張 蓉， 張曉艷

(1.北京市宣武中醫(yī)醫(yī)院檢驗科, 北京市100050；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京市100850)

糖尿病是一種異質(zhì)性的代謝紊亂疾病，其中2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)以胰島素抵抗為特征，肥胖是導(dǎo)致胰島素抵抗的常見病因，脂肪組織通過分泌調(diào)節(jié)促炎性脂肪因子，在肥胖相關(guān)的胰島素抵抗的發(fā)病機制中起主要作用[1-2]。瘦素主要由白色脂肪組織中的成熟脂肪細(xì)胞產(chǎn)生，參與多種內(nèi)分泌和生理過程。

糖尿病與肥胖基因6號染色體上的瘦素編碼基因Lepob上的一個常染色體隱性突變有關(guān)，密碼子105的無義突變C到T將精氨酸殘基改變?yōu)榻K止密碼子，導(dǎo)致過早截斷，使翻譯的蛋白質(zhì)失去生物學(xué)活性[3]。因此，盡管脂肪細(xì)胞中有高水平的瘦素mRNA，但動物完全缺乏功能性瘦素，由此成為研究肥胖相關(guān)的T2DM常見小鼠模型。

本研究利用二代測序(next-generation sequencing, NGS)[4]對B6.V-Lepob/J和C57BL/6進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，研究瘦素缺陷T2DM小鼠與普通小鼠轉(zhuǎn)錄組基因差異，尋找在肥胖型T2DM小鼠中的關(guān)鍵基因，對預(yù)防、診斷和治療肥胖型T2DM患者有著重要意義。

1 資料和方法

1.1 動物處理

雄性8周齡ob/ob小鼠5只，雌性8周齡ob/ob小鼠4只，雄性8周齡C57BL/6J小鼠5只，雌性8周齡C57BL/6J小鼠4只(均購自南京大學(xué)模式動物所，4%脂肪的SPF級小鼠飼料和玉米芯墊料均購自北京維通利華)，小鼠被安置在(22±2) ℃的環(huán)境中，按照固定的12 h光/暗周期進(jìn)行飼養(yǎng)，飼養(yǎng)2周后進(jìn)行實驗。2周后，用1.2 g/kg烏拉坦和50 mg/kg α-氯醛糖混合液腹腔麻醉小鼠，處死小鼠后，取小鼠胰腺組織置入液氮和4%甲醛溶液，以便于提取RNA及觀察兩組小鼠胰腺組織病理變化。

1.2 RNA提取

在加入液氮的研缽中，將胰腺組織剪成小塊、磨成粉末，取50 mg加入EP管(盛有1 mL的Trizol液)，混勻。室溫放置5 min，加入氯仿200 μL，蓋緊EP管，劇烈搖蕩15 s。12 000 r/min離心10 min，取上層水相置于另一EP管，加入異丙醇500 μL，溫和混勻。室溫放置10 min，12 000 r/min離心10 min。棄去上清，加入75%乙醇1 mL，渦旋混勻，4 ℃下12 000 r/min離心5 min。重復(fù)操作1次。棄去上清，室溫或真空干燥5～10 min。DEPC水將RNA溶解，必要時溫水浴10 min。吸取上清到離心管，加入氯仿(1/5體積)混勻，放置3 min，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min；重復(fù)操作1次。吸取上清到離心管中，加入無水乙醇1.5倍體積，混勻。上述溶液轉(zhuǎn)移至吸附柱，8 000 r/min離心1 min，倒掉廢液，放回收集管。350 μL RWT加入吸附柱中，8 000 r/min離心1 min，倒掉廢液，然后將其放回收集管中。DNaseI 80 μL加入吸附柱中，25℃消化DNA 15 min，輕柔混合；350 μL RWT加入吸附柱中，8 000 r/min離心1 min，倒掉廢液，然后將其放回收集管中。RPE洗滌液500 μL洗滌1次，8 000 r/min離心1 min。棄掉收集管廢液，然后12 000 r/min離心2 min。把吸附柱移到收集管，加入預(yù)熱50 ℃過的15～20 μL RNase-free Water，室溫放2 min，12 000 r/min離心2 min，得RNA溶液。

