王 芳， 楊 科， 朱夢(mèng)霞， 黃 靚， 鄒飛燕， 王漢群

(南華大學(xué) 1.外科學(xué)總論教研室；2.診斷學(xué)教研室，湖南省衡陽(yáng)市 421001)

腦血管疾病因高死亡率、重致殘率嚴(yán)重威脅現(xiàn)代人健康和生命，且其發(fā)病率逐年遞增，而其中80%為缺血性腦血管疾病[1]，目前臨床上具有循證醫(yī)學(xué)證據(jù)的有效治療手段急性溶栓有時(shí)間窗的限制；另外抗凝或者早期使用阿司匹林可能同時(shí)加重出血風(fēng)險(xiǎn)，因此積極尋找預(yù)防和降低缺血性腦卒中的治療方法具有重大的臨床意義。近年來(lái)細(xì)胞免疫治療蓬勃發(fā)展，多種干細(xì)胞系用于治療腦血管疾病，并且取得了一定療效[2]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC)因具有自我更新、多向分化、易取材、體外易培養(yǎng)、免疫原性低、無(wú)倫理限制等多項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)，作為腦血管疾病新型的治療方式具有良好的應(yīng)用前景，可在嚴(yán)格把握治療時(shí)間窗和選擇注射方式的前提下進(jìn)行治療，間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生、促進(jìn)神經(jīng)元突觸之間的聯(lián)系[3]、改善神經(jīng)元周?chē)苌?、分泌神?jīng)營(yíng)養(yǎng)因子[4]、調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥[5-6]發(fā)揮修復(fù)損傷神經(jīng)元的作用。與此同時(shí)，缺血性腦卒中的炎癥機(jī)制受到越來(lái)越多的關(guān)注[7]，故本實(shí)驗(yàn)采用改良線(xiàn)栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型，研究BMSC移植治療對(duì)缺血性腦卒中模型鼠神經(jīng)功能恢復(fù)情況，以及腦組織中小膠質(zhì)細(xì)胞激活及炎癥因子表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

雄性健康成年SD大鼠24只，300～350 g(南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部)。白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白細(xì)胞介素-4(interleukin-4，IL-4)、白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)ELISA試劑盒購(gòu)于北京索萊寶生物科技有限公司；Iba-1兔抗大鼠抗體(1∶1 000，WAKO公司)，Bax、Caspase-3、Bcl-2兔抗大鼠抗體(1∶1 000，CST公司)；TTC粉末購(gòu)自Sigma公司。

1.2 動(dòng)物分組

所有大鼠均在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，維持溫度20～25 ℃,相對(duì)濕度50%～65%，自由取水，24只8周齡左右SD雄性大鼠隨機(jī)均分為空白對(duì)照組、模型組和BMSC組。空白對(duì)照組不予任何處理；模型組造模成功后予以等量生理鹽水注射；BMSC組造模成功后尾靜脈注射2×106個(gè)BMSC移植干預(yù)。

1.3 動(dòng)物模型制備及成功判定方法

參考改良線(xiàn)栓法[8]建立MCAO模型，注意線(xiàn)栓的制作，顯微鏡下觀察線(xiàn)栓不要有倒刺，注意插線(xiàn)栓的深度和角度，防止插入的位置未到或者過(guò)深損傷血管。

通過(guò)神經(jīng)行為學(xué)Bederson 6級(jí)5分評(píng)分法[9]判定模型是否成功，5級(jí)0分：無(wú)功能障礙；4級(jí)1分：對(duì)側(cè)上肢不能完全伸展；3級(jí)2分：向?qū)?cè)推時(shí)抵抗力下降；2級(jí)3分：提尾時(shí)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；1級(jí)4分：自動(dòng)轉(zhuǎn)圈；0級(jí)5分：無(wú)自發(fā)性活動(dòng)伴意識(shí)障礙。采用雙盲的原則，由第三者進(jìn)行評(píng)估，剔除有蛛網(wǎng)膜下腔出血、術(shù)后死亡或者評(píng)分0分或者5分大鼠，評(píng)分2～3分大鼠較為理想，保證模型納入標(biāo)準(zhǔn)無(wú)差異，實(shí)驗(yàn)中的大鼠予以及時(shí)補(bǔ)充。

1.4 標(biāo)本處理

移植后28天處死大鼠并采集標(biāo)本，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，一次性采血針插入心尖左心室，取心臟動(dòng)脈血于采血管中，室溫靜置30 min，以5 000 r/min離心25 min，收集上清。采血完成后，用眼科剪剪開(kāi)右心耳，開(kāi)放靜脈竇，冰生理鹽水經(jīng)心快速灌注300 mL，直至肝臟變白則說(shuō)明灌注良好，隨后迅速斷頭取腦，一部分腦組織多聚甲醛固定，蔗糖脫水，OCT包埋，冰凍切片機(jī)切片，收片備用。另一部分大鼠腦組織用手術(shù)刀片于大腦中動(dòng)脈梗死區(qū)(肉眼見(jiàn)顏色較周?chē)M織白)剪下腦組織約0.5 g,-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，余腦行TTC染色。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

