高 瑕，代文靜，曾 軍，馮 同，李萬(wàn)成

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種不可逆轉(zhuǎn)的慢性、進(jìn)行性、致命性肺部疾病，預(yù)后較差，中位生存期2～4年[1]，5年生存率<30%[2]，最終多因呼吸衰竭死亡。IPF發(fā)生的主要病理機(jī)制是因毒物、射線和環(huán)境等各種因素導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞持續(xù)受到損傷，隨后肺成纖維細(xì)胞不斷增殖和凋亡造成大量促炎、促纖維化因子釋放及大量細(xì)胞外基質(zhì)沉積于肺，最后導(dǎo)致肺纖維化形成[3]。IPF的發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，具體機(jī)制至今仍尚未完全明確，除了各種促纖維化因子異常表達(dá)外，有研究發(fā)現(xiàn)氧化-抗氧化失衡導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)也參與了肺纖維化的形成[4]。近年，IPF發(fā)病率不斷升高[5]。雖現(xiàn)臨床對(duì)肺纖維化治療的研究已廣泛開(kāi)展，但有效的治療選擇仍然有限[6]，糖皮質(zhì)激素仍是治療IPF的主要藥物。因此，探尋肺纖維化發(fā)病機(jī)制及尋找其他治療肺纖維化有效藥物已成為臨床亟待解決的問(wèn)題。

異甘草酸鎂(MgIG)是從藥用植物甘草根部提取的具有抗炎、抗凋亡、抗纖維化和抗腫瘤等多種生物活性的物質(zhì)，是甘草酸第4代合成藥物[7]，在治療肝炎和肝纖維化方面有較好的效果[8]。近年有研究發(fā)現(xiàn)，MgIG對(duì)百草枯中毒導(dǎo)致的肺部損傷和放射誘導(dǎo)的肺纖維化也有一定治療作用[9-11]。然而，現(xiàn)MgIG應(yīng)用于博來(lái)霉素(BLM)誘導(dǎo)的肺纖維化模型中的研究甚少，故本研究通過(guò)氣管內(nèi)注射BLM構(gòu)建肺纖維化大鼠模型，分析MgIG對(duì)其血清中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量和肺組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、γ-干擾素(interferon-γ，IFN-γ)表達(dá)的影響，探討MgIG對(duì)肺纖維化治療作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)成年健康雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量(220+20)g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK(川)2019-189]。

1.1.2主要試劑：BLM粉劑購(gòu)自成都梓誠(chéng)奕博生物科技有限公司，MgIG注射液購(gòu)自正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉(MTH)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)容生制藥有限公司，Masson染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司，SOD和MDA檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程公司，TGF-β1、TNF-α和IFN-γ抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，RIPA裂解液、廣譜蛋白酶抑制劑、BCA蛋白測(cè)定試劑盒購(gòu)自武漢BOSTER生物公司。

1.1.3主要儀器：生物組織包埋機(jī)、全自動(dòng)切片機(jī)(金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司生產(chǎn))，熒光倒置顯微鏡(德國(guó)Leica公司生產(chǎn))，凝膠成像儀(上海天能科技有限公司生產(chǎn))。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物模型制備及藥物干預(yù)：將24只SD大鼠隨機(jī)分為Control組、BLM組、BLM+MgIG組和BLM+MTH組4組，每組6只。每只大鼠腹腔注射10%水合氯醛(劑量0.3 ml/100 g)進(jìn)行麻醉，消毒大鼠頸部皮膚，按無(wú)菌原則切開(kāi)頸部皮膚，逐層分離組織，暴露氣管。BLM組、BLM+MgIG組和BLM+MTH組向氣管內(nèi)緩慢注射BLM溶液(劑量5 mg/kg)，Control組向氣管內(nèi)注入等量0.9%氯化鈉注射液。注射后立即將大鼠旋轉(zhuǎn)幾分鐘，使藥物盡可能均勻分布于肺部。造模成功24 h后，BLM+MgIG組每日腹腔注射30 mg/kg MgIG注射液1次，BLM+MTH組每日腹腔注射4.5 mg/kg注射用MTH 1次，Control組和BLM組每日腹腔注射等量0.9%氯化鈉注射液。

