譜法[4]、反向高效液相色譜法[5]、離子對液相色譜法[6]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7,8]。因為食品基質(zhì)較為復(fù)雜且色素含量一般較低,高效的前處理技術(shù)成為精確檢測的關(guān)鍵。目前,合成色素常用的前處理方法包括液液萃取[9,10]、固相萃取[11-13]、液相微萃取[14]、分子印跡固相萃取[15]等。其中固相萃取技術(shù)應(yīng)用最為廣泛,其發(fā)展與吸附劑的性能密切相關(guān)。金屬有機(jī)框架(MOFs)作為一種新型高效吸附劑逐漸受到廣泛關(guān)注[16-19]。MOFs是通過配位方式將金屬團(tuán)簇與有機(jī)配體相互連接的多孔配位晶體結(jié)構(gòu)。金屬有機(jī)框架具有分子尺寸的孔洞,使其在吸附、催化、藥物分散等不同領(lǐng)域有多種應(yīng)用[20-29]。但是MOFs材料在實際應(yīng)用中也存在一定局限性,例如超高的比表面積會導(dǎo)致MOFs材料本身質(zhì)量超輕,即使高速離心也很難收集[30],因此MOFs納米材料在實際應(yīng)用中受到一定限制，無法在各個領(lǐng)域廣泛推廣。

本工作將新型納米材料PCN-222應(yīng)用于固相萃取技術(shù)中,即合成的MOFs作為萃取劑添加到注射式固相萃取針筒內(nèi),利用材料同目標(biāo)物胭脂紅分子之間存在的靜電和π-π作用,實現(xiàn)瞬時性高效萃取。同時,PCN-222的可重復(fù)利用性可以減少其向環(huán)境中的排放次數(shù),以滿足綠色化學(xué)的要求。與廣泛應(yīng)用的液液萃取和固相萃取相比,本方法的開發(fā)節(jié)省了大量前處理時間和實驗成本,為食品安全快速檢測提供了高效的技術(shù)手段。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

JEM-2010透射電子顯微鏡(日本電子光學(xué)公司), Nicolet IS5傅里葉變換紅外分光光度計(美國賽默飛公司), SPECORD 200 PLUS紫外/可見分光光度計(德國耶拿公司), Zetasizer Nano ZS粒度分析儀(英國馬爾文科技公司), LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司)。

N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和苯甲酸(BA)購于上海阿拉丁試劑公司;四(4-羧苯基)卟啉(TCPP)和胭脂紅購于日本TCI試劑公司;八水氯化鋯(ZrOCl2·8H2O)購于北京InnoChem科技公司;氨水(NH3·H2O)和乙醇(C2H5OH)購于上海麥克林生化科技公司,甲醇購于上海安譜公司;18.2 MΩ·cm超純水通過Milli-Q(美國Millipore公司)超純水儀制得。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱取胭脂紅粉末10 mg,用水溶解后轉(zhuǎn)移至10 mL棕色容量瓶中,稀釋至刻度,得到1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于-4 ℃儲存,使用時用超純水梯度稀釋成質(zhì)量濃度分別為50、100、200、300、500、1 000、5 000、10 000 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 PCN-222的合成

取150 mg ZrOCl2·8H2O、2.8 g苯甲酸、50 mg TCPP和50 mL DMF溶液(含1%超純水,下同),置于圓底燒瓶中,經(jīng)2～3 min的超聲混勻后,轉(zhuǎn)移至90 ℃油浴鍋內(nèi)加熱攪拌4 h。最后,以13 000 r/min離心30 min，收集產(chǎn)物,用DMF溶液離心洗滌3次,然后再分散在甲醇中，得到深紫色產(chǎn)物PCN-222。

1.4 樣品前處理

取3 mg PCN-222作為萃取劑,加入到含有篩板的注射器中(如圖1所示),以甲醇為勻漿液通過濕法裝柱。預(yù)處理活化過程:5 mL甲醇活化,5 mL水淋洗后上樣。

圖 1 微型注射式固相萃取流程圖Fig. 1 Process scheme of microinjection SPE PCN-222: a kind of metal-organic framework, with the carboxyl group on the porphyrin ring and the metal zirconium coordination formed.