用Trizol試劑盒提取大鼠腦組織總RNA，用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，SYBR試劑盒配置實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系，CFX96 Detection System進(jìn)行熒光定量PCR。

1.6 ELISA

實(shí)驗(yàn)前0.5 h拿出試劑盒回溫，板內(nèi)加入洗滌劑清洗3次，隨后加入標(biāo)準(zhǔn)品及樣品至反應(yīng)孔中，封板后于37 ℃溫箱中孵育90 min，洗板4次，每孔加入100 μL生物素化抗體至反應(yīng)孔中，封板后37 ℃溫箱中孵育60 min，洗板4次，每孔加入100 μL酶結(jié)合物工作液至反應(yīng)孔中，封板后37 ℃溫箱中孵育30 min，洗板5次，每孔加入100 μL顯色底物至反應(yīng)孔中，封板后37 ℃溫箱避光顯色15 min, 加入50 μL終止液至反應(yīng)孔中，5 min內(nèi)用酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)測(cè)量OD值。

1.7 免疫熒光

大鼠腦組織制成冰凍切片，0.3%PBST透化1 h，一抗孵育，洗一抗，二抗孵育，洗二抗，DAPI染細(xì)胞核，封片，用激光共聚焦顯微鏡拍攝組織結(jié)構(gòu)(63×)。

1.8 免疫印跡

稱(chēng)取適量大鼠腦組織，加入適量2×SDS Sample buffer(內(nèi)含磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑)，電動(dòng)研磨器充分研磨后95 ℃加熱15 min，超聲后高速離心去除未裂解的組織碎片后取上清。BCA試劑盒進(jìn)行定量，取20 μg蛋白加入上樣緩沖液上樣，80 V電壓恒定跑30 min后改為120 V跑至所需條帶到膠的中間位置，隨后290 mA恒流低溫轉(zhuǎn)膜90 min，脫脂牛奶封閉1 h，0.1%PBST清洗3次后上一抗過(guò)夜，二抗1 h，PBST清洗后顯影液顯影。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 BMSC移植后神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分降低

BMSC移植前，模型組和BMSC組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分差異無(wú)顯著性(P>0.05)；模型組及BMSC組大鼠在BMSC移植后28天評(píng)分較移植前降低；移植28天后，BMSC組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分低于模型組大鼠(P<0.05；表1)，神經(jīng)功能恢復(fù)較模型組好。

表1 兩組神經(jīng)功能缺損評(píng)分的比較 單位：分

2.2 BMSC移植對(duì)腦組織炎癥因子水平的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10及TGF-β1水平明顯升高(P<0.001)，說(shuō)明缺血再灌注損傷導(dǎo)致了炎癥因子轉(zhuǎn)錄水平增加；而與模型組比較，BMSC組IL-1β、TNF-α和IL-6水平下調(diào)，IL-4、IL-10和TGF-β1水平升高(P<0.01，圖1)，說(shuō)明BMSC可以通過(guò)降低促炎因子的轉(zhuǎn)錄和增加抗炎因子的轉(zhuǎn)錄來(lái)發(fā)揮抗損傷的作用。

圖1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)大鼠腦組織炎癥因子的轉(zhuǎn)錄水平a為P<0.001，與空白對(duì)照組比較；b為P<0.01，與模型組比較。

2.3 BMSC移植對(duì)血清炎癥因子水平的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組血清中IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10及TGF-β1的表達(dá)明顯升高(P<0.001)，說(shuō)明損傷導(dǎo)致了炎癥因子的分泌增加；而與模型組比較，BMSC組炎癥因子IL-1β、TNF-α和IL-6水平下調(diào)，IL-4、IL-10及TGF-β1水平明顯升高(P<0.01，圖2)，說(shuō)明BMSC可以降低促炎因子、增加抗炎因子的分泌以發(fā)揮抗損傷的作用。

圖2 ELISA檢測(cè)大鼠血清炎癥因子的水平a為P<0.001，與空白對(duì)照組比較；b為P<0.01，與模型組比較。

2.4 BMSC移植抑制大鼠腦組織中小膠質(zhì)細(xì)胞的激活

如圖3所示，IBA-1是小膠質(zhì)細(xì)胞的Marker，CD68是小膠質(zhì)細(xì)胞激活的Marker，與空白對(duì)照組比較，模型組腦組織中小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯增加，胞體增大，分支回縮，CD68熒光面積增加，這些指標(biāo)均指示模型組小膠質(zhì)細(xì)胞激活明顯；而與模型組比較，BMSC組小膠質(zhì)細(xì)胞激活下降，這與炎癥因子的釋放相吻合，說(shuō)明BMSC可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度激活，從而降低炎癥因子的釋放。

