楊 歡, 曹趙云, 馬有寧, 陳銘學(xué)*

(1. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部稻米及制品監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心, 中國水稻研究所, 浙江 杭州 310006; 2. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué), 江西 南昌 330000)

水稻(OryzasativaL.)作為一種碳水化合物和蛋白質(zhì)的重要來源,通常被認(rèn)為是低致敏性作物,可作為一些谷類敏感患者的飲食替代品。但近年來臨床研究發(fā)現(xiàn),大米可導(dǎo)致一部分人產(chǎn)生過敏性皮膚炎、過敏性蕁麻疹等癥狀,而過敏反應(yīng)的發(fā)生和嚴(yán)重程度與過敏原種類、過敏原含量和攝入量息息相關(guān)[1-3]。因此,越來越多的研究致力于鑒定和降低大米中潛在的過敏蛋白質(zhì)[4-7]。此外,為保護(hù)過敏消費(fèi)者,美國、歐盟、日本、韓國相繼出臺政策,要求在食品標(biāo)簽上標(biāo)注致敏食品成分的相關(guān)信息[8-10],但因大米過敏蛋白質(zhì)缺少有效的檢測方法和閾值,導(dǎo)致這些政策無法適用于管理大米及其制品商品標(biāo)簽上相關(guān)過敏原含量的信息,提示過敏消費(fèi)者自主規(guī)避。因此,開展快速測定大米中過敏蛋白質(zhì)含量的方法研究,對于監(jiān)管稻米制品生產(chǎn)過程和保護(hù)大米過敏患者具有重要意義。

目前,據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道在稻米中已鑒定到α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑類蛋白質(zhì)(seed allergenic protein RAG2, RAG2)、乙二醛酶Ⅰ活性蛋白(glyoxalase Ⅰ)、α-球蛋白(19 kDa globulin)和磷脂轉(zhuǎn)移蛋白等多種過敏蛋白質(zhì)[11]。傳統(tǒng)的免疫親和方法如基于抗體的免疫吸附試驗(yàn)是分析稻米中過敏蛋白質(zhì)的主要方法,該方法操作簡便,可商業(yè)化生產(chǎn),具有低成本、高靈敏度等特點(diǎn)[12,13]。但同源性蛋白質(zhì)之間可通過抗體發(fā)生交叉反應(yīng)導(dǎo)致假陽性,且免疫試劑反應(yīng)只能檢測單一過敏原,無法實(shí)現(xiàn)同時定性定量檢測多個蛋白質(zhì)。基于質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring, MRM)的靶向蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)具有高靈敏度、高通量和高重復(fù)性等技術(shù)特點(diǎn),可對復(fù)雜樣品中多種靶蛋白進(jìn)行準(zhǔn)確定量,被視為靶向蛋白質(zhì)絕對定量的重要手段[14,15]。盡管MRM質(zhì)譜技術(shù)具有諸多優(yōu)勢,但該方法是基于“Bottom-Up”策略,通過分析酶解蛋白質(zhì)產(chǎn)生的特異性肽段實(shí)現(xiàn)相應(yīng)靶蛋白的絕對定量。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),目標(biāo)蛋白質(zhì)的提取效果、酶解效率和雜質(zhì)去除等步驟會嚴(yán)重影響方法準(zhǔn)確度和重復(fù)性,對樣品制備具有較高要求[16,17]。因此,有必要通過比較不同的提取條件,優(yōu)化酶解過程,提高目標(biāo)蛋白質(zhì)特異性肽段的產(chǎn)出率,達(dá)到提高方法準(zhǔn)確性的目的。此外,內(nèi)標(biāo)肽段的使用也可以減小分析過程中不穩(wěn)定因素帶來的定量誤差,從而提高測定結(jié)果的準(zhǔn)確度和可靠性。目前,基于MRM和同位素內(nèi)標(biāo)肽段的方法被廣泛用于芝麻、水產(chǎn)品、巧克力和魚等各類食品中過敏原的絕對定量[18-23],但在稻米中過敏蛋白質(zhì)定量分析的適用性研究鮮有報(bào)道。

