陳 宏 趙建云 張 偉 陳 群 王 兵

(1 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒一科，哈爾濱市 150040，電子郵箱：chenrongsheng1977@163.com；2 黑龍江省哈爾濱市阿城區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，哈爾濱市 150300； 3 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，哈爾濱市 150400)

肺纖維化是間質(zhì)性肺疾病常見的臨床病理改變。多種因素如空氣污染、病毒感染等，均可誘導(dǎo)肺纖維化[1]。肺纖維化患者的中位生存時間僅為2～3年，5年病死率達(dá)到40%[2]。目前治療肺纖維化的藥物存在著不同程度的副作用，臨床上亟須開發(fā)有效的治療肺纖維化的藥物[3-4]。中藥單體結(jié)構(gòu)多樣，從中藥單體中尋找有效的先導(dǎo)化合物是新藥開發(fā)的重要策略。為了尋找具有治療肺纖維化潛力的藥物，我們課題組前期篩選了大量中藥單體，發(fā)現(xiàn)橘皮苷對肺纖維化有較好的治療效果[5]。本文擬進(jìn)一步利用肺纖維化動物模型對橘皮苷抗肺纖維化的藥效進(jìn)行評價，為其臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選取同批飼養(yǎng)的雄性C57小鼠60只，體重(24.3±3.6)g，8～10周齡，購于青龍山動物繁殖中心[許可證號：SCXK(蘇)2017-0001]。小鼠飼養(yǎng)于本院動物實(shí)驗(yàn)中心，環(huán)境溫度保持(23.0±1.5)℃，相對濕度保持(50.0±3.5)%，均給予相同的常規(guī)自由飲食。本研究通過動物實(shí)驗(yàn)倫理審查委員會審查批準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)開始前，小鼠在潔凈級動物房適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由飲水和進(jìn)食。

1.2 藥品及試劑 橘皮苷購自上海賢鼎生物科技有限公司，百草枯水溶液(濃度>98%)購自百靈威科技有限公司，地塞米松(廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司，國藥準(zhǔn)字H44024469)。蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色試劑、Masson 染色試劑、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、γ-干擾素、丙二醛和髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)檢測試劑盒由北京方程生物科技有限公司提供(生產(chǎn)批號分別為bs-41734G，bs-38265G，bs-0129R，bs-30192R，bs-15934R，bs-28046R，bs-31428R)。磷酸化蛋白激酶 B(phosphorylated protein kinase B,p-Akt)、磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase， p-ERK)抗體購于Cell Signaling Technology公司(批號：K162711C、K155922D)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH，內(nèi)參)，兔源多克隆抗體(一抗，美國 ImmunoWay公司，批號B4501)，一抗稀釋液購自碧云天公司，山羊抗兔二抗購自Cell Signaling Technology公司(批號：AS016)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 TS100型倒置顯微鏡及其配套圖像采集系統(tǒng)購自尼康公司，5417R高速低溫離心機(jī)和移液器購自Eppendorf公司，UV9600分光光度計購自北京瑞麗分析儀器公司。美國Biofuge Stratos全能臺式高速冷凍離心機(jī)(上海凌儀生物科技有限公司)，日本SANYO公司MDF-382E(N)型超低溫冰箱，美國Bio-Rad 公司MP4000型凝膠成像分析系統(tǒng)，瑞士Tecan公司Infinite M200型多功能酶標(biāo)儀，日本Olympus公司熒光顯微鏡。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 分組、建模及給藥方法：將60只小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、橘皮苷高劑量組、橘皮苷中劑量組、橘皮苷低劑量組和地塞米松組，每組10只。正常組給予生理鹽水(2 mL/kg)一次性灌胃，其余組利用百草枯水溶液(劑量為100 mg/kg)一次性灌胃建模。在建模1周后，地塞米松組采用腹腔注射方式按2 mg/(kg·d)劑量給予地塞米松，橘皮苷高劑量組、橘皮苷中劑量組、橘皮苷低劑量組分別按照體重給予0.10 mL/10 g、0.06 mL/10 g、0.03 mL/10 g的橘皮苷灌胃，正常組及模型組均給予等容量的生理鹽水。均給藥1次/d。給藥期間觀察小鼠的生活狀態(tài)及體重，連續(xù)給藥3周后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測。