圖3 激光共聚焦檢測(cè)大鼠腦組織中小膠質(zhì)細(xì)胞的激活(63×)

圖4. BMSC移植對(duì)腦組織凋亡的影響(63×)A為Western blot檢測(cè)腦組織凋亡蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3的相對(duì)表達(dá)量； B為激光共聚焦檢測(cè)細(xì)胞凋亡。a為P<0.001，與空白對(duì)照組比較；b為P<0.01，與模型組比較。

2.5 BMSC移植對(duì)腦組織凋亡的影響

如圖4所示，與空白對(duì)照組比較，模型組促凋亡因子Bax、Caspase-3的表達(dá)明顯升高，抑凋亡因子Bcl-2明顯降低，說(shuō)明損傷導(dǎo)致了凋亡；而與模型組比較，BMSC組有效降低促凋亡因子Bax、Caspase-3的表達(dá)，抑凋亡因子Bcl-2明顯升高(P<0.01)，說(shuō)明BMSC可以通過(guò)抑制凋亡來(lái)發(fā)揮抗損傷的作用。

3 討 論

缺血性腦卒中是由于多種原因?qū)е履X血管狹窄或者閉塞，腦局部相對(duì)供血不足，導(dǎo)致腦組織缺血壞死，使患者產(chǎn)生多種臨床癥狀，如偏癱、失語(yǔ)、記憶力下降等，給國(guó)家及家庭帶來(lái)了極大的社會(huì)及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，目前已有研究表明干細(xì)胞移植能改善患者的腦神經(jīng)功能恢復(fù)[10]，具體機(jī)制并不十分明確，相關(guān)研究認(rèn)為與干細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞[11]，干細(xì)胞誘導(dǎo)缺血區(qū)新生血管的增加[12]，釋放多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子[13]，中和神經(jīng)毒素，支持內(nèi)皮細(xì)胞的損傷修復(fù)[14]，調(diào)節(jié)免疫炎癥相關(guān)[15]。近年來(lái)，炎癥與缺血性腦損傷的關(guān)系受到越來(lái)越多的關(guān)注，炎癥反應(yīng)是把雙刃劍[16]，早期適當(dāng)?shù)难装Y反應(yīng)能促進(jìn)組織的修復(fù)[17]，但后期炎癥反應(yīng)所導(dǎo)致的瀑布效應(yīng)會(huì)極大的損傷腦組織，導(dǎo)致腦組織功能下降，炎癥反應(yīng)已經(jīng)成為缺血性腦損傷病理的一部分，而間充質(zhì)干細(xì)胞被認(rèn)為具有免疫調(diào)節(jié)以及抗炎作用[18]，其機(jī)制可能是通過(guò)分泌可溶性細(xì)胞因子或者細(xì)胞間直接接觸來(lái)發(fā)揮作用。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，MCAO模型鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞無(wú)論是從形態(tài)還是激活的標(biāo)記物均表明過(guò)度激活，并且高表達(dá)炎癥因子，腦組織凋亡增加，而間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注射28后天相較于MCAO模型組小膠質(zhì)細(xì)胞激活下降，促炎因子降低，抗炎因子升高，凋亡蛋白下降，抗凋亡蛋白升高，且神經(jīng)功能評(píng)分在移植干預(yù)后評(píng)分明顯降低，均表明BMSC對(duì)缺血性腦損傷有修復(fù)作用，但本文主要研究的是相關(guān)表型，至于間充質(zhì)干細(xì)胞具體是通過(guò)何種機(jī)制發(fā)揮作用還需進(jìn)一步深入的研究。

大量研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)于治療缺血性腦損傷有諸多優(yōu)勢(shì)[19]，如提取較為便利，免疫原性低，定向歸巢于腦損傷區(qū)，但仍然不可忽視其存在的問(wèn)題[20]，如間充質(zhì)干細(xì)胞能跨越血腦屏障的數(shù)量較少，在損傷急性期由于血腦屏障被破壞，及時(shí)進(jìn)行細(xì)胞治療療效較好，但一旦錯(cuò)過(guò)時(shí)間窗，療效將大大降低；間充質(zhì)干細(xì)胞在分化的過(guò)程中容易導(dǎo)致基因突變，導(dǎo)致腫瘤的易感性增加；此外間充質(zhì)干細(xì)胞導(dǎo)致一定的免疫抑制作用，間充質(zhì)干細(xì)胞的移植是否會(huì)導(dǎo)致繼發(fā)性感染的發(fā)生還未可知。

BMSC移植在治療缺血性腦卒中方面的作用得到越來(lái)越多的證實(shí)，然而仍需要更多的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證一個(gè)更加科學(xué)有效的治療方案，另外細(xì)胞移植技術(shù)與其他治療手段聯(lián)用如促血管生成藥物或神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子聯(lián)用可能會(huì)有意想不到的結(jié)果，有待進(jìn)一步加以探究。