本研究首先采用納升高效液相色譜-線性離子阱-靜電場軌道阱(NanoLC-LTQ-Orbitrap)高分辨質(zhì)譜技術(shù)在稻米樣品中鑒定出RAG2、乙二醛酶Ⅰ活性蛋白和α-球蛋白,并篩選得到3種蛋白質(zhì)對應(yīng)的特異性肽段。通過比較酶解體系、酶種類和酶量等條件,以側(cè)翼同位素標(biāo)記特征肽段為內(nèi)標(biāo)物,建立了同時定量分析稻米中3種主要過敏蛋白質(zhì)的方法。該方法具有靈敏度高、線性范圍廣、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn),可用于稻米及制品中過敏蛋白質(zhì)的快速篩查和定量檢測,為過敏蛋白質(zhì)的標(biāo)識提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

EasynLC1000納升液相色譜儀和LTQ-Orbitrap線性離子阱-靜電場軌道阱組合高分辨質(zhì)譜儀(ThermoFisher,美國); LC-20ADCR液相色譜儀(Shimadzu,日本); AB Sciex QTRAP 5500三重四極桿質(zhì)譜儀(SCIEX,美國);脫鹽固相萃取柱(3M Empore extraction disk cartridges, 7 mm/3 mL, C18-SD, 3M公司,美國);臺式多用途高速離心機(jī)(ThermoFisher,美國);十萬分之一天平(METTLER TOLEDO,美國); UV-2600紫外分光光度計(jì)(Shimadzu,日本); PHS-3C精密pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司); Eppendorf ThermoMixer C恒溫混勻振蕩儀(Eppendorf,德國)。

3種蛋白質(zhì)的特征肽段VVLVDNADFLK、DQVVYSLGER、VEPQQCSIFAAGQY,同位素標(biāo)記特征肽段VVLV*DNADFLK (V*, Val-OH-13C5,15N)、DQVV*YSLGER、VEPQQCSI*(I*, Ile-OH-13C6,15N)FAAGQY和側(cè)翼同位素標(biāo)記特征肽段(內(nèi)標(biāo)肽段)DPDGWKVVLV*DNADFLKELQ、MADHHKDQVV*YSLGERCQPGMG、LPSMCRVEPQQCSI*FAAGQY由上海強(qiáng)耀生物科技有限公司合成(純度≥95%)。3種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)由南京金斯瑞生物科技有限公司重組表達(dá)獲得,并經(jīng)SDS-PAGE和Western blot驗(yàn)證。甲酸、甲醇、乙腈(色譜級)購自德國默克公司,碳酸氫銨(NH4HCO3,純度≥99%)、氯化鈉(NaCl,純度≥99%)、十二烷基硫酸鈉(SDS,純度≥99%)、二硫蘇糖醇(DTT,純度≥99%)、碘乙酰胺(IAA,純度≥99%),三羥甲基氨基甲烷鹽(Tris,純度≥99%)和牛血清蛋白質(zhì)(BSA,純度≥99%)均購自美國Sigma公司;胰蛋白酶(測序級,Promega,美國);賴氨?；鶅?nèi)切酶(Lys-C,質(zhì)譜級,Wako,日本); BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(生工生物工程(上海)有限公司)。用于分析的稻米及制品均在線上平臺購買。

1.2 肽段標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

按照生產(chǎn)商提供的肽段溶液配制指導(dǎo)書,分別準(zhǔn)確稱取1 mg人工合成的特異性肽段、同位素特征肽段和內(nèi)標(biāo)肽段用20%乙腈水溶液溶解并依次稀釋成一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。其中,α-球蛋白對應(yīng)的特征肽段VEPQQCSIFAAGQY和同位素特征肽段VEPQQCSI*FAAGQY標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)50 μmol/L IAA在37 ℃黑暗條件下烷基化1 h,得到的肽段經(jīng)C18-SD柱脫鹽后,再用20%乙腈水溶液依次稀釋成一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,備用。

