劉 鑫， 劉姿琴， 楊蘇琴， 彭果然， 肖琳琳

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院1.中醫(yī)科，2.呼吸內(nèi)科， 湖南省衡陽(yáng)市 421001)

支氣管哮喘發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)為氣道上皮細(xì)胞的損傷及修復(fù)不足。細(xì)胞黏附分子1(cell adhesion molecules，CADM1)是免疫球蛋白超家族中有細(xì)胞間連接功能的一種蛋白質(zhì)[1]。CADM1在支氣管上皮細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞中均有表達(dá)，并且能介導(dǎo)細(xì)胞之間的黏附[2-3]。在維持上皮細(xì)胞完整性過(guò)程中，CADM1起著不可忽視的作用。Zhang等[4]研究發(fā)現(xiàn)，跨細(xì)胞的CADM1相互運(yùn)動(dòng)可驅(qū)動(dòng)突觸融合蛋白1向包膜的聚集，介導(dǎo)囊泡的形成，表明CADM1在胞內(nèi)外的轉(zhuǎn)運(yùn)由囊泡介導(dǎo)，而T細(xì)胞成熟相關(guān)蛋白(T-lymphocyte maturation associated protein，MAL)可參與囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)[5]，從而有助于維持上皮細(xì)胞極性。氣道上皮細(xì)胞在各種損傷因素作用下,可釋放白細(xì)胞介素-33(recombinant interleukin 33,IL-33)、胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素 (thymic stromal lymphopoietin,TSLP) ,這些細(xì)胞因子能夠作用于輔助性T細(xì)胞2(T-helper lymphocyte type 2,Th2)和固有淋巴樣2型細(xì)胞,其通過(guò)釋放Th2細(xì)胞因子, 參與哮喘的發(fā)生、發(fā)展[6]。前期研究表明，MAL在哮喘中呈下調(diào)趨勢(shì)，而柴樸湯能夠上調(diào)MAL的表達(dá)來(lái)減輕哮喘的炎癥反應(yīng)[7]。本文探討柴樸湯治療肝郁哮喘小鼠的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

健康雌性Balb/c小鼠(湖南天勤生物科技有限公司)；卵清白蛋白(美國(guó)Sigma公司)；氫氧化鋁凝膠(Thermo公司)；柴樸湯中藥配方顆粒(廣東一方制藥有限公司)；CADM1-抗體和MAL-抗體(美國(guó)Proteintech公司)。mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京康為世紀(jì)公司)；霧化器(北京歐姆龍醫(yī)療器械有限公司)； 熒光定量RCP儀(美國(guó)Thermo公司)；動(dòng)物霧化箱(有機(jī)玻璃自制)；電泳儀(北京六一公司)；旋渦混合器(江蘇其林貝爾公司)；臺(tái)式冷凍離心機(jī)(湖南湘儀公司)。

1.2 肝郁型哮喘模型的建立

18只6周齡健康雌性Balb/c小鼠，體質(zhì)量(20±2) g。將其隨機(jī)分為正常組、肝郁型哮喘組、柴樸湯組，每組6只。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，肝郁型哮喘組、柴樸湯組均按文獻(xiàn)[8]建立肝郁型哮喘模型。將肝郁型哮喘組、柴樸湯組小鼠分別于第0天和第7天予以卵白蛋白(ovalbumin,OVA)10 μg + Al(OH)3凝膠400 μg+ 生理鹽水0.2 mL腹腔注射，正常組則予以生理鹽水0.2 mL腹腔注射。第21天肝郁型哮喘組、柴樸湯組置于密閉的有機(jī)小箱內(nèi)，超聲霧化機(jī)霧化1%OVA，每天1次，每次30 min，連續(xù)霧化7天，柴樸湯組根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇柴樸湯劑量[9]，即每次霧化前半小時(shí)予以柴樸湯0.3 mL(1.5 g/kg)灌胃，正常組予以生理鹽水0.3 mL霧化。小鼠在第28天激發(fā)完成24 h后，腹腔注射10%水合氯醛0.1 mL，麻醉后腹主動(dòng)脈放血處死。

