劉 建， 崔翰文， 張雪梅， 劉琳琳

(1.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，山東省濟(jì)寧市272029；2.黑龍江省醫(yī)院呼吸內(nèi)科，黑龍江省哈爾濱市150036)

肺癌是癌癥死亡的主要原因，非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌92%，且近年發(fā)病率明顯增長[1]。盡管腫瘤藥物和癌癥治療方法不斷進(jìn)步，但NSCLC患者5年生存率僅有15%，治療效果并不理想[2]。診斷時(shí)間較晚以及治療時(shí)間有限是導(dǎo)致其死亡的主要原因，尋找出一種NSCLC早期生物標(biāo)志物具有重要的意義[3]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類在人類基因組中長度小于24 nt的非編碼單鏈RNA，可以在轉(zhuǎn)錄后通過改變其目標(biāo)mRNA的表達(dá)和翻譯來調(diào)節(jié)生物過程，在腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)作為一類新型的潛在生物標(biāo)志物和藥物靶點(diǎn)出現(xiàn)，miRNA可以控制與肺癌發(fā)生有關(guān)的關(guān)鍵途徑，包括細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[4]。近年研究發(fā)現(xiàn)miR-17-5p廣泛參與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程如喉癌、乳腺癌、肝癌等，但NSCLC方向相關(guān)報(bào)道較少[5-6]。因此，本研究臨床結(jié)合數(shù)據(jù)庫，探討NSCLC患者miR-17-5p表達(dá)差異，及其對(duì)腫瘤預(yù)后的影響，為miR-17-5p作為一種NSCLC的新型腫瘤生物標(biāo)志物提供依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取本院2015年1月—2019年12月經(jīng)病理確診NSCLC患者60例(NSCLC組),其中男36例，女24例；年齡42～75歲，平均(61.30±14.60)歲；體質(zhì)量53～76 kg，平均(65.84±12.90)kg；臨床分期(國際肺癌TNM分期[7])Ⅰ期24人，Ⅱ期22人，Ⅲ期14人；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例。選擇同期體檢的正常健康人群60例作為健康對(duì)照組。所有受試者入選前均未接受任何化療、放療或靶向治療。搜集患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等資料。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者及家屬對(duì)本研究內(nèi)容知情，并簽署知情同意書。

1.2 腫瘤組織miR-17-5p表達(dá)的相關(guān)數(shù)據(jù)庫分析

利用STARBASE數(shù)據(jù)庫的PAN-CANCER功能分析腫瘤組織和正常組織間的miR-17-5p表達(dá)差異，數(shù)據(jù)來源于TCGA(The Cancer Genome Atlas)RNA測序數(shù)據(jù)庫(http://starbase.sysu.edu.cn)，設(shè)定條件為：Entrance of The Platform：miRNA differential expression;miRNA:miR-17-5p;Cancer:Non-small cell lung cancer;Chart type:box plot;Data scale:log2-scale。分析結(jié)果通過箱狀圖表示。在Kaplan-Meier Plotters數(shù)據(jù)庫中分析高表達(dá)及低表達(dá)miR-17-5p在NSCLC患者中的生存差異。數(shù)據(jù)來自于TCGA數(shù)據(jù)庫和GEO(GeneExpression Omnibus)數(shù)據(jù)庫。

1.3 qRT-PCR檢測血清miR-17-5p表達(dá)

收集外周全血5 mL，離心獲取血清，采用qRT-PCR分析兩組miR-17-5p表達(dá)情況。參照Gene Bank數(shù)據(jù)庫miR-17-5p的序列，由上海生工生物工程有限公司提供miR-17-5p的特異度引物，以U6作為內(nèi)參對(duì)照，所得結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化后輸入數(shù)據(jù)軟件進(jìn)行分析。

1.4 ELISA檢測血清CEA、CYFRA21-1和CA125

收集外周全血5 mL，離心獲取血清，2 h內(nèi)采用羅氏COBASE601發(fā)光化學(xué)免疫分析儀通過ELISA試劑盒(美國雅培公司)化學(xué)免疫分析法檢測CEA、CYFRA21-1和CA125的表達(dá)，分析其與患者臨床特征的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 miR-17-5p在腫瘤組織和正常組織中表達(dá)的比較

STARTBASE數(shù)據(jù)庫共分析了408例NSCLC組織樣本和19例健康人群的正常組織樣本，腫瘤組織中miR-17-5p的表達(dá)水平顯著高于正常組織(P<0.05，圖1A)。在數(shù)據(jù)庫中分析miR-17-5p差異表達(dá)對(duì)患者生存預(yù)后的影響，生存分析結(jié)果顯示高表達(dá)組258人，低表達(dá)組259人，低表達(dá)組預(yù)后明顯優(yōu)于高表達(dá)組(HR=1.50，P<0.05，圖1B)。

圖1 miR-17-5p大數(shù)據(jù)分析A為miR-17-5p在NSCLC組織和正常肺組織的表達(dá)水平對(duì)比；B為NSCLC患者miR-17-5p高表達(dá)組和低表達(dá)組生存曲線。

2.2 血清miR-17-5p、CEA、CYFRA21-1和CA125的表達(dá)差異

與健康對(duì)照組比較，NSCLC組血清miR-17-5p表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)；NSCLC組CEA、CYFRA21-1和CA125的表達(dá)水平均不同程度上調(diào)(P<0.05；圖2)。