1.3 樣品前處理

1.3.1蛋白質(zhì)提取

3種過敏蛋白質(zhì)的提取參考Satoh等[11]和Chen等[24]的方法,準(zhǔn)確稱取0.1 g(精確到0.001 g)稻米及制品粉末于2.0 mL離心管中,加入1.0 mL的蛋白質(zhì)提取緩沖液(0.5 mol/L NaCl, 30 mmol/L Tris, pH 8.5)于4 ℃恒溫混勻振蕩儀上振蕩提取4 h。將樣品置于離心機(jī)中以10 000 g在4 ℃下離心10 min后收集上清液后,再加入1.0 mL的蛋白質(zhì)提取緩沖液重復(fù)提取一次,混合兩次提取液后,采用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒測定提取液中的總蛋白質(zhì)濃度,并貯藏于-80 ℃冰箱中。

1.3.2蛋白質(zhì)酶解

在Chiva等[17]報(bào)道的基礎(chǔ)上對酶解體系、水解酶種類和酶量等條件進(jìn)行比較優(yōu)化,以期得到最佳酶解效果。最終,實(shí)驗(yàn)取0.2 mL蛋白質(zhì)提取緩沖液于1.5 mL離心管中,并分別加入10 μL內(nèi)標(biāo)肽段(5 μmol/L)混勻。加入含0.48 mL 1 g/L SDS的蛋白質(zhì)變性溶劑(50 mmol/L NH4HCO3水溶液,pH 8.5)后,經(jīng)5 μL 1 mol/L DTT在37 ℃條件下還原1 h,再加入25 μL 1 mol/L IAA至終濃度為50 mmol/L,于37 ℃避光反應(yīng)1 h。按m(蛋白質(zhì))∶m(酶)=20∶1比例依次加入20 μL 0.5 μg/μL Lys-C和Trypsin溶液混勻后置于37 ℃條件下依次酶解4 h和16 h,最后加入適量甲酸終止反應(yīng),待凈化。

1.3.3肽段脫鹽

依次用甲醇、80%乙腈(含0.1%甲酸)溶液和0.1%(v/v)甲酸溶液活化平衡C18-SD固相萃取小柱后,將酶解肽段混合液加入小柱中,在200 g和4 ℃條件下離心5 min。加入0.5 mL 0.1%甲酸溶液淋洗后,將C18-SD柱放入新15 mL離心管中,依次加入0.5 mL 80%乙腈(含0.1%甲酸)溶液洗脫兩次。合并兩次洗脫液,過0.2 μm尼龍濾膜后上機(jī)分析。

1.4 儀器條件

1.4.1nanoLC-LTQ-Orbitrap條件

色譜條件:色譜柱由Acclaim Pep Map 100(C18, 20 mm×75 μm, 3 μm, Agilent,美國)預(yù)柱和Acclaim Pep Map RSLC(C18, 150 mm×50 μm, 2 μm, Agilent,美國)分析柱組成;流動相A為0.1%甲酸水溶液,流動相B為乙腈(含0.1%甲酸)。肽段洗脫條件為:0～120 min, 0～70%B; 120～140 min, 70%B～95%B; 140～160 min, 95%B。進(jìn)樣量為2.0 μL,流速為0.3 μL/min。

質(zhì)譜條件:納升離子源噴霧電壓為1.8 kV,離子傳輸管溫度為300 ℃,一級質(zhì)譜利用Orbitrap在m/z300～2 000范圍內(nèi)全掃,分辨率設(shè)置為60 000;將一級質(zhì)譜掃描獲得的TOP10離子用LTQ進(jìn)行二級碎片離子采集,離子碎裂模式采用碰撞誘導(dǎo)解離(collision-induced dissociation, CID)。

1.4.2LC-MS/MS條件

色譜柱:Poroshell 120 EC-C18(150 mm×2.1 mm, 2.7 μm, Agilent,美國);柱溫:40 ℃,流速:0.2 mL/min;進(jìn)樣量:2.0 μL;流動相由0.1%甲酸水溶液(A)和乙腈(含0.1%甲酸)(B)組成。梯度洗脫程序設(shè)置為:0～18 min, 10%B～80%B; 18～24 min, 80%B; 24～24.1 min, 80%B～10%B; 24.1～30 min, 10%B。多反應(yīng)監(jiān)測正離子模式采集,離子源溫度:450 ℃;噴霧電壓:5.5 kV;門簾氣壓力:130 kPa; Gas 1和Gas 2壓力均為250 kPa。