分別取1 mL飲料樣品,用超純水稀釋至4 mL,通過鹽酸調(diào)節(jié)樣品溶液pH值至3,然后將稀釋后的樣品加入到注射器中進(jìn)行上樣。通過壓力使目標(biāo)分析物流過并被截流在萃取劑上。加入3 mL洗脫液DMF溶液(用NH3·H2O調(diào)節(jié)pH值至11)。緩慢推動柱塞,使染料從吸附劑上解吸下來,收集洗脫液,于45 ℃氮氣吹干,然后用1 mL水復(fù)溶,用0.45 μm濾膜過濾后,供HPLC分析。

1.5 儀器條件

色譜柱:ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm);柱溫:40 ℃;流動相A:乙酸銨溶液(0.02 mol/L);流動相B:甲醇;流速:1 mL/min。梯度洗脫程序:0～3 min, 5%B～35%B; 3～7 min, 35%B～100%B; 7～10 min, 100%B; 10～15 min, 100%B～5%B。進(jìn)樣量:10 μL;檢測波長:254 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 PCN-222的表征

用透射電鏡觀察制備好的PCN-222的形貌(見圖2)。由TEM圖像可以看出,合成的MOFs材料為棒狀結(jié)構(gòu),是一種形貌均一的納米材料,沿長軸方向延伸。根據(jù)粒徑分布圖3a所示,所合成的大部分PCN-222粒徑分布在500～700 nm之間,這與透射電鏡圖所顯示的棒狀結(jié)構(gòu)的直徑大小基本吻合。

圖 2 PCN-222的透射電鏡圖Fig. 2 TEM images of PCN-222

對所合成的材料進(jìn)行紫外可見光譜分析,由圖3b可知，卟啉型MOFs的典型吸收峰。PCN-222的主吸收峰在435 nm, 4個Q帶吸收峰分別位于524、558、596和653 nm處。

通過紅外光譜進(jìn)一步分析樣品組成,結(jié)果如圖3c所示,在719.77、801.64和964.47 cm-1處存在卟啉環(huán)的伸縮振動峰;在1 019.35、1 418.01和1 603.33 cm-1處存在苯環(huán)骨架的吸收峰。

為了準(zhǔn)確分析樣品的晶體結(jié)構(gòu),進(jìn)一步對PCN-222進(jìn)行X射線衍射(XRD)表征(見圖3d)?？梢钥吹?所合成材料XRD曲線峰位置與模擬的PCN-222曲線峰位置可一一對應(yīng),表明晶體結(jié)構(gòu)完整。

對材料進(jìn)行N2吸附-脫附表征以驗證所合成的材料具備較強(qiáng)的吸附能力,材料的BET比表面積為979 m2/g,較大的比表面積適用于食品中痕量色素的吸附(見圖3e)。

Zeta電位可以對材料表面電荷情況進(jìn)行探究,以考察靜電作用對萃取性能的影響。如圖3f所示,隨溶液內(nèi)pH值變化，PCN-222表面電位逐漸發(fā)生變化,當(dāng)pH<6時,由于氫離子在材料表面積累而呈正電荷；當(dāng)pH>6時,MOFs表面整體呈負(fù)電荷,這是由于OH-在其表面積累。結(jié)果表明,所合成的材料具有較大的正負(fù)電位跨度,通過控制其pH值就可以促進(jìn)材料選擇性吸附和分離,證明其是一種具有電荷可調(diào)性的MOFs材料。

圖 3 PCN-222的(a)粒徑分布圖、(b)紫外可見光譜圖、(c)紅外光譜圖、(d)X射線晶體衍射圖、 (e)N2吸附/脫附曲線和(f)Zeta電位分布情況關(guān)系圖Fig. 3 (a) Particle size distribution, (b) UV spectrum, (c) FT-IR spectra, (d) X-ray crystal diffraction, (e) N2 adsorption/desorption curve and (f) Zeta potential distribution diagram of PCN-222DMF: N,N-dimethylformamide.

