張 旭, 董妙雪, 徐 銀, 王利娟*, 喬曉強

(1. 河北省藥物質(zhì)量分析控制重點實驗室, 河北大學生命科學與綠色發(fā)展研究院, 河北大學藥學院, 河北 保定 071002; 2. 天津阿爾塔科技有限公司, 天津 300457)

昔萘酸沙美特羅(salmeterol xinafoate, SalX)是一種藥效持久的β2-腎上腺受體興奮劑,藥理活性好,是目前臨床上治療哮喘病的理想藥物之一[1]。如圖1所示,昔萘酸沙美特羅的分子結(jié)構(gòu)中含有一個手性碳原子,有(R)-SalX和(S)-SalX兩個對映體。相關研究[2]發(fā)現(xiàn),它們的藥理活性差異很大,后者對β2-腎上腺受體的選擇性比前者高4倍,且表現(xiàn)出較少的副作用。隨著世界各國對于手性藥物生產(chǎn)和管理的規(guī)范化,對于沙美特羅替卡松粉吸入劑這種世界上最暢銷的藥物之一,建立昔萘酸沙美特羅對映體的手性分離分析方法,有助于進一步開展其單一對映體的相關研究,保證臨床用藥的安全有效。

圖 1 昔萘酸沙美特羅的結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structural formula of salmeterol xinafoate (SalX)

目前,昔萘酸沙美特羅的手性分離方法主要有高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)[3,4]和超臨界流體色譜法(supercritical fluid chromatography, SFC)[5],但是兩種方法的運行成本都比較高。毛細管電泳法(capillary electrophoresis, CE)具有操作簡單、分離效率高、藥品和試劑用量少、可供選擇模式多等優(yōu)點[6],因此在手性藥物分離領域應用廣泛[7,8]。非水毛細管電泳(nonaqueous capillary electrophoresis, NACE)是CE的一個重要分支,能夠分離水溶性差或在水相介質(zhì)中分離效果較差的分析物,有利于提高手性選擇劑的識別能力[9,10]。NACE中常用的手性選擇劑有環(huán)糊精(cyclodextrin, CD)及其衍生物、大環(huán)抗生素、蛋白質(zhì)和多糖等[11]。手性多羥基化合物-硼酸絡合酸是一類新型離子對手性選擇劑,制備簡單、價格低廉,在微乳液毛細管電動色譜(microemulsion electrokinetic chromatography, MEEKC)[12-14]和NACE[15-18]中已成功實現(xiàn)了多種手性藥物的良好分離。本文以L(+)-酒石酸-硼酸絡合酸作為手性選擇劑,采用NACE法對昔萘酸沙美特羅對映體進行分離,并開展方法學研究(包括線性與范圍、檢出限、定量限、精密度、準確度、穩(wěn)定性等),結(jié)果表明該方法結(jié)果準確可靠,可用于沙美特羅替卡松粉吸入劑中昔萘酸沙美特羅對映體含量的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CL101A型高效毛細管電泳儀(北京華陽利民儀器公司),所有數(shù)據(jù)采集均在CXTH-3000色譜工作站上完成;KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器公司); BT25S型電子分析天平(北京賽多利斯科儀器公司); PHS-3C型pH計(上海理達儀器廠)。

L(+)-酒石酸(分析純,天津市科密歐化學試劑有限公司);硼酸(分析純,天津北方天醫(yī)化學試劑廠);三乙胺和冰乙酸(分析純,天津市光復精細化工研究所);甲醇(色譜純,北京百靈威科技有限公司);昔萘酸沙美特羅對照品(批號100567-201502,純度為99.9%)購自中國食品藥品檢定研究院;沙美特羅替卡松粉吸入劑(含昔萘酸沙美特羅50.0 μg/泡,批號為5L7P)由英國葛蘭素史克公司生產(chǎn)。

1.2 溶液配制

背景緩沖溶液:取適量L(+)-酒石酸和硼酸,精密稱定,置于25.0 mL量瓶中,加少量甲醇超聲溶解并定容至刻度,混合均勻,0.22 μm微孔濾膜(有機系)過濾,超聲脫氣15.0 min。

對照品溶液:取適量昔萘酸沙美特羅對照品,精密稱定,溶于甲醇中,配制成2.0 g/L的儲備液,4 ℃冰箱保存,進樣前用甲醇稀釋到合適濃度作為對照品溶液。

樣品溶液:取適量沙美特羅替卡松粉吸入劑泡囊內(nèi)容物,精密稱定,用甲醇超聲溶解,4 000 r/min下離心5.0 min,取上清液,用甲醇配制成消旋體質(zhì)量濃度約為2.0 g/L的儲備液,4 ℃冰箱保存,進樣前用甲醇稀釋到合適濃度作為樣品溶液。