1.2.2取材及病理組織學(xué)觀察：連續(xù)給藥28 d后，處死所有大鼠，切開(kāi)腹腔，取腹主動(dòng)脈全血5 ml，吸取離心后的上清液保存于-80℃，待全部血清采集完后按照SOD及MDA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行操作。取左肺下葉組織固定于4%多聚甲醛中，置于4℃冰箱過(guò)夜后進(jìn)行組織脫水、包埋、切片，Masson染色進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。參照Szapiel等[12]報(bào)道的方法對(duì)肺纖維化程度進(jìn)行評(píng)分:無(wú)纖維化為0分，纖維化面積<20%為1分，纖維化面積20%～50%為2分，纖維化面積≥50%為3分。

1.2.3免疫組織化學(xué)檢查：組織脫蠟、水化，3%過(guò)氧化氫孵育8 min消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，微波爐中火10 min修復(fù)抗原，滴加5% BSA封閉30 min，分別滴加TGF-β1(1∶200)、TNF-α(1∶400)和IFN-γ(1∶200)抗體，4℃冰箱過(guò)夜，滴加二抗37℃孵育30 min，滴加DAB顯色劑顯色，復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯透明，封片，顯微鏡下觀察。

1.2.4蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)：取150 mg肺組織，在液氮中不斷研磨組織，裂解液和廣譜蛋白酶抑制劑裂解組織，離心，提取組織蛋白，配置蛋白標(biāo)準(zhǔn)配置液和BCA工作液，按照說(shuō)明書進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，制備分離膠和濃縮膠，將聚合好的濃縮膠玻璃板放入電泳槽，加入樣品，打開(kāi)電泳儀跑膠，跑膠結(jié)束后準(zhǔn)備PVDF膜、濾紙及海綿立即進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉中進(jìn)行封閉，滴加一抗GAPDH(1∶200)、TGF-β1(1∶800)、TNF-α(1∶800)和IFN-γ(1∶400)，4℃冰箱過(guò)夜，加入二抗，洗膜，滴加發(fā)光液，凝膠掃描成像曝光成像。

2 結(jié)果

2.1Masson染色及肺纖維化評(píng)分比較 Masson染色結(jié)果顯示，Control組肺組織未出現(xiàn)病理改變，肺泡結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)正常，未見(jiàn)膠原纖維沉積；BLM組肺組織出現(xiàn)明顯病理改變，肺泡正常結(jié)構(gòu)消失，肺組織重建，可見(jiàn)大量藍(lán)色膠原纖維沉積，纖維化程度明顯；BLM+MgIG組和BLM+MTH組肺泡結(jié)構(gòu)破壞和纖維組織增生程度較BLM組均有所減輕，藍(lán)色膠原纖維相較于BLM組也均有所減少，但BLM+MgIG組病變減輕程度較BLM+MTH組更明顯，見(jiàn)圖1。肺纖維化程度評(píng)分結(jié)果顯示，Control組、BLM組、BLM+MgIG組和BLM+MTH組分別為(0.02±0.001)、(2.94±0.03)、(1.62±0.06)和(1.85±0.05)分，4組總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Control組低于其他3組，BLM組高于BLM+MgIG組和BLM+MTH組，BLM+MgIG組低于BLM+MTH組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 采用不同處理方式大鼠4組肺組織病理組織學(xué)檢查結(jié)果(Masson×200)

2.2血清SOD和MDA含量比較 Control組、BLM組、BLM+MgIG組和BLM+MTH組4組血清SOD和MDA含量總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Control組血清SOD高于其他3組，血清MDA低于其他3組；BLM組血清SOD低于BLM+MgIG組和BLM+MTH組，血清MDA高于BLM+MgIG組和BLM+MTH組；BLM+MgIG組血清SOD高于BLM+MTH組，血清MDA低于BLM+MTH組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 采用不同處理方式大鼠4組血清SOD和MDA含量比較