1.3 轉(zhuǎn)錄組分析

利用mRNA帶有polyA尾的結(jié)構(gòu)特征，通過Oligo(dT)磁珠富集帶有polyA尾的mRNA，按照NEB普通建庫方式進(jìn)行建庫。庫檢合格后，把文庫按照有效濃度及目標(biāo)下機數(shù)據(jù)量的需求pooling后進(jìn)行Illumina測序。隨后過濾掉測序獲得原始數(shù)據(jù)中少量帶有測序接頭或測序質(zhì)量較低的數(shù)據(jù)(接頭的，含無法確定堿基信息的和質(zhì)量較低的)，進(jìn)行測序錯誤率檢查和GC含量分布檢查，可獲得后續(xù)分析使用的數(shù)據(jù)。之后使用HISAT2軟件將質(zhì)控后的數(shù)據(jù)比對到C57小鼠參考基因組上(mm10, ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-97/fasta/mus_musculus/dna/)。最后，對每個樣本分別進(jìn)行基因表達(dá)水平的定量分析，再合并得到所有樣本的表達(dá)矩陣。

1.4 差異基因分析

由于測序深度和基因長度的影響，計算各樣本所有基因的表達(dá)值后，利用盒形圖展示不同樣本基因表達(dá)水平的分布情況。之后，使用R軟件的edgeR[5]對樣本的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的測序深度進(jìn)行校正，然后進(jìn)行假設(shè)檢驗概率(P)的計算，最后進(jìn)行多重假設(shè)檢驗校正，得到FDR值(錯誤發(fā)現(xiàn)率)。篩選條件logFC≥2或logFC≤-2，P<0.05則認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.5 差異基因的生物學(xué)功能及信號通路分析

本研究利用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)[6]在線數(shù)據(jù)庫對差異基因進(jìn)行基因本體論(gene onotology，GO)和京都基因和基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路分析，條件是P<0.05。

1.6 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互相作用(protein-protein interaction, PPI)構(gòu)建及Hub基因篩選

使用STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)[7]預(yù)測PPI網(wǎng)絡(luò)，分析蛋白質(zhì)之間的功能性相互作用有助于闡明疾病的產(chǎn)生、發(fā)展機制。利用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò)，使用Cytoscape的插件cytohubba[8]和MCODE[9]構(gòu)建拓?fù)渚垲惷芗B接區(qū)域的中樞基因(hubgene, Hub)。

1.7 中樞基因表達(dá)量及相關(guān)性分析

利用R軟件corrplot包和vioplot包進(jìn)行相關(guān)性和表達(dá)可視化，展示中樞基因在ob/ob小鼠和C57BL/6J差異及基因間相關(guān)性。

1.8 HE染色

胰腺組織室溫下用4%甲醛溶液固定24 h，病理切片厚度5 μm，使用HE染色試劑盒，蘇木精染液染色5 min，自來水沖洗5 s；分化液分化2 s，自來水沖洗20 s；伊紅染色1 min，自來水沖洗5 s；最后，脫水、透明、封片。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 ob/ob小鼠與C57BL/6J組織病理形態(tài)學(xué)

C57BL/6J小鼠組胰腺內(nèi)胰島結(jié)構(gòu)清晰規(guī)則，邊界分明，胰島細(xì)胞排列有序，形態(tài)清晰，胞質(zhì)豐富，ob/ob小鼠可見胰島增生、肥大，島內(nèi)β 細(xì)胞核增多、密集，胞質(zhì)減少，排列紊亂(圖1)。

圖1 ob/ob小鼠與C57BL/6J胰島HE染色結(jié)果

2.2 差異基因篩選

盒形圖展示不同樣本基因表達(dá)水平的分布情況，發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)水平分布大致相同(圖2A)。使用edgeR，篩選出符合條件的差異基因(logFC≥2或logFC≤-2，P<0.05)。其中ob/ob較C57BL/6J小鼠上調(diào)基因88個，下調(diào)基因94個，共182個(圖2B)。火山圖直觀展示每個比較組合的差異基因分布情況，著重顯示上調(diào)和下調(diào)前10位的基因(圖2C)。

圖2 差異基因篩選A為18只小鼠基因表達(dá)分布情況；B為ob/ob小鼠與C57BL/6小鼠差異基因熱圖，藍(lán)色為ob/ob小鼠，粉色為C57BL/6小鼠，紅色為基因在C57BL/6較ob/ob高表達(dá)，綠色為基因在C57BL/6較ob/ob低表達(dá)；C為差異基因火山圖，紅色為基因在C57BL/6較ob/ob高表達(dá)，藍(lán)色為基因在C57BL/6較ob/ob低表達(dá)。