1.3 CE的條件與方法

未涂層彈性熔融石英毛細管(內(nèi)徑50.0 μm,總長度64.5 cm,有效長度55.5 cm,購自河北永年銳灃色譜器件有限公司),在使用前依次用甲醇沖洗10.0 min,超純水沖洗10.0 min, 1.0 mol/L氫氧化鈉溶液沖洗20.0 min,超純水沖洗至中性,1.0 mol/L鹽酸溶液沖洗20.0 min,超純水沖洗至中性,最后用甲醇沖洗5.0 min。每次進樣前,用背景緩沖溶液沖洗3.0 min。重力進樣17.5 cm×10.0 s,檢測波長225 nm;室溫;正極進樣,負極檢測;運行電壓20.0 kV。

2 結(jié)果與討論

2.1 手性分離條件的優(yōu)化

2.1.1L(+)-酒石酸濃度對手性分離的影響

手性選擇劑在手性分離中起著至關重要的作用。本實驗在0～140.0 mmol/L范圍內(nèi),考察了L(+)-酒石酸濃度對手性分離的影響。如圖2所示,保持硼酸濃度為120.0 mmol/L不變,當L(+)-酒石酸的濃度由0 mmol/L逐漸增加到120.0 mmol/L時,昔萘酸沙美特羅兩個對映體間的分離度(resolution,Rs)總體上逐漸增大,這是由于生成手性絡合酸的反應是可逆的,L(+)-酒石酸濃度的增加促進反應正向移動,有利于絡合酸手性選擇劑生成量的增加;當L(+)-酒石酸的濃度從120.0 mmol/L逐漸增加到140.0 mmol/L時,昔萘酸沙美特羅兩個對映體間的Rs開始減小。本實驗最終選擇120.0 mmol/L作為L(+)-酒石酸的最佳濃度。

圖 2 L(+)-酒石酸濃度對手性分離的影響(n=3)Fig. 2 Effect of L(+)-tartaric acid concentration on chiral resolution (n=3)

2.1.2硼酸濃度對手性分離的影響

保持L(+)-酒石酸濃度為120.0 mmol/L不變,本實驗在0～140.0 mmol/L范圍內(nèi),考察了硼酸濃度對手性分離的影響。如圖3所示,當硼酸濃度由0 mmol/L逐漸增加到120.0 mmol/L時,昔萘酸沙美特羅兩個對映體間的Rs總體上逐漸增大,原因與L(+)-酒石酸的影響類似,硼酸濃度的增加促進了絡合酸手性選擇劑生成量的增加;當硼酸的濃度超過120.0 mmol/L時,昔萘酸沙美特羅兩個對映體間的Rs減小。本實驗最終選擇120.0 mmol/L作為硼酸的最佳濃度。

圖 3 硼酸濃度對手性分離的影響(n=3)Fig. 3 Effect of boric acid concentration on chiral resolution (n=3)

2.1.3表觀pH對手性分離的影響

NACE中緩沖液的酸度用表觀pH(apparent pH, pH*)來表示,它是影響手性分離的重要參數(shù)之一。不同濃度的冰乙酸和三乙胺會影響緩沖溶液的pH*,進而影響手性藥物的解離程度和手性選擇劑的生成量,同時改變電滲流(electroosmotic flow, EOF)的大小,改善分離效果[19]。保持L(+)-酒石酸和硼酸濃度均為120.0 mmol/L不變,改變冰乙酸和三乙胺的濃度,在pH*0.53～1.02范圍內(nèi)考察昔萘酸沙美特羅遷移時間(migration time,t)和Rs的變化(見圖4)。隨著pH*逐漸增大,EOF減小,兩個對映體的t增加;當pH*從0.53逐漸增加到0.93時,Rs達到2.18;繼續(xù)增加三乙胺濃度來增大pH*,昔萘酸沙美特羅的兩個對映體由于t太長,樣品擴散,Rs降低。本實驗最終選擇0.93為最佳pH*。

圖 4 pH* 對手性分離的影響(n=3)Fig. 4 Effect of pH* on chiral resolution (n=3)

本實驗確定的最佳緩沖溶液為:含120.0 mmol/L L(+)-酒石酸和120.0 mmol/L硼酸的甲醇溶液(pH*=0.93),其他電泳條件見1.3節(jié)。如圖5所示,在優(yōu)化的實驗條件下,昔萘酸沙美特羅的兩個對映體實現(xiàn)了良好分離。

圖 5 L(+)-酒石酸-硼酸絡合酸作為手性選擇劑的NACE法分離昔萘酸沙美特羅對映體機理示意圖Fig. 5 Schematic diagram of the separation mechanism for SalX enantiomers with L(+)-tartaric acid-boric acid complex as chiral selector in NACE

2.2 手性分離機理

如圖5所示,L(+)-酒石酸是一種手性多羥基化合物,分子結(jié)構(gòu)中含有一對順-鄰二羥基,可以和硼酸在甲醇溶液中按照物質(zhì)的量之比2∶1生成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的L(+)-酒石酸-硼酸絡合酸,這種環(huán)狀結(jié)構(gòu)能夠限制單鍵的旋轉(zhuǎn),固定手性中心,使手性絡合酸與兩個對映體空間匹配方面的差別增大,從而提高其手性識別作用[15-18]。由于這個反應是可逆的,無法獲得純凈的絡合酸產(chǎn)物。在本實驗的緩沖體系中,L(+)-酒石酸-硼酸絡合酸解離生成絡合酸陰離子,它是NACE手性分離中真正的手性選擇劑;昔萘酸沙美特羅解離生成(R)-Sal+和(S)-Sal+兩個陽離子,它們可以和手性絡合酸陰離子分別生成暫穩(wěn)態(tài)的離子對化合物,由于二者生成離子對化合物的平衡常數(shù)不同,在NACE中的表觀遷移速率也不同,從而實現(xiàn)手性分離。

圖 6 NACE系統(tǒng)適用性試驗色譜圖Fig. 6 Chromatograms in system suitability test by NACE Peak identifications: 1. enantiomer 1; 2. enantiomer 2; 3. fluticasone propionate.