2.3免疫組織化學(xué)檢查結(jié)果比較 TGF-β1：Control組肺泡結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)或極少有棕黃色TGF-β1表達(dá)；BLM組肺組織破壞明顯，可見(jiàn)大量棕黃色TGF-β1表達(dá)；BLM+MgIG組和BLM+MTH組肺組織棕黃色表達(dá)區(qū)域較BLM組減少，見(jiàn)圖2。TNF-α：Control組未見(jiàn)或有少許TNF-α表達(dá)；BLM組TNF-α表達(dá)較Control組明顯增加；BLM+MgIG組和BLM+MTH組TNF-α棕黃色表達(dá)區(qū)域較BLM組減少，見(jiàn)圖3。IFN-γ：Control組可見(jiàn)大量IFN-γ棕黃色表達(dá)；BLM組肺組織破壞明顯，可見(jiàn)少許棕黃色I(xiàn)FN-γ表達(dá)；BLM+MgIG組和BLM+MTH組棕黃色表達(dá)區(qū)域較BLM組增加，見(jiàn)圖4。Control組、BLM組、BLM+MgIG組和BLM+MTH組4組肺組織TGF-β1、TNF-α和IFN-γ表達(dá)總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Control組肺組織TGF-β1和TNF-α表達(dá)低于其他3組，肺組織IFN-γ表達(dá)高于其他3組；BLM組肺組織TGF-β1和TNF-α表達(dá)高于BLM+MgIG組和BLM+ MTH組，肺組織IFN-γ表達(dá)低于BLM+MgIG組和BLM+MTH組；BLM+MgIG組肺組織TGF-β1和TNF-α表達(dá)低于BLM+MTH組，肺組織IFN-γ表達(dá)高于BLM+MTH組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 采用不同處理方式大鼠4組肺組織TGF-β1、TNF-α和IFN-γ表達(dá)平均積分光密度)

圖2 采用不同處理方式大鼠4組肺組織TGF-β1免疫組織化學(xué)檢查結(jié)果(免疫組織化學(xué)×400)

圖3 采用不同處理方式大鼠4組肺組織TNF-α免疫組織化學(xué)檢查結(jié)果(免疫組織化學(xué)×400)

圖4 采用不同處理方式大鼠4組肺組織IFN-γ免疫組織化學(xué)檢查結(jié)果(免疫組織化學(xué)×400)

2.4蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果比較 大鼠肺組織TGF-β1和TNF-α蛋白Control組表達(dá)量較低，BLM組表達(dá)量升高，BLM+MgIG組和BLM+MTH組表達(dá)量低于BLM組；大鼠肺組織IFN-γ蛋白Control組表達(dá)量較高，BLM組表達(dá)量降低，BLM+MgIG組表達(dá)量較BLM組明顯增加，BLM+MTH組和BLM組表達(dá)量比較無(wú)明顯差異，見(jiàn)圖5。

圖5 采用不同處理方式大鼠4組肺組織TGF-β1、TNF-α和IFN-γ蛋白表達(dá)比較

3 討論

IPF是一種以肺泡上皮細(xì)胞損傷、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、成纖維細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)異常積聚和肺組織重建異常為特征的致命性進(jìn)展性肺部疾病[13]。氣管內(nèi)注射BLM誘導(dǎo)的肺纖維化動(dòng)物模型與人類IPF的進(jìn)程最為相似，這也是目前應(yīng)用最經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)性肺纖維化動(dòng)物模型[14]。本研究通過(guò)大鼠氣管內(nèi)注射BLM構(gòu)建肺纖維化模型，Masson染色結(jié)果顯示，Control組肺組織未出現(xiàn)病理改變，肺泡結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)正常，未見(jiàn)膠原纖維沉積；BLM組肺組織出現(xiàn)明顯病理改變，肺泡正常結(jié)構(gòu)消失，肺組織重建，可見(jiàn)大量藍(lán)色膠原纖維沉積，纖維化程度明顯，表明本研究模型構(gòu)建是成功的。