2.2 固相萃取條件優(yōu)化

為了確定PCN-222萃取劑對目標(biāo)物富集凈化的最佳條件,本工作對影響固相萃取效率的諸多因素進(jìn)行了考察,包括萃取劑用量、樣品pH值、洗脫劑種類和洗脫劑pH值等,考慮到樣品基質(zhì)的影響,選取在不含目標(biāo)物的加標(biāo)(10 mg/L)樣品基質(zhì)中進(jìn)行。

2.2.1萃取劑用量

合適的萃取劑用量在保證柱容量的同時還可以節(jié)約實驗成本。因此本工作首先對PCN-222吸附劑的用量進(jìn)行了探究,考察了萃取劑用量為1～4 mg時,吸附效率的變化(見圖4a所示)。結(jié)果表明,實驗初期隨著萃取劑用量的增加,胭脂紅的吸附率逐漸升高,當(dāng)用量超過3 mg后,吸附率基本不再變化。這是因為隨著萃取劑的增加,反應(yīng)體系內(nèi)的活性位點也逐漸增加,從而對目標(biāo)物的吸附能力有所提升。當(dāng)材料對目標(biāo)分析物的萃取達(dá)到飽和時,即使后期繼續(xù)增加萃取劑的用量,吸附率也不再發(fā)生變化。因此最終選擇3 mg萃取劑用量的萃取小柱進(jìn)行后續(xù)研究。與其他材料相比,PCN-222作為固相萃取劑在保證最大吸附效率的同時節(jié)約了柱容量。

圖 4 (a)吸附劑用量、(b)樣品pH值、(c)不同解吸液、(d)解吸液pH值、(e)解吸體積和 (f)重復(fù)利用次數(shù)對胭脂紅萃取效率的影響(n=3)Fig. 4 Effects of (a) amounts of adsorbent, (b) pH values of the sample, (c) different desorption solutions, (d) pH values of desorption solution, (e) desorption volumes and (f) sorbent reuse times on the extraction efficiencies of new coccine (n=3)

2.2.2樣品pH值

樣品溶液的pH值決定了吸附劑在溶液中所帶電荷的不同,導(dǎo)致其與胭脂紅溶液之間的作用力也不同,從而影響吸附率。因此考察溶液pH值對吸附性能的影響具有重要意義。本工作探究了樣品溶液pH值分別為2～9時吸附率的變化情況,結(jié)果見圖4b。樣品溶液的吸附率隨pH值增加而降低。在酸性條件下,正電荷逐漸在多孔材料PCN-222表面積累,對本身為陰離子色素的胭脂紅的吸引力逐漸增加,考慮到材料的穩(wěn)定性[31],最終選擇在樣品溶液pH值為3的條件下進(jìn)行萃取。

2.2.3洗脫劑

不同極性的有機(jī)溶劑對化合物的洗脫能力不同,因此為了達(dá)到最高的萃取效率有必要對洗脫劑種類進(jìn)行優(yōu)化。本工作研究了甲醇、乙醇、乙腈、丙酮和N,N-二甲基甲酰胺這5種洗脫劑對目標(biāo)分析物的解吸能力。如圖4c所示,極性較高的溶劑甲醇和DMF對目標(biāo)物的洗脫能力較強(qiáng)。同時結(jié)合油水分配系數(shù)(LogP)越小,化合物極性越強(qiáng)的規(guī)律,可以發(fā)現(xiàn),由于DMF的LogP值最小,使得解吸效率最高。因此最終選擇了解吸效果最佳的DMF溶劑作為解吸劑,但其解吸率仍沒有達(dá)到100%?？紤]到在堿性條件下吸附劑帶負(fù)電荷,目標(biāo)物在靜電排斥作用下更易洗脫。因此,向有機(jī)溶劑中加入少量氨水后進(jìn)行實驗,回收率大大提高。為了進(jìn)一步探究解吸性能與pH的關(guān)系,考察了不同pH值對解吸效率的影響(見圖4d)。結(jié)果表明,隨著pH值升高,解吸率逐漸升高。因此最終選用pH 11的DMF作為最佳洗脫劑。

2.2.4洗脫劑用量

洗脫劑用量影響待測物從萃取劑上洗脫下來的程度。洗脫劑用量太少會使目標(biāo)物洗脫不完全,用量太多會增加后續(xù)的工作量,不能實現(xiàn)富集。因此本文考察了不同體積(1～5 mL)的洗脫劑對胭脂紅染料的洗脫情況,結(jié)果見圖4e。當(dāng)洗脫劑體積達(dá)到3 mL時,對目標(biāo)物的吸附回收率達(dá)到最大且后續(xù)沒有明顯的增加。綜合考慮實驗結(jié)果與實驗成本,最終確定洗脫劑最佳用量為3 mL。