1.4.2 外周血指標(biāo)檢測：給藥3周后，稱重各組小鼠，然后進(jìn)行眼球靜脈叢取血1 mL， 3 500 r/min離心30 min，分離血清后將其放置在-80℃冰箱中備用。按照試劑盒說明書，用免疫組織化學(xué)法測定血清TNF-α、 γ-干擾素、TGF-β1水平。

1.4.3 肺組織丙二醛、MPO水平的測定：取血后斷頸處死小鼠，解剖小鼠后分離其新鮮肺組織并稱重。將小鼠右肺組織分裝于凍存管，迅速置入液氮罐后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。根據(jù)試劑盒說明書，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法檢測肺臟組織丙二醛及MPO水平。

1.4.4 HE染色及Masson 染色：取小鼠左肺組織，固定處理后，行石蠟包埋、切片處理，然后根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行HE染色及Masson染色操作，并于顯微鏡下觀察記錄染色結(jié)果。

1.4.5 蛋白免疫印跡法檢測p-Akt、p-ERK 蛋白的表達(dá)：取肺組織，應(yīng)用二喹啉甲酸法提取肺組織蛋白。制備10%～15%聚丙烯酰胺凝膠后將蛋白上樣，進(jìn)行電泳，濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓120 V。將聚偏二氟乙烯膜在甲醇中孵育1 min，轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)膜液中平衡，電泳結(jié)束后采用恒流150 mA，將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，轉(zhuǎn)膜時間1.5 h，將聚偏二氟乙烯膜置于水平搖床上，5%脫脂奶粉室溫封閉 1 h，TBST漂洗膜5次，5 min/次。根據(jù)抗體說明書，用TBST按1 ∶1 000稀釋一抗(p-Akt、p-ERK)和GAPDH抗體。于4℃下孵育一抗過夜，用洗膜液漂洗膜5次，5 min/次，選擇合適的二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔 IgG)，用TBST按1 ∶5 000稀釋，將膜置于二抗稀釋液中，室溫孵育1 h，清洗后加上電化學(xué)發(fā)光劑顯色，應(yīng)用美國Bio-Rad 公司 MP4000型凝膠成像分析系統(tǒng)上機(jī)檢測。以GAPDH為內(nèi)參。用Quality One軟件，運(yùn)用Image J圖像分析系統(tǒng)測定條帶灰度值，采用目的蛋白與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料采用(x±s)表示，符合正態(tài)分布且方差齊的數(shù)據(jù)采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)方法。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠肺組織病理學(xué)變化 正常組小鼠肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，肺部支氣管以及肺泡結(jié)構(gòu)完整；模型組小鼠的肺組織嚴(yán)重破壞，肺泡結(jié)構(gòu)消失，大量纖維組織增生；與模型組相比，地塞米松組小鼠肺組織炎性細(xì)胞浸潤緩解，肺泡結(jié)構(gòu)相對比較完整；不同劑量橘皮苷組小鼠的肺組織肺纖維化程度明顯減輕，肺泡結(jié)構(gòu)相對更加完整。見圖1、圖2。

圖1 6組小鼠肺組織HE染色結(jié)果(×400)

圖2 6組小鼠肺組織Masson染色結(jié)果(×400)

