陳紫昕, 劉海燦, 屈勇剛, 鄧云麗, 宋德強, 徐春生, 祁鳳華, 萬康林, 劉志廣, 袁秀琴

(1.南華大學公共衛(wèi)生學院，湖南省衡陽市421001；2.中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所國家重點實驗室，北京市102206；3.石河子大學動物科技學院，新疆維吾爾自治區(qū)石河子市832003；4.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團第八師石河子市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆維吾爾自治區(qū)石河子市832000)

人獸共患病是發(fā)生于人和動物間的傳染性疾病，病毒、細菌或寄生蟲可作為其病原體，通過直接或間接接觸傳播給人類[1-3]。宏基因組測序技術(shù)對樣本中的核酸直接進行測序，與微生物數(shù)據(jù)庫進行比對分析，根據(jù)比對得到的序列信息判斷樣本包含的病原微生物種類，能夠快速檢測出樣本中較多的病原微生物，且無需特異性擴增[4]。由于關(guān)于中國羊體內(nèi)細菌菌群及攜帶的人獸共患病原菌的研究較少，因此本文采用宏基因組測序方法了解新疆羊呼吸道及消化道中主要的細菌種類和分布情況，以及其攜帶的人獸共患主要病原菌，為羊健康養(yǎng)殖和相關(guān)疾病預防控制提供一定的基礎(chǔ)科學數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品來源

樣品來自新疆南疆(喀什市)和北疆(石河子市)的大型牧區(qū)，于2019年8月同期進行樣品采集。其中，石河子市采得羊肛拭子140份，羊口咽拭子43份；喀什市采得羊肛拭子91份，羊口咽拭子29份，共303份樣品。為避免交叉污染，均使用一次性棉拭子采集樣品，并密封在無菌容器中，利用車載冰箱運回實驗室，保存于-70 ℃超低溫冰箱。

1.2 DNA提取及測序

收集的樣品由武漢華大基因公司進行DNA提取及檢測。按照DNA提取試劑盒(CTAB方法)提取樣品全基因組DNA。檢測DNA的完整性采用1%瓊脂糖凝膠電泳法。通過酶標儀測量DNA水平。按照同地區(qū)采集的DNA樣品混合，羊口咽樣品每6份一組，獲得12組構(gòu)建文庫；羊肛樣品每7份一組，得33組構(gòu)建文庫。文庫構(gòu)建及上機測序同由武漢華大基因科技服務(wù)有限公司完成。

1.3 序列處理及統(tǒng)計分析

BGISEQ測序所得原始序列數(shù)據(jù)用FLASH軟件進行拼接，經(jīng)Trimmomatic軟件將拼接得到的序列進行質(zhì)控過濾，使用Kraken2軟件以及配套的Minikrakenv2數(shù)據(jù)庫進行物種分類。應用R軟件進行主坐標分析(principal coordinate analysis,PCoA)和相似性分析(analysis of similarity,ANOSIM)，使用Python(V3.6包)Statsmodels(V0.10.1)進行Wilcoxon秩和檢驗分析潛在人獸共患病原菌的差異性。

2 結(jié) 果

2.1 測序數(shù)據(jù)

本研究最終獲得12組羊口咽拭子和33組羊肛拭子樣品的宏基因組數(shù)據(jù)，3 045 503 100條序列，每組樣品平均讀長均為150 bp。根據(jù)宏基因組序列數(shù)據(jù)分析，共得到4界27門47綱103目195科410屬544種。45份羊樣品中豐度占比最大的為細菌。選擇3個層級即門、屬和種的數(shù)據(jù)進行比較和展示。

2.2 不同羊樣品細菌種類的比較

2.2.1 細菌種類的比較 在門水平上，羊口咽樣品中檢出前5位的細菌為變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門和軟壁菌門；而羊肛樣品中為變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門和疣微菌門。變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門在兩種樣品的細菌豐度均為最高(圖1)。在屬水平上，羊口咽樣品中檢出前5位的細菌為莫拉氏菌屬、曼氏桿菌屬、比伯斯坦菌屬、巴氏桿菌屬和不動桿菌屬；而羊肛樣品中為擬桿菌屬、彎曲桿菌屬、埃希氏菌屬、叢毛單胞菌屬和雙歧桿菌屬。在屬水平上，羊口咽樣品的細菌物種與羊肛樣品的不大相同(圖1)。

圖1 在門水平和屬水平上不同羊樣品細菌組成圖

2.2.2 人獸共患病細菌種類的比較 在種水平上，羊口咽樣品與羊肛樣品含有潛在的人獸共患病細菌為大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌、大腸彎曲桿菌、蠟樣芽孢桿菌、豬鏈球菌、空腸彎曲桿菌、沙門氏菌和鮑曼不動桿菌。使用Wilcoxon秩和檢驗對其進行差異分析，在不同樣品間比較大腸桿菌和多殺性巴氏桿菌相對豐度差異有顯著性(P<0.01)，其他細菌差異均無顯著性(P>0.05；圖2)。