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

取對照品溶液和市售制劑樣品溶液,在優(yōu)化的手性分離條件下進樣檢測。如圖6所示,昔萘酸沙美特羅兩個對映體的色譜峰峰形對稱,Rs大于2.0,且理論塔板數(shù)、拖尾因子和重復性可滿足分析要求,沙美特羅替卡松粉吸入劑中的丙酸氟替卡松不干擾分離。

2.4 方法學考察

2.4.1線性與范圍

精密量取2.0 g/L的昔萘酸沙美特羅對照品儲備液適量,用甲醇稀釋成55.0、100.0、200.0、400.0、800.0、1 600.0 mg/L的系列標準溶液,在優(yōu)化的電泳條件下進樣檢測,每份溶液平行測3次,記錄每個對映體的峰面積。如表1所示,昔萘酸沙美特羅對映體1和對映體2在27.5～800.0 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi),與峰面積均呈現(xiàn)良好的線性關系,相關系數(shù)(r)分別為0.999 1和0.999 2。

2.4.2檢出限與定量限

以信噪比為3(S/N=3)和10(S/N=10)確定檢出限和定量限。如表1所示,昔萘酸沙美特羅對映體1和對映體2的檢出限和定量限分別為7.5和25.0 mg/L。

表 1 L(+)-酒石酸-硼酸絡合物為手性選擇劑的NACE方法的驗證結(jié)果

2.4.3精密度

取0.8 g/L的昔萘酸沙美特羅對照品甲醇溶液,在優(yōu)化的電泳條件下進樣檢測,記錄每個對映體的遷移時間和峰面積。同一日內(nèi)連續(xù)進樣6次,測定日內(nèi)精密度;每天進樣3次,連續(xù)進樣5天,測定日間精密度。如表1所示,昔萘酸沙美特羅對映體1和對映體2遷移時間和峰面積的日內(nèi)和日間精密度RSD值分別低于1.9%和4.9%,說明該方法的精密度良好。

2.4.4樣品溶液的穩(wěn)定性

取0.8 g/L的樣品溶液,分別放置0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0和24.0 h之后,在優(yōu)化的電泳條件下進樣檢測,每份溶液平行測3次,記錄每個對映體的遷移時間和峰面積。結(jié)果表明,樣品溶液中昔萘酸沙美特羅對映體1和對映體2遷移時間的RSD分別為1.3%和1.1%,峰面積的RSD分別為3.9%和4.5%,說明該樣品溶液在24.0 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5加標回收率

精密量取183.5 mg/L的樣品溶液0.2 mL共9份,平均分為3組,使用微量進樣器分別加入15.0、17.5和20.0 μL昔萘酸沙美特羅對照品儲備液(2.0 g/L),獲得低、中和高3組加標樣品溶液,每組3份樣品,在優(yōu)化的電泳條件下進樣檢測,每份溶液平行測3次,記錄每個對映體的峰面積。如表2所示,昔萘酸沙美特羅對映體1和對映體2的加標回收率分別為99.3%～100.1%和99.8%～100.4%, RSD在1.2%～1.9%之間,說明該方法的準確度良好。

表 2 沙美特羅替卡松粉吸入劑中昔萘酸沙美特羅對映體的 加標回收率(n=3)

2.5 實際樣品測定

取適量市售沙美特羅替卡松粉吸入劑6份,配制樣品溶液,對其昔萘酸沙美特羅對映體的含量進行測定。在優(yōu)化的電泳條件下進樣檢測,每份溶液平行測定3次,記錄每個對映體的峰面積,計算含量。根據(jù)公式“標示量百分含量=(測得量/標示量)×100%”計算每個對映體的標示量百分含量。本實驗所使用的沙美特羅替卡松吸入粉劑中昔萘酸沙美特羅的標示量為50.0 μg/泡,兩個對映體的標示量分別按照25.0 μg/泡計算。結(jié)果顯示,對映體1和對映體2的標示量百分含量均為98.7%, RSD分別為2.5%和2.7%,測定結(jié)果的重復性良好。

3 結(jié)論

L(+)-酒石酸-硼酸絡合酸價廉易得,本文以其作為手性選擇劑建立了NACE手性分離方法,成功實現(xiàn)了昔萘酸沙美特羅對映體的基線分離。該方法操作簡單、快速、結(jié)果準確可靠,可用于市售沙美特羅替卡松粉吸入劑中昔萘酸沙美特羅對映體含量的測定。