2.2 各組血清炎癥因子水平的比較 與正常組相比，模型組血清TGF-β1、TNF-α水平升高，血清γ-干擾素水平下降(均P<0.05)；與模型組比較，不同劑量橘皮苷和地塞米松組血清TGF-β1、TNF-α水平降低，橘皮苷中、高劑量組血清γ-干擾素水平升高(均P<0.05)；與地塞米松組相比，僅橘皮苷高劑量組的血清TNF-α水平降低，血清γ-干擾素水平升高(均P<0.05)；橘皮苷低劑量組、橘皮苷中劑量組、橘皮苷高劑量組的血清TNF-α和TGF-β1水平依次降低，血清γ-干擾素水平依次升高，且橘皮苷高劑量組血清TGF-β1水平低于其他劑量組(均P<0.05)。見表1。

表1 6組血清炎癥因子水平的比較(x±s，pg/mL)

2.3 各組肺組織丙二醛和MPO水平的比較 與正常組相比，模型組肺組織中丙二醛、MPO水平升高(均P<0.05)；橘皮苷不同劑量組和地塞米松組肺組織中的丙二醛、MPO水平均低于模型組(均P<0.05)；橘皮苷不同劑量組丙二醛、MPO水平均低于地塞米松組(均P<0.05)；橘皮苷低劑量組、橘皮苷中劑量組、橘皮苷高劑量組的肺組織中丙二醛水平依次降低，且橘皮苷高劑量組MPO水平低于其他劑量組(均P<0.05)。見表2。

表2 6組肺臟組織丙二醛和MPO 水平的比較(x±s)

2.4 各組肺組織中p-Akt、p-ERK 蛋白表達(dá)水平的比較 與正常組相比，模型組肺組織中p-Akt、p-ERK蛋白相對表達(dá)水平升高(均P<0.05)；與模型組相比，地塞米松組肺組織中p-Akt、p-ERK蛋白相對表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，橘皮苷不同劑量組肺組織中p-Akt、p-ERK蛋白相對表達(dá)水平降低(均P<0.05)；與地塞米松組相比，橘皮苷不同劑量組肺組織中p-Akt蛋白相對表達(dá)水平、橘皮苷高劑量組和橘皮苷中劑量組肺組織中p-ERK蛋白相對表達(dá)水平均降低(均P<0.05)；橘皮苷高劑量組肺組織中p-Akt蛋白相對表達(dá)水平低于其他劑量組，且p-ERK蛋白相對表達(dá)水平低于橘皮苷低劑量組(均P<0.05)。見圖3、表3。

圖3 各組小鼠p-Akt、p-ERK蛋白的表達(dá)

表3 6組肺組織中p-Akt、p-ERK蛋白相對表達(dá)水平的比較(x±s)

3 討 論

肺纖維化是間質(zhì)性肺疾病的主要病理改變[6]，其以大量成纖維細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)聚集為主要特征。肺纖維化患者的中位生存時間為2～3年，5年病死率達(dá)到40%[7]，但其治愈率低[8]。目前，治療該疾病的藥物較為匱乏[9]，且治療效果不甚理想。中藥單體化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣，從中藥單體中尋找有效的先導(dǎo)化合物可為治療肺纖維化的新藥開發(fā)提供指導(dǎo)[10-12]。此外，中藥單體的化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎多樣，從中尋找先導(dǎo)化合物是新藥開發(fā)的重要手段，可以為后期進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾，提供多種結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，加快藥物的發(fā)現(xiàn)過程[13]。

為了尋找具有治療肺纖維化作用的新藥物，課題組前期篩選了多個中藥單體，初步研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)橘皮苷對肺纖維化具有較好的治療效果[14]。橘皮苷是從陳皮中提取出來的黃酮類有效成分[15]。研究表明，橘皮苷具有抗炎、抑制急性肺損傷、治療非酒精性脂肪肝和代謝綜合征等功效，其對肺纖維化干預(yù)作用的相關(guān)研究報告較少[16]。