圖2 各組血清miR-17-5p、CEA、CYFRA21-1和CA125表達(dá)的比較a為P<0.05，與健康對(duì)照組比較。

2.3 miR-17-5p、CEA、CYFRA21-1和CA12的表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性

miR-17-5p、CEA、CYFRA21-1和CA12在NSCLC患者血清中高表達(dá)并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.05，表1)。但未發(fā)現(xiàn)miR-17-5p、CEA、CYFRA21-1和CA12與其他臨床特征之間存在關(guān)聯(lián)(P>0.05，表1)。

表1 miR-17-5p、CEA、CYFRA21-1和CA125表達(dá)與NSCLC患者臨床特征之間的相關(guān)性

2.4 miR-17-5p、CEA、CYFRA21-1和CA125的預(yù)測價(jià)值

對(duì)血清miR-17-5p、CEA、CYFRA21-1和CA125的表達(dá)量進(jìn)行ROC曲線分析并計(jì)算曲線下面積(AUC)。miR-17-5p診斷準(zhǔn)確性AUC 0.738、95%CI 0.677～0.806、靈敏度70.0%、特異度82.2%(圖3A)。CEA、CYFRA21-1和CA125的診斷準(zhǔn)確性分別為AUC 0.617、95%CI 0.571～0.712、靈敏度67.0%、特異度57.8%(圖3B)，AUC 0.684、95%CI 0.538～0.681、靈敏度49.0%、特異度73.3%(圖3C)，AUC 0.634、95%CI 0.530～0.674、靈敏度33.0%、特異度92.2%(圖3D)。miR-17-5p的曲線下面積要大于CEA、CYFRA21-1和CA125，且靈敏度要高于CEA、CYFRA21-1和CA125，說明miR-17-5p預(yù)測價(jià)值更優(yōu)。

圖3 血清miR-17-5p、CEA、CYFRA21-1和CA125的ROC分析

3 討 論

miRNA通過影響mRNA的穩(wěn)定性和翻譯，參與多細(xì)胞生物中基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)[8]。miR-17-5p位于13號(hào)染色體上，是一個(gè)高度保守的miRNA，它在腸癌、胰腺癌、肝細(xì)胞癌中均表現(xiàn)出高表達(dá)的現(xiàn)象。miR-17-5p參與BTG3通路，在體內(nèi)和體外導(dǎo)致直腸癌耐藥，拮抗miR-17-5p的表達(dá)可以抑制腫瘤耐藥性和腫瘤細(xì)胞增殖[9]。乳腺癌相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，血漿外泌體中miR-17-5p可作為乳腺癌的潛在生物學(xué)標(biāo)志物[10]。但在胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)，胃癌患者血清的miR-17-5p表達(dá)下調(diào)且與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)[11]。故miR-17-5p可作為一種參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的檢測因子進(jìn)行研究。

目前早期NSCLC的主要治療模式是進(jìn)行手術(shù)，但30%～55%的患者依然出現(xiàn)了復(fù)發(fā)并導(dǎo)致死亡[12]。NSCLC是一種分子機(jī)制復(fù)雜的腫瘤疾病，高特異度的預(yù)測性生物標(biāo)志物可為患者的有效治療提供優(yōu)質(zhì)保障。目前迫切需要一種新型的預(yù)測標(biāo)志物應(yīng)用于臨床，以提高患者的長期生存率。血清miRNA在特異組織中穩(wěn)定表達(dá)，同時(shí)較患者的腫瘤組織和血液樣本更易在臨床中獲取，越來越多的研究為，血清miRNA可以作為一種與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)的非侵入性檢測標(biāo)志物[4]。在NSCLC組織中miR-451表達(dá)減少，其表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和預(yù)后不良呈負(fù)相關(guān)[13]。而miR-10a在NSCLC組織中被上調(diào)，激活了PTEN/Akt/ERK通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[14]。本研究中，大數(shù)據(jù)分析顯示與健康人群的正常組織比較，miR-17-5p在NSCLC患者癌組織中高表達(dá)，并且與NSCLC患者的預(yù)后影響高度相關(guān)，miR-17-5p高表達(dá)的患者生存率表現(xiàn)較低，顯示為NSCLC預(yù)后危險(xiǎn)因素。在隨后的驗(yàn)證中也發(fā)現(xiàn)，miR-17-5p與CEA、CYFRA21-1和CA125這些臨床常用的腫瘤標(biāo)志物一樣，均在腫瘤患者體內(nèi)高表達(dá)，并且通過比較miR-17-5p與CEA、CYFRA21-1和CA125的診斷效力，結(jié)果顯示，miR-17-5p表現(xiàn)出良好的預(yù)測價(jià)值。這些結(jié)果支持血清中miR-17-5p作為一個(gè)潛在的應(yīng)用于NSCLC的檢測標(biāo)志物。

為進(jìn)一步分析血清中miR-17-5p的臨床意義，本研究發(fā)現(xiàn)miR-17-5p與年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤分期之間不存在顯著關(guān)聯(lián)，但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在顯著關(guān)聯(lián)。這意味著miR-17-5p與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。此外，也有一項(xiàng)通過基因芯片對(duì)宮頸癌組織樣本的研究發(fā)現(xiàn)，miR-17-5p在腫瘤組織中高表達(dá)，并且miR-17-5p靶向TGFBR2提高宮頸癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[15]。肺部淋巴結(jié)豐富，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是NSCLC的主要轉(zhuǎn)移途徑，且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生的患者5年生存率僅為4%，顯著低于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者[16]。

綜上可知，血清miR-17-5p可作為NSCLC的臨床腫瘤標(biāo)志物。miR-17-5p在NSCLC患者血清中的表達(dá)顯著高于健康人群，且與患者的預(yù)后關(guān)系密切。