2 結(jié)果與討論

2.1 特征肽段的鑒定篩選

實(shí)驗(yàn)首先利用nanoLC-LTQ-Orbitrap對稻米樣品酶解液進(jìn)行一級全掃描,并結(jié)合二級碎片離子,獲得實(shí)際樣品中的肽段指紋圖譜。采集數(shù)據(jù)經(jīng)Proteome Discover數(shù)據(jù)庫檢索軟件(ThermoFisher公司,美國)對圖譜信息進(jìn)行匹配檢索,最終成功鑒定到3種文獻(xiàn)已報(bào)道的過敏蛋白質(zhì),分別為RAG2、乙二醛酶Ⅰ活性蛋白和α-球蛋白[11],對應(yīng)的氨基酸序列覆蓋率依次為48.2%、59.1%和43.5%,鑒定結(jié)果具有較高的可信度(結(jié)果見圖1)。為確保定量結(jié)果的穩(wěn)定性,實(shí)驗(yàn)根據(jù)特征肽段的篩選原則[21,22],優(yōu)先選擇響應(yīng)強(qiáng)度高、氨基酸數(shù)目為10～20、m/z<1 250、無漏切位點(diǎn)、不含易修飾氨基酸的肽段,將DQVVYSLGER[31～40]和VVLVDNADFLK[278～288]分別作為RAG2和乙二醛酶Ⅰ活性蛋白的特征肽段(見圖1下劃線肽段)。因α-球蛋白的氨基酸序列中富含半胱氨酸,酶解產(chǎn)生的肽段中大多含有游離的半胱氨酸。而游離的半胱氨酸在酶解過程中易與IAA發(fā)生不可逆的烷基化反應(yīng),在質(zhì)譜鑒定過程中主要以碘乙酰胺加合物的形式存在。因此,實(shí)驗(yàn)最終選擇鑒定到的VEPQQC(CAM)SIFAAGQY[173～186]作為α-球蛋白的特征肽段。經(jīng)UniProt和NCBI數(shù)據(jù)庫的基本局部搜索比對工具(BLAST)檢索驗(yàn)證特異性,結(jié)果表明3個肽段唯一來源于水稻中的RAG2、乙二醛酶Ⅰ活性蛋白和α-球蛋白,可作為稻米中3種蛋白質(zhì)定量的特征肽。

圖 1 稻米中3種過敏蛋白質(zhì)的氨基酸序列Fig. 1 Amino acid sequences of the three allergenic proteins in rice The red letters represent the peptides identified by high resolution mass spectrometry, and underlined letters represent the specific peptides.

2.2 特征肽段質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

蛋白質(zhì)的絕對定量分析主要是采用MRM模式監(jiān)測特征肽段的碎片離子,實(shí)現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)中靶標(biāo)蛋白質(zhì)的精確定量。為獲得合適的離子對和質(zhì)譜采集參數(shù),提高檢測靈敏度和特異性,本實(shí)驗(yàn)采用蠕動泵依次向三重四極桿質(zhì)譜中引入人工合成的3種多肽單一標(biāo)準(zhǔn)溶液。在正離子模式下進(jìn)行一級質(zhì)譜掃描,得到響應(yīng)強(qiáng)度較高的準(zhǔn)分子離子峰[M+2H]2+,并進(jìn)一步采用Skyline軟件自動優(yōu)化碰撞能量,獲得靈敏度較高的離子對,3個特異性肽段優(yōu)化后的離子信息和MRM采集參數(shù)見表1。此外,本研究比較了α-球蛋白的特征肽段經(jīng)IAA修飾前后的響應(yīng)強(qiáng)度差異,結(jié)果如圖2a和圖2b,可以看出,VEPQQCSIFAAGQY的半胱氨酸在與IAA發(fā)生烷基化反應(yīng)后,形成碘乙酰胺加合物,使特征肽段的[M+2H]2+增加28.5 Da, 3個碎片離子增加57 Da(見圖2c和圖2d),離子豐度也顯著增強(qiáng),是未修飾肽段的5倍左右。該結(jié)果與Kulevich等[25]和王繼峰等[26]報(bào)道的肽段中的半胱氨酸烷基化可提高肽段的離子化效率,進(jìn)而增強(qiáng)其質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度的結(jié)論相一致。