2.3 差異基因的GO和KEGG分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫對182個差異基因進(jìn)行生物過程(biological process，BP)、細(xì)胞組成(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)的GO功能注釋，P<0.05的生物功能被認(rèn)為有意義。這些基因生物學(xué)功能主要涉及支鏈氨基酸分解代謝過程、翻譯起始調(diào)控、自噬的正調(diào)控、氨基酸轉(zhuǎn)運、神經(jīng)管封閉、細(xì)胞增殖的正調(diào)控、N-聚糖加工、蛋白質(zhì)折疊；細(xì)胞組織涉及細(xì)胞外泌體、核糖體、細(xì)胞內(nèi)核糖核蛋白復(fù)合物、線粒體內(nèi)膜、胞質(zhì)大核糖體亞基、線粒體、髓鞘、胞質(zhì)小核糖體亞基和蛋白質(zhì)復(fù)合物；分子功能主要為核糖體的結(jié)構(gòu)成分、poly(A)RNA結(jié)合、催化活性、絲氨酸型肽酶活性、碳水化合物結(jié)合、轉(zhuǎn)氨酶活性、翻譯起始因子結(jié)合、肽酶活性、mRNA結(jié)合和絲氨酸型內(nèi)肽酶活性(圖3A、B、C)。

圖3 差異基因的GO和KEGG分析A為差異基因生物過程分析(BP)；B為差異基因細(xì)胞組成分析(CC)；C為差異基因分子功能分析(MF)；D為差異基因信號通路分析。

KEGG信號通路集中在核糖體(mmu03010)、甘氨酸，絲氨酸和蘇氨酸的代謝(mmu00260)、氨基酸的生物合成(mmu01230)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工(mmu04141)、蛋白質(zhì)的消化吸收(mmu04974)、精氨酸的生物合成(mmu00220)、丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝(mmu00250)、GABA能突觸(mmu04727)、前列腺癌(mmu05215)和雌激素信號通路(mmu04915)(圖3D)。P<0.05的生物功能被認(rèn)為有意義。

2.4 Hub基因篩選

利用STRING構(gòu)建了POP差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò)(圖4A)，節(jié)點數(shù)165為邊數(shù)410，平均節(jié)點度為4.97，平均局部聚類系數(shù)為0.524。使用Cytoscape的cytohubba篩選差異基因前10位的中樞基因，分別為RPS12-ps3、Rps4x、Gm7536、Rpl7、Rpl38、Rps7、Rps15a、Rps3a1、Rpl17和Rps27a(圖4B)。用Cytoscape的MCODE構(gòu)建中樞基因模型，發(fā)現(xiàn)與cytohubba類似(圖4C、D)，Rpl34、Eif3m、Rpl22l1、Rpl24、Rpl23a-ps3、Eef1a1、Rps27a、Rpsa-ps10、Rpl17、Rps7、Rpsa、Btf3、Rps4x、Gm8730、Rps3a1、Gm7536、Rps15a、Rps12-ps3、Rpl7、RPl38。

圖4 中樞基因(hubgene, Hub)分析A為差異基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互相作用網(wǎng)絡(luò)；B為差異基因前10位的中樞基因；C為Cytoscape中MCODE構(gòu)建中樞基因模型；D為Cytoscape中MCODE構(gòu)建中樞基因模型。

2.5 Hub基因相關(guān)性分析

用corrplot包對前10位hub基因RPS12-ps3、Rps4x、Gm7536、Rpl7、Rpl38、Rps7、Rps15a、Rps3a1、Rpl17和Rps27a進(jìn)行相關(guān)性分析，除Rpl7與Rps27a呈負(fù)相關(guān)外，其余均成正相關(guān)。紅色代表正相關(guān)，藍(lán)色代表負(fù)相關(guān)，顏色越深表明相關(guān)程度越高(圖5)。

圖5 中樞差異基因相關(guān)性分析紅色代表正相關(guān)，藍(lán)色代表負(fù)相關(guān)。

2.6 Hub基因差異性分析

用vioplot包對前10位Hub基因在ob/ob小鼠C57BL/6J小鼠兩組表達(dá)量分析，Hub基因在ob/ob小鼠中均較C57BL/6J小鼠低表達(dá)，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05;圖6)。

圖6 中樞差異ob/ob小鼠與C57BL/6小鼠差異分析藍(lán)色為ob/ob小鼠，紅色為C57BL/6小鼠。各中樞基因在ob/ob小鼠組表達(dá)量較C57BL/6低。

3 討 論

真核細(xì)胞質(zhì)中核糖體是由4種不同的核糖體RNA(ribosomal RNAs, rRNA)[10]和80種核糖體蛋白(ribosomal proteins, RPs)[11]組成的高度結(jié)構(gòu)的大分子復(fù)合體，它們在翻譯合成新蛋白質(zhì)的遺傳密碼中起著核心作用。這兩個不相同但互補的功能被分成兩個核糖體亞基：分別是40 S小亞基和60 S大亞基[12]。核糖體蛋白是核糖體復(fù)合物的主要成分，其功能對于細(xì)胞生長，增殖和體內(nèi)平衡至關(guān)重要[13]。因此，核糖體的催化活性是由rRNA控制的，但許多RP在翻譯的不同步驟和方面起著重要作用。