1.3 HE染色

4%甲醛將肺組織固定，常規(guī)石蠟包埋及切片，HE染色，顯微鏡下觀察肺組織形態(tài)。

1.4 Western blot法檢測(cè)CADM1、MAL、IL-33、TSLP蛋白的表達(dá)

按照試劑盒說(shuō)明書操作：配膠，制膠，跑膠，轉(zhuǎn)膜，將一抗稀釋至一定濃度，稀釋HRP標(biāo)記的二抗,二抗孵育后吸干水分，曝光、顯影，用quantity one專業(yè)灰度分析軟件進(jìn)行分析，得出平均光密度(OD值)為其蛋白表達(dá)量。

1.5 qRT-PCR法檢測(cè)CADM1、MAL、IL-33、TSLP mRNA 的表達(dá)

一步法提取肺組織總RNA，引物由上海生工合成。β-actin引物：上游：5′-ACATCCGTAAAGACCTCTATGCC-3′,下游：5′-TACTCCTGCTTGGATC CAC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度223 bp。CADM1引物：上游：5′-ATGTGGAAAACCTACGCTGA-3′，下游5′-TCCTTTACAAACCAGTCCGTTC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度150 bp。MAL引物：上游：5′-CCTTGCTGTTGCCCCTAGAACCC-3′,下游：5′-CCCCACTTTGACATCCATTCCCT-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度147 bp。IL-33引物：上游：5′-ATTCTGGCTTACGATGTTGT-3′，下游：5′-TCCTTCAGTTTCTTTACCAAC GC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度126 bp。TSLP引物：上游：5′-TGCCCTTCACTCCCCGACA-3′，下游：5′-TGTGCCATTTCCTGAGTACCG-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度113 bp。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為預(yù)變性、變性、退火、延伸、循環(huán)，其中各因子反應(yīng)條件如下：CADM1：95 ℃ 5 min，95 ℃45 s，60 ℃1 min，72 ℃1 min，35個(gè)循環(huán)；MAL：95 ℃10 min，94 ℃5 min，60 ℃45 s，72 ℃1 min，40個(gè)循環(huán)；IL-33：95 ℃30 s，95 ℃5 s，退火/延伸60 ℃20 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。 TSLP：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃1 min，60 ℃15 s共40個(gè)循環(huán)。溶解曲線采集，60～95 ℃。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 模型小鼠成功建立

造模小鼠出現(xiàn)易激、掙扎、慢性不可預(yù)見性刺激的持續(xù)，開始出現(xiàn)毛發(fā)無(wú)光澤，大便松散，活動(dòng)度減少，躲避，對(duì)刺激反應(yīng)減弱。在肝郁模型基礎(chǔ)上，予以致敏原激發(fā)后，小鼠表現(xiàn)出點(diǎn)頭呼吸、口唇發(fā)紺、腹肌收縮等表現(xiàn)，表明肝郁型哮喘模型建立成功。

2.2 病理改變

正常組小鼠氣道無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)，管壁未見明顯增厚，管腔結(jié)構(gòu)規(guī)則(圖1A)。肝郁型哮喘組氣管壁增厚明顯，支氣管內(nèi)可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，管腔不規(guī)則且變得狹窄，并可見大量黏液分泌現(xiàn)象(圖1B)。柴樸湯組病理改變較肝郁型哮喘組明顯減輕(圖1C)。

圖1 各組小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)改變(HE，400×)A為正常組； B為肝郁型哮喘組 ；C為柴樸湯組。

2.3 各組CADM1、MAL、IL-33、TSLP蛋白表達(dá)的比較

肝郁型哮喘組CADM1、MAL蛋白相較正常組和柴樸湯組明顯降低(P<0.05)，IL-33、TSLP蛋白較正常組和柴樸湯組明顯升高(P<0.05；圖2)。

圖2 各組小鼠肺組織CADM1、MAL、IL-33、TSLP蛋白表達(dá)量A為western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果；B為蛋白表達(dá)柱狀圖。a為P<0.05,與對(duì)照組比較；b為P<0.05,與肝郁型哮喘組比較。

2.4 各組CADM1、MAL、IL-33、TSLP mRNA表達(dá)的比較

肝郁型哮喘組CADM1及MAL mRNA較正常組和柴樸湯組明顯降低(P<0.05)，而IL-33、TSLP mRNA較正常組和柴樸湯組明顯升高(P<0.05；圖3)。