表 1 3種過敏蛋白的特征肽段的離子信息及MRM參數(shù)

圖 2 IAA烷基化修飾對α-球蛋白特征肽段VEPQQCSIFAAGQY質(zhì)譜響應(yīng)的影響Fig. 2 Effect of the modification of IAA alkylation on the MS response of signature peptide, VEPQQCSIFAAGQY of 19 kDa globulin

實(shí)驗(yàn)對人工合成的3個同位素標(biāo)記特征肽段的離子信息和質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化,如表1所示,3個肽段分別在纈氨酸(V)或異亮氨酸(I)的C和N原子進(jìn)行同位素標(biāo)記,可使同位素標(biāo)記肽段的母離子和子離子與未標(biāo)記肽段之間相差的m/z能被低分辨質(zhì)譜區(qū)分。進(jìn)一步采用MRM正離子模式采集3個特征肽段及同位素特征肽段離子對。結(jié)果發(fā)現(xiàn),3種同位素標(biāo)記肽段各離子對的色譜峰保留時間和離子豐度與未標(biāo)記特征肽段一致,且色譜峰之間無相互干擾。因此,本實(shí)驗(yàn)合成的同位素特征肽段是理想的特征肽段類似物,可用于校正儀器分析誤差。

2.3 不同酶解條件對酶解效率的影響

目標(biāo)蛋白質(zhì)的提取效果和酶解條件在保障定量結(jié)果準(zhǔn)確性中發(fā)揮重要作用[27]。鑒于已有文獻(xiàn)[28]報(bào)道了不同溶劑對稻米中過敏蛋白質(zhì)提取效果的影響,本實(shí)驗(yàn)通過合成3種重組蛋白質(zhì)和側(cè)翼同位素特征肽段,重點(diǎn)比較酶解體系、水解酶種類和酶量,以達(dá)到最佳的酶解效果。

2.3.1酶解體系中表面活性劑的質(zhì)量濃度

表面活性劑有利于促進(jìn)蛋白質(zhì)變性溶解,去除磷脂等非蛋白質(zhì)雜質(zhì)的干擾,提高酶解效率。因此,實(shí)驗(yàn)向含不同濃度(0、1、5、10、20 g/L)表面活性劑SDS的50 mmol/L NH4HCO3(pH 8.5)溶液中分別加入RAG2(120 pmol)、乙二醛酶Ⅰ活性蛋白(60 pmol)和α-球蛋白(100 pmol)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì),并與相應(yīng)的側(cè)翼同位素標(biāo)記特征肽段(100 pmol)共酶解。實(shí)驗(yàn)使用內(nèi)標(biāo)法定量,獲得3種特異性肽段的絕對含量,按特征肽段與相應(yīng)蛋白質(zhì)等物質(zhì)的量比計(jì)算目標(biāo)蛋白質(zhì)含量。最終以計(jì)算得到的3種過敏蛋白質(zhì)含量與加入的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量的百分比計(jì)算酶解效率,考察酶解體系中表面活性劑對酶解效果的影響。結(jié)果如圖3a所示,酶解體系中含少量SDS(1 g/L)有利于蛋白質(zhì)完全變性,可使RAG2、乙二醛酶Ⅰ活性蛋白和α-球蛋白的酶解效率分別提高20.6%～35.3%左右。但當(dāng)SDS的質(zhì)量濃度超過一定范圍時,會抑制Trypsin酶活性,進(jìn)而降低消化效果。因此,本著獲取最佳酶解效率,減少有毒試劑用量的原則,實(shí)驗(yàn)最終將含1 g/L SDS的50 mmol/L NH4HCO3(pH 8.5)溶液確定為酶解溶劑。

圖 3 不同酶解條件對3種過敏蛋白酶解效率的影響(n=3)Fig. 3 Effects of different hydrolysis conditions on the digestion efficiency of the three allergenic proteins (n=3)a. concentration of SDS in digestion solvent; b. different enzyme; c. different amounts of enzyme.