2.3 材料的重復(fù)利用

為了能夠重復(fù)利用PCN-222萃取劑,以減少實際檢測成本,本實驗對材料的重復(fù)利用率進(jìn)行了探究。將使用過帶有萃取劑的微注射式固相萃取柱經(jīng)超純水和甲醇反復(fù)洗滌后再次用于樣品前處理過程,結(jié)果見圖4f。研究發(fā)現(xiàn),萃取劑在重復(fù)使用4次后,萃取能力雖有所下降,但仍高于90%,說明PCN-222不僅對陰離子胭脂紅溶液具備高效的吸附性能,而且還可以重復(fù)利用。與其他固相萃取柱相比,本研究所開發(fā)的一步式固相萃取裝置節(jié)約了檢測成本,是一種綠色環(huán)保的前處理裝置。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1檢出限、定量限和線性范圍

在最優(yōu)條件下,以3倍和10倍信噪比計算胭脂紅的檢出限和定量限,分別為0.1 μg/和0.3 μg/L。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x, μg/L),對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)(y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。目標(biāo)物在50～10 000 μg/L范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系,線性方程為y=29.3x+2 175.5,相關(guān)系數(shù)(r2)大于0.999。

2.4.2準(zhǔn)確度和精密度

通過向空白樣品基質(zhì)中加入高、中、低3個不同水平(0.1、1、10 μg/mL)的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收試驗,以回收率表示方法的準(zhǔn)確度,同時測定6份平行樣品。結(jié)果表明,飲料中胭脂紅的加標(biāo)回收率為99.5%～109.4%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.55%～2.4%。表明本方法在低濃度和高濃度下均具備良好的準(zhǔn)確度和精密度,滿足實際樣品的測定需求。

2.5 實際樣品分析

將本方法應(yīng)用于市場上購買的幾種飲料中胭脂紅的含量分析,結(jié)果表明飲料中均未檢出胭脂紅。對比研究了空白加標(biāo)的維生素飲料(10 μg/mL)分別通過一步式快速萃取富集和直接應(yīng)用HPLC的差異。結(jié)果如圖5所示,由于樣品基質(zhì)背景十分復(fù)雜,加標(biāo)后直接用于液相色譜檢測的色譜圖受雜質(zhì)影響而使目標(biāo)峰的響應(yīng)值極低,經(jīng)過微注射式固相萃取后,胭脂紅的峰響應(yīng)明顯增高,其他雜峰消失,說明本方法對樣品中胭脂紅可實現(xiàn)富集,能夠排除其他雜質(zhì)的干擾,有利于樣品中痕量目標(biāo)物的檢測。

圖 5 經(jīng)微注射固相萃取前、后加標(biāo)維生素飲料 (10 μg/mL)的色譜圖Fig. 5 Chromatograms of spiked vitamin beverage (10 μg/mL) before and after microinjection SPE

2.6 與其他方法比較

將本方法與廣泛應(yīng)用在食品樣品中痕量色素的檢測方法進(jìn)行比較(見表1)?？梢钥闯?本方法對目標(biāo)色素的檢測具備較低的檢出限和較好的重復(fù)性。此外,可以發(fā)現(xiàn)目前常用的檢測方法在前處理階段仍需花費大量的時間,本工作通過自制的微注射固相萃取技術(shù)明顯簡化了前處理流程,在5 min內(nèi)即可完成萃取過程,在飲料等實際樣品檢測中具有較好的應(yīng)用潛力。

表 1 本方法與相關(guān)文獻(xiàn)中方法的比較

3 結(jié)論

本工作將合成的基于金屬骨架的納米材料PCN-222作為高效萃取劑,應(yīng)用于自制微注射式的固相萃取設(shè)備,在保持超高萃取效率的同時大大簡化了萃取步驟。本文建立了一步式快速萃取飲料中偶氮類染料胭脂紅的新檢測方法,在最優(yōu)的固相萃取條件下,PCN-222萃取劑展現(xiàn)出良好的萃取能力,并能夠有效降低食品基質(zhì)中雜質(zhì)對液相色譜分離的影響,實現(xiàn)了對痕量胭脂紅的富集。檢測方法具備極低的檢出限、較高的準(zhǔn)確度和較好的重復(fù)性。本方法具備快速、靈敏、高效和環(huán)保等實用價值,為未來新型納米材料與食品檢測技術(shù)的交叉研究提供理論依據(jù)和應(yīng)用參考。