X-連鎖的鼠核糖體蛋白S4(Rps4x)是核糖體復(fù)合體的40 S亞基的一個組成部分，人類RPS4X單倍體功能不全在Turner綜合征中起著重要作用[14]。先前的研究表明，RPS4X可能在腫瘤進(jìn)展中起重要作用，并證明RPS4X在乳腺和卵巢癌細(xì)胞系中與Y-box結(jié)合蛋白-1(YB-1)有物理上的相互作用，被確定為卵巢癌和膀胱癌的獨立預(yù)后因素[15]。一些研究表明，Rps27a可能是間充質(zhì)干細(xì)胞治療T2DM的潛在靶點[16]。本研究發(fā)現(xiàn)10個核糖體蛋白基因(RPS12-ps3、Rps4x、Gm7536、Rpl7、Rpl38、Rps7、Rps15a、Rps3a1、Rpl17和Rps27a)與瘦素缺陷ob/ob小鼠發(fā)生T2DM相關(guān)，且較C57BL/6J小鼠表達(dá)水平低。RP具有協(xié)調(diào)核糖體結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)生物合成以維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的復(fù)雜作用，還具有復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、RNA加工和DNA修復(fù)的功能。RP基因的上調(diào)可能是由于核糖體合成速率的增加，以支持蛋白質(zhì)翻譯、轉(zhuǎn)錄激活、mRNA穩(wěn)定和DNA修復(fù)等活動。因此推測，RPs水平的降低可能影響rRNA加工中的關(guān)鍵蛋白的功能[17]，從而可能導(dǎo)致T2DM的發(fā)生。

本研究發(fā)現(xiàn)10個核糖體蛋白基因(RPS12-ps3、Rps4x、Gm7536、Rpl7、Rpl38、Rps7、Rps15a、Rps3a1、Rpl17和Rps27a)與瘦素缺陷ob/ob小鼠發(fā)生T2DM相關(guān)，且較C57BL/6J小鼠表達(dá)水平低。RP具有協(xié)調(diào)核糖體結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)生物合成以維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的復(fù)雜作用，還具有復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、RNA加工和DNA修復(fù)的功能。RP基因的上調(diào)可能是由于核糖體合成速率的增加，以支持蛋白質(zhì)翻譯、轉(zhuǎn)錄激活、mRNA穩(wěn)定和DNA修復(fù)等活動。

高水平的線粒體大核糖體亞單位蛋白40可以防止酵母中線粒體DNA的丟失，然而在哺乳動物中仍沒有發(fā)現(xiàn)線粒體核糖體蛋白與代謝疾病之間相關(guān)的證據(jù)，因此推測，RP水平的降低可能影響rRNA加工中的關(guān)鍵蛋白的功能[17]，下調(diào)了胰腺中的細(xì)胞凋亡，從而可能導(dǎo)致T2DM的發(fā)生。

REG1是一種分泌型蛋白，小鼠的Reg基因位于6號染色體37的一個連續(xù)區(qū)域，研究發(fā)現(xiàn)，REG1在胰腺外分泌腺泡細(xì)胞中表達(dá)，并分泌到胰管中。據(jù)報道，REG1在再生和增生的胰島中也有特異性表達(dá)，但在正常的胰島、肝臟或腦中表達(dá)較少。然而，本研究發(fā)現(xiàn)ob/ob小鼠Reg1較C57BL/6J小鼠顯著降低，模型4D顯示Reg1可能與糖尿病發(fā)生密切相關(guān)，這恰恰證實了REG1蛋白是β細(xì)胞增殖和新生的刺激因子，對胰島β細(xì)胞復(fù)制和導(dǎo)管細(xì)胞新生過程中發(fā)揮重要作用。

本研究揭示了核糖體蛋白和Reg1蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在ob/ob小鼠中可能導(dǎo)致T2DM發(fā)病機制，發(fā)現(xiàn)了一些未見報道的T2DM相關(guān)的基因，之后的研究需要驗證篩選出的PRs基因在T2DM患者中的表達(dá)水平，明確與這些基因相關(guān)的分子機制。

綜上所述，本研究描述了可能與T2DM發(fā)生發(fā)展相關(guān)的分子機制，尋找出與之相關(guān)的相關(guān)基因，為之后研究T2DM發(fā)生發(fā)展機制提供了重要線索。