2.3.2酶種類和酶量

目前常用的蛋白酶主要有胰蛋白酶和賴氨?；鶅?nèi)切酶等。已有研究表明,單一的胰蛋白酶對底物蛋白質(zhì)酶解不完全,易導(dǎo)致漏切,而Lys-C 與胰蛋白酶互補(bǔ)進(jìn)行消化,可彌補(bǔ)這些缺點(diǎn),提高酶解效率和定量準(zhǔn)確性。因此,實(shí)驗(yàn)分別采用胰蛋白酶酶解20 h、胰蛋白酶酶解4 h后Lys-C酶解16 h、Lys-C酶解4 h后胰蛋白酶酶解16 h 3種方法水解3種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)和側(cè)翼內(nèi)標(biāo)肽段,內(nèi)標(biāo)法定量,考察單一酶解和組合酶解對3種過敏蛋白質(zhì)定量結(jié)果的影響。結(jié)果如圖3b所示,在Trypsin酶的單獨(dú)作用下,3種蛋白質(zhì)的酶解效率為60.5%～73.5%。Lys-C酶主要切割賴氨酸,單獨(dú)用于蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)生更長的肽鏈,其酶切效率較低,但Lys-C酶在某些苛刻條件下穩(wěn)定性強(qiáng)于Trypsin酶。因此,同時采用Trypsin和Lys-C酶切,可顯著提高目標(biāo)蛋白質(zhì)的酶解效率[29,30],而兩種酶不同的酶解順序也顯著影響酶解效果。在Trypsin酶解前使用Lys-C,可使RAG2和乙二醛酶Ⅰ活性蛋白酶解效率提高到83.4%～100.4%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Lys-C和Trypsin酶組合消化可以互補(bǔ)兩者之間的缺點(diǎn),提高酶解效率,使蛋白質(zhì)的定量結(jié)果更加準(zhǔn)確。

實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步比較了酶用量(按m(蛋白質(zhì))∶m(酶)=200∶1, 100∶1, 50∶1, 20∶1, 1∶1)對3種蛋白質(zhì)酶切效果的影響。圖3c結(jié)果表明,3種蛋白質(zhì)的酶解效率隨著水解酶量添加比例的增加而上升,但當(dāng)酶量達(dá)到20∶1之后,再增加酶量酶解回收率無顯著提升。因此,為降低成本,節(jié)約試劑,實(shí)驗(yàn)最終選擇20∶1的加酶比例。

2.4 方法驗(yàn)證

本研究通過特異性、基質(zhì)效應(yīng)、線性關(guān)系、準(zhǔn)確度和精密度等多個參數(shù)對建立的方法進(jìn)行驗(yàn)證。

2.4.1方法的特異性和基質(zhì)效應(yīng)評價(jià)

實(shí)驗(yàn)利用人工合成的3個特征肽段標(biāo)準(zhǔn)品和3種蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的特異性肽的保留時間來定性。此外,3個特征肽段在MRM模式下同時監(jiān)測3個離子對,進(jìn)一步確保了結(jié)果特異性。結(jié)果表明,3個合成肽段的定性和定量離子保留時間與對應(yīng)的蛋白質(zhì)水解肽段保持一致,在連續(xù)進(jìn)樣20針后,保留時間的最大偏移在0.5%～1.2%之間。而在未經(jīng)水解酶消化的樣品中,在特征肽段出峰時間范圍內(nèi)無明顯峰形。因此,該方法具有較好的特異性。