圖2 不同羊樣品人獸共患病原菌種類的比較a為P<0.01，與羊口咽樣品比較。

2.3 不同地區(qū)羊樣品細菌種類的比較

2.3.1 細菌種類的比較 在種水平上，喀什市羊口咽樣品細菌種類前3為牛莫拉氏菌、溶血性曼氏桿菌和棲瘤胃普雷沃氏菌，羊肛樣品前3為普通擬桿菌、大腸桿菌和糞擬桿菌；石河子市羊口咽樣品細菌種類前3為溶血性曼氏桿菌、山羊海藻比伯斯坦菌和牛眼莫拉氏菌，羊肛樣品前3為糞擬桿菌、叢毛單胞菌和普通擬桿菌。兩市羊口咽樣品共有的細菌種類為溶血性曼氏桿菌，羊肛樣品共有的細菌種類為普通擬桿菌和糞擬桿菌(圖3)。

圖3 在種水平上不同地區(qū)羊拭子樣品中細菌種類的比較

2.3.2 細菌種類多樣性分析 對不同地區(qū)羊口咽及羊肛樣品細菌種類進行基于Euclidean距離的PCoA分析，在屬水平上，喀什市和石河子市羊口咽樣品和羊肛樣品的細菌種類都較為相似(圖4A和B)。ANOSIM分析顯示，在門水平上，喀什市和石河子市羊口咽樣品間細菌群落差異有顯著性(圖4C)；在種水平上，喀什市和石河子市羊肛樣品間細菌群落差異有顯著性(圖4D)。

圖4 不同地區(qū)羊樣品中細菌多樣性分析和差異性分析A和B為屬水平；C為門水平；D為種水平；E和F為差異性分析。a為P<0.05，b為P<0.01，與喀什市比較。

在屬水平上使用Wilcoxon秩檢驗對不同地區(qū)羊口咽和羊肛樣品細菌種類進行差異分析，擬桿菌屬和棒狀桿菌屬在喀什市和石河子市間比較差異有顯著性(P<0.05；圖4E)；小桿菌屬、歐陸森氏菌屬、尿桿菌屬、丙酸桿菌屬和雙歧桿菌屬在喀什市和石河子市間比較差異有顯著性(P<0.05，P<0.01；圖4F)。

2.3.3 人獸共患病細菌種類的比較 在種水平上，不同地區(qū)羊口咽和羊肛樣品中存在的潛在人獸共患病細菌為多殺性巴氏桿菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、蠟樣芽孢桿菌、鮑曼不動桿菌、豬鏈球菌、大腸彎曲桿菌、空腸彎曲桿菌、化膿性鏈球菌和沙門氏菌。使用Wilcoxon秩檢驗進行差異分析發(fā)現(xiàn)，在喀什市和石河子市間比較，羊口咽樣品6種潛人獸共患病細菌均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而羊肛樣品7種潛在人獸共患病細菌中，大腸彎曲桿菌和空腸彎曲桿菌差異有顯著性(P<0.01)，其他則差異均無顯著性(P>0.05；圖5)。

圖5 不同地區(qū)羊樣品人獸共患病原菌種類的比較a為P<0.01，與喀什市比較。

3 討 論

當前大部分國內(nèi)外文獻都是基于16SrRNA測序方法對羊瘤胃、腸道菌群微生物開展研究[5-7]，很少有關(guān)于中國新疆地區(qū)羊體內(nèi)的細菌菌群及攜帶的人獸共患病原菌的分析研究。本研究基于華大基因BGISEQ測序，通過宏基因組測序技術(shù)成功地檢測了新疆羊口咽拭子及肛拭子細菌菌群的多樣性，獲得大量、全面的菌群信息。