本研究采用百草枯一次性灌胃建立肺纖維化小鼠模型，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠的肺組織嚴(yán)重破壞，肺泡結(jié)構(gòu)消失，大量纖維組織增生，提示成功建立肺纖維化小鼠模型。給予臨床常用抗纖維化藥物地塞米松以及中藥單體橘皮苷分別進(jìn)行干預(yù)發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，地塞米松組肺組織炎性細(xì)胞浸潤緩解，肺泡結(jié)構(gòu)相對比較完整，而不同劑量橘皮苷組小鼠的肺組織肺纖維化程度明顯減輕，肺泡結(jié)構(gòu)相對更加完整。這提示橘皮苷也具有抗肺纖維化的作用，且效果優(yōu)于臨床常用藥物地塞米松。

肺纖維化是由于肺臟受到傷害后，在修復(fù)的過程中成纖維細(xì)胞過度增生及膠原蛋白生成，使肺部間質(zhì)形成大量纖維結(jié)締組織。引起肺部間質(zhì)組織發(fā)生炎癥反應(yīng)的原因包括空氣污染物、過敏原、細(xì)菌或病毒、吸入有毒氣體、空氣微粒以及香煙等。肺部組織受到刺激后引起免疫反應(yīng)的發(fā)生，大量白細(xì)胞自肺部微血管浸潤至肺組織中，分泌許多炎癥介質(zhì)，如TNF-α、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6、IL-8，而這些炎癥介質(zhì)又募集更多的白細(xì)胞浸潤，使得炎癥反應(yīng)加劇。有研究顯示，橘皮苷可抑制絲裂原活化蛋白激酶及核因子κB蛋白的表達(dá)，從而減少炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1、IL-6生成；橘皮苷可通過發(fā)揮抗炎作用，提高敗血癥小鼠的生存率；同時，橘皮苷還可以減輕急性肺損傷小鼠模型的炎癥反應(yīng)，以及抑制卵白蛋白引起的呼吸道炎癥反應(yīng)，改善氣喘癥狀；另外，橘皮苷也被證實(shí)可減緩氧化反應(yīng)造成的神經(jīng)細(xì)胞死亡[17]。本研究結(jié)果顯示，肺纖維化小鼠的血清炎癥因子TGF-β1、TNF-α以及氧化應(yīng)激指標(biāo)丙二醛、MPO水平均升高，而具有抗纖維化作用的血清γ-干擾素水平下降(均P<0.05)，提示肺纖維化小鼠體內(nèi)炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)明顯。接受地塞米松或橘皮苷干預(yù)后，小鼠的炎癥因子和氧化應(yīng)激指標(biāo)水平均下降，而γ-干擾素水平升高(均P<0.05)，且高劑量橘皮苷的干預(yù)效果最為明顯(均P<0.05)。這表明橘皮苷可減輕肺纖維化引起的炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)。

我們進(jìn)一步分析了各組小鼠肺組織中p-Akt、p-ERK蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組肺組織中p-Akt、p-ERK蛋白相對表達(dá)水平升高(均P<0.05)，這提示肺纖維化的發(fā)生可能與AKT、ERK等通路失調(diào)有關(guān)。我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，地塞米松組小鼠肺組織中p-Akt、p-ERK蛋白相對表達(dá)水平差異并無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但橘皮苷不同劑量組小鼠肺組織中p-Akt、p-ERK蛋白相對表達(dá)水平均降低(均P<0.05)，且橘皮苷高劑量組的干預(yù)效果相對顯著。由此推測，橘皮苷可能通過調(diào)控蛋白激酶B、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶等介導(dǎo)抗炎、抗氧化及抗凋亡的信號通路，發(fā)揮減輕肺損傷、抗肺纖維化的作用。

綜上所述，橘皮苷對于百草枯導(dǎo)致的小鼠肺纖維化具有改善作用，這可能與其抗氧化應(yīng)激作用以及通過調(diào)控蛋白激酶B/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶信號通路發(fā)揮抗炎癥有關(guān)。因此，從中藥單體中尋找抗肺纖維化的有效成分，并且闡明其藥理機(jī)制，對于其臨床應(yīng)用及新藥開發(fā)具有重要的意義。