圖3 各組小鼠肺組織中CADM1、MAL、IL-33、TSLP mRNA表達(dá)量a為P<0.05，與正常組比較；b為P<0.05,與肝郁型哮喘組比較。

3 討 論

哮喘病機(jī)為氣與血、津液與痰的異常，肺脾腎三臟受累，而肝與痰的生成、氣之升降失常及瘀血的產(chǎn)生關(guān)系密切[10]。柴樸湯是由小柴胡及半夏厚樸湯組成，能疏肝清肺化痰，使氣機(jī)升降自如，氣血調(diào)暢而達(dá)到哮喘自平。柴樸湯通過(guò)上調(diào)MAL蛋白的表達(dá)從而抑制MAPK/ERK這一信號(hào)通路,下調(diào)支氣管上皮細(xì)胞中的TLR4和NF-kB的mRNA及其蛋白的表達(dá)來(lái)減輕炎癥反應(yīng)[9,11]。

MAL蛋白是分離于T淋巴細(xì)胞分化中晚期的一種高度疏水性蛋白，主要在上皮細(xì)胞中發(fā)揮作用。肝郁證致腎上腺皮質(zhì)激素釋放過(guò)度，進(jìn)而抑制免疫功能。免疫功能失衡易誘發(fā)哮喘，而氣道上皮細(xì)胞在氣道免疫中起著重要作用。肝郁型哮喘組小鼠肺組織MAL蛋白及mRNA的表達(dá)量明顯低于正常組(P<0.05)，表明MAL參與了肝郁型哮喘的發(fā)生。而使用柴樸湯灌胃后，MAL的表達(dá)量明顯上調(diào)。

CADM1是表達(dá)于上皮細(xì)胞中的一種跨膜糖蛋白，它能通過(guò)與相鄰細(xì)胞中表達(dá)的CADM1結(jié)合來(lái)介導(dǎo)細(xì)胞間的附著[12]。在以氣道上皮損傷為特征的肺部疾病中，如間質(zhì)性肺疾病、肺氣腫等變應(yīng)性疾病中CADM1明顯下調(diào)[13]。氣道上皮細(xì)胞的破壞能誘發(fā)氣道炎癥及重塑。本文肝郁型哮喘組小鼠CADM1表達(dá)明顯低于正常組(P<0.05)，而柴樸湯組CADM1表達(dá)量明顯高于肝郁型哮喘組(P<0.05)，提示哮喘與CADM1的下調(diào)有關(guān)，柴樸湯能夠疏肝解郁，化痰平喘，使用柴樸湯后CADM1的表達(dá)明顯上調(diào)。

支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要可概括為氣道免疫-炎癥機(jī)制、神經(jīng)調(diào)節(jié)機(jī)制及其相互作用，而Th1與Th2細(xì)胞比例的失衡(Th1細(xì)胞的減少及Th2細(xì)胞的升高)是氣道免疫-炎癥機(jī)制的重要部分。IL-33是IL-1家族中的一員，它主要表達(dá)于上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。受炎性因子影響后，IL-33的表達(dá)上調(diào)[14-15]。在哮喘的發(fā)病過(guò)程中，IL-33誘導(dǎo)Th2型免疫應(yīng)答，并在樹突狀細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和Th2細(xì)胞中與其ST2L結(jié)合并激活，從而加強(qiáng)炎癥反應(yīng)。孫博文等[16]研究提示IL-33可能與支氣管哮喘的整個(gè)慢性炎癥反應(yīng)有關(guān)。本文肝郁型哮喘組中IL-33明顯升高，提示IL-33參與了肝郁型哮喘發(fā)病的炎癥過(guò)程，柴樸湯通過(guò)抗炎途徑能夠有效下調(diào)IL-33的表達(dá)。

與IL-33類似，TSLP(胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素)作為一種上皮源性的細(xì)胞因子，主要是上調(diào)Th2表達(dá)。TSLP能夠通過(guò)樹突狀細(xì)胞來(lái)調(diào)節(jié)體內(nèi)天然免疫及適應(yīng)性免疫，導(dǎo)致上皮細(xì)胞增生肥大、黏液分泌過(guò)多，加重炎癥。在肝郁型哮喘組中，TSLP的蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)量均明顯高于正常組，使用柴樸湯后，TSLP的表達(dá)量明顯下調(diào)，這可能與柴樸湯的抗炎作用有關(guān)。

綜上，在肝郁型哮喘小鼠中柴樸湯能上調(diào)CADM1、MAL的表達(dá)，下調(diào)IL-33、TSLP的表達(dá)。