反芻動物胃腸道的微生物組成具有較強的相似性是在門水平上，但在個體間的區(qū)別往往體現(xiàn)為物種的豐富度和多樣性[8]。在本研究羊樣品中，從不同羊樣品的研究方向來比較，在門水平上，其呼吸道和消化道的占主導的細菌菌群為變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門，這與文獻[6,9-10]研究的結(jié)果一致。有研究發(fā)現(xiàn)，擬桿菌門在綿羊腸道是優(yōu)勢物種[11]；還有研究表明，厚壁菌門、放線菌門是反芻動物腸道中豐度最高、最具代表性的門水平物種[12]；但也從候萌等[13]研究結(jié)果知研究的阿勒泰羊空腸內(nèi)的優(yōu)勢物種里沒有擬桿菌門，原因可能有：羊的品種、地理環(huán)境或者是飼喂草料的不同等。但是單從兩組樣品的各自的門分類上看，羊口咽樣品和羊肛樣品檢出前4位的微生物都相同，不同之處在于各自排名第5位的微生物：軟壁菌門(羊口咽)和疣微菌門(羊肛)。從Minozzi等[5]對綿羊后腸微生物菌群的研究可知，疣微菌門也是綿羊消化道核心菌群之一。在屬分類水平上，兩樣品的優(yōu)勢菌屬均不相同。有研究表明，擬桿菌屬在蒙古羊腸道微生物里豐度較高的優(yōu)勢物種[14]；有研究報告報導在2907個山羊樣品和2382個綿羊樣品中彎曲桿菌的檢出率分別為17.8%和12.6%[15]；Riggio等[16]也在羊的口腔黏膜采集的樣本檢測出莫拉氏菌。還有研究發(fā)現(xiàn)，莫拉氏菌屬在索馬里綿羊鼻拭子樣本中是優(yōu)勢物種[17]。

從新疆南疆喀什市和北疆石河子市兩個地區(qū)采集的羊樣品來比較分析，結(jié)果表明，在種水平上的羊口咽樣品，石河子市以溶血性曼氏桿菌、山羊海藻比伯斯坦桿菌、牛眼莫拉氏菌為優(yōu)勢菌；而喀什市采的羊口咽樣品以牛莫拉氏桿菌、棲瘤胃普雷沃氏菌、溶血性曼氏桿菌為優(yōu)勢菌。兩地的羊口咽樣品共有的細菌為溶血性曼氏桿菌，江金歡等[18]也從西藏綿羊上呼吸道分離出溶血性曼氏桿菌。在種水平上的羊肛樣品，兩地區(qū)占主導的細菌菌群種類同為普通擬桿菌、糞擬桿菌和大腸桿菌。

主坐標(PCoA)分析，即經(jīng)典多維標度(Classical multidimensional scaling)，是一種與PCA類似的用于研究數(shù)據(jù)間的相似性或者差異性的不具約束性的數(shù)據(jù)降維排序分析方法[19]。PCoA展示各個樣品間的差異大小，較近的樣本表明有很多相似的物種組成。ANOSIM分析，即相似性分析，用來檢驗組間(兩組或多組)差異是否顯著大于組內(nèi)差異，從而判斷分組是否有意義。從不同地區(qū)的羊樣本分析，在種水平上的PCoA分析得出兩地區(qū)的相同樣品間的細菌種類均相似。ANOSIM分析結(jié)果均得出兩地區(qū)相同的羊樣品間的比較有顯著差異。

在此次的研究中，不僅檢出大量常規(guī)細菌，還檢出人獸共患病原菌，且大部分屬于細菌性食源性病原菌。此次樣品發(fā)現(xiàn)的潛在的人獸共患病細菌有10種：大腸彎曲桿菌、空腸彎曲桿菌、大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌、鮑曼不動桿菌、沙門氏菌、銅綠假單胞菌、蠟樣芽孢桿菌、化膿性鏈球菌和豬鏈球菌[20]。鐘世勛等[21]對山羊鮑曼不動桿菌的病原性研究證實鮑曼不動桿菌為人獸共患病原菌。兩種羊樣品中的大腸桿菌和多殺性巴氏桿菌兩組間的比較有極顯著差異(P<0.01)；從不同地區(qū)采集的樣品方向來比較，兩地的羊口咽樣品間潛在人獸共患病細菌的比較均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而兩地的羊肛樣品間有大腸彎曲桿菌和空腸彎曲桿菌2組潛在人獸共患病細菌的比較有極顯著差異(P<0.01)。人獸共患病原菌的存在，可對羊和牧民的健康造成不良影響，還有可能通過羊源性食品這一媒介導致食源性疾病或人獸共患病的發(fā)生，影響社會的公共衛(wèi)生安全。

綜上，利用宏基因組學技術(shù)，對新疆地區(qū)羊的病原菌群組成及其呼吸和消化系統(tǒng)中的微生物多樣性特征進行細菌門、屬和種的劃分，對數(shù)據(jù)進行多樣性分析，還分別比較了不同樣品與不同地區(qū)羊細菌菌群的差異性；了解了新疆羊口咽部和肛門的菌群的優(yōu)勢菌屬和差異菌屬；檢出了以食源性傳播為主的人獸共患病原菌，表明存在一定的食品安全和疾病傳播風險。本研究為羊健康養(yǎng)殖和相關(guān)疾病預防控制提供了一定的科學數(shù)據(jù)。