為評價(jià)基質(zhì)成分對特征肽段的干擾,實(shí)驗(yàn)分別用純?nèi)軇?80%乙腈溶液(含0.1%甲酸))和稻米制品空白酶解液將3種特征肽段配制成5個濃度(1～ 200 nmol/L,每個濃度含50 nmol/L同位素標(biāo)記特征肽段)的溶液,內(nèi)標(biāo)法定量?；|(zhì)效應(yīng)評價(jià)參考Huang等[21]和Chen等[24]的方法,以基質(zhì)效應(yīng)=(A/B-1)×100%計(jì)算,其中A為以樣品基質(zhì)溶液制作的曲線斜率,B為以純?nèi)軇┲谱鞯那€斜率。結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)使用內(nèi)標(biāo)法時3種特征肽段的基質(zhì)效應(yīng)范圍在-9.7%～8.5%之間,樣品中的基質(zhì)成分對3種特異性肽段的檢測干擾較小。

2.4.2方法的線性關(guān)系、檢出限和定量限

將3種特異性肽段配制成一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液,每個濃度含50 nmol/L同位素標(biāo)記特征肽段,經(jīng)LC-MS分析。分別以3種肽段的峰面積/內(nèi)標(biāo)物峰面積(y)和對應(yīng)濃度比(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。表2結(jié)果表明,3種肽段在1～200 nmol/L內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0. 9 972。以肽段定量離子色譜峰信噪比(S/N)為3和10分別為方法的檢出限和定量限,對應(yīng)的蛋白質(zhì)含量為3種蛋白質(zhì)的方法LOD和LOQ。結(jié)果表明,該方法中3種蛋白質(zhì)的LOD和LOQ分別為3 mg/kg和10 mg/kg。

表 2 3種特異性肽段的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)(r2)及過敏蛋白質(zhì)的檢出限和定量限

2.4.3方法的回收率和精密度

實(shí)驗(yàn)向空白的稻米制品基質(zhì)中加入低、中和高水平的3種過敏蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品,經(jīng)1.3.1節(jié)步驟提取后,加入3種側(cè)翼同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)肽段與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)共酶解。用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算得到定量肽段濃度后,再按照特異肽段與目標(biāo)蛋白質(zhì)的物質(zhì)的量比為1∶1的比例,計(jì)算目標(biāo)蛋白質(zhì)的含量。分別將每個濃度水平在一天內(nèi)連續(xù)測定7次和連續(xù)測定5天,計(jì)算日內(nèi)精密度(intra-RSD)和日間精密度(inter-RSD)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示,本方法3種蛋白質(zhì)的加標(biāo)回收率為80.6%～103.7%,日內(nèi)和日間精密度均小于11.5%。

2.5 方法應(yīng)用

為驗(yàn)證本研究建立方法的適用性,實(shí)驗(yàn)最后采用建立的HPLC-MS/MS法結(jié)合穩(wěn)定同位素標(biāo)記肽段方法分析了20份不同稻米及制品中3種過敏蛋白質(zhì)含量,分析結(jié)果見表4。在15份稻米樣品中均能檢測到3種過敏蛋白質(zhì),其含量范圍在(0.014±0.001)～(3.55±0.15) mg/kg; 5份稻米制品中有2份樣品中檢出α-球蛋白,其含量為(0.022±0.004)～(0.049±0.005) mg/kg。3種過敏蛋白質(zhì)的特征肽段在實(shí)際樣品中的定量離子色譜圖見圖4。

表 4 (續(xù))

圖 4 稻米及制品中3種過敏蛋白質(zhì)特征肽段的定量離子色譜圖Fig. 4 Quantitative ion chromatograms for the selected marker peptides of the three allergenic proteins found in rice and products

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了一種同時分析稻米及制品中3種過敏蛋白質(zhì)含量的檢測方法,該方法基于Bottom-up策略,結(jié)合LTQ-Orbitrap技術(shù)和Protein Discovery軟件,成功篩選到稻米中3種過敏蛋白質(zhì)的特異肽段。通過人工合成特征肽段、同位素內(nèi)標(biāo)肽段及蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品,優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)和酶解條件,以3種過敏蛋白質(zhì)相應(yīng)特征肽段為分析對象,實(shí)現(xiàn)稻米及制品中3種過敏原的同時定量分析。該方法穩(wěn)定性好,檢測靈敏度高,操作簡便,適用于各類稻米及制品中3種過敏蛋白質(zhì)含量的測定,可作為正確評價(jià)和標(biāo)記過敏原的有效工具,以保護(hù)人們免受大米過敏原的危害。