雖然肺纖維化的發(fā)病機(jī)制現(xiàn)尚未完全明確，但越來(lái)越多的研究表明，氧化應(yīng)激在IPF中起著重要作用[15-16]。分析其原因主要是由于氧化劑和抗氧化蛋白功能不平衡，氧化應(yīng)激通過(guò)激活氧化還原敏感信號(hào)通路、改變免疫細(xì)胞功能和激活成纖維細(xì)胞，進(jìn)而參與肺纖維化形成。正常的肺內(nèi)穩(wěn)態(tài)需要細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外氧化劑和抗氧化劑之間的適當(dāng)平衡。保護(hù)性抗氧化劑和抗氧化酶可保護(hù)肺免受氧化劑侵害[17]。SOD和MDA是反映機(jī)體抗氧化能力和細(xì)胞氧化劑對(duì)機(jī)體損傷的2個(gè)重要指標(biāo)[18]。SOD是人體內(nèi)重要的抗氧化金屬酶。MDA是膜脂過(guò)氧化最重要的產(chǎn)物之一，可間接反映細(xì)胞損傷的程度。楊軍[19]研究發(fā)現(xiàn)，在BLM誘導(dǎo)肺纖維化大鼠模型中，中藥黃芪可通過(guò)增加SOD活性，降低MDA含量，達(dá)到治療肺纖維化的作用。本研究結(jié)果顯示，Control組血清SOD高于其他3組，血清MDA低于其他3組；BLM組血清SOD低于BLM+MgIG組和BLM+MTH組，血清MDA高于BLM+MgIG組和BLM+MTH組；BLM+MgIG組血清SOD高于BLM+MTH組，血清MDA低于BLM+MTH組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明BLM誘導(dǎo)肺纖維化大鼠模型血清SOD含量明顯下降，血清MDA含量明顯增加，且給予藥物干預(yù)后血清SOD含量有所升高，MDA含量有所下降。進(jìn)一步證明氧化應(yīng)激參與了BLM致肺纖維化的形成，并提示MgIG可能通過(guò)減輕氧化應(yīng)激緩解肺纖維化。

TGF-β1是肺纖維化進(jìn)展過(guò)程中主要促纖維化細(xì)胞因子，誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化，產(chǎn)生高水平膠原，導(dǎo)致肺彈性和功能的喪失[20]。黃坤等[21]研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1在BLM誘導(dǎo)的肺纖維化模型組中表達(dá)明顯增加，甘草酸二胺聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療后TGF-β1表達(dá)降低，且肺纖維化得到一定程度的緩解。此外，TNF-α也是參與肺纖維化形成的重要細(xì)胞因子。張興和張煒[22]研究表明在肺間質(zhì)纖維化模型中，TNF-α表達(dá)明顯升高，給予生地提取物干預(yù)后TNF-α表達(dá)有所下降。本研究結(jié)果顯示，Control組肺組織TGF-β1和TNF-α表達(dá)低于其他3組，BLM組肺組織TGF-β1和TNF-α表達(dá)高于BLM+MgIG組和BLM+MTH組，BLM+MgIG組肺組織TGF-β1和TNF-α表達(dá)低于BLM+MTH組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明BLM誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠模型肺組織TGF-β1和TNF-α表達(dá)均升高，給予藥物干預(yù)后肺組織TGF-β1和TNF-α表達(dá)有所下降。IFN-γ是一種抗纖維化細(xì)胞因子，殷宗寶等[23]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在肺纖維化大鼠模型中，大鼠肺組織IFN-γ染色較淡，表達(dá)水平顯著下降，甘草酸二銨干預(yù)后IFN-γ染色反應(yīng)增強(qiáng)且表達(dá)水平較模型組有所增加。本研究結(jié)果顯示，Control組肺組織IFN-γ表達(dá)高于其他3組，BLM組肺組織IFN-γ表達(dá)低于BLM+MgIG組和BLM+MTH組，BLM+MgIG組肺組織IFN-γ表達(dá)高于BLM+MTH組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明BLM誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠模型肺組織IFN-γ表達(dá)下降，經(jīng)藥物干預(yù)后肺組織IFN-γ表達(dá)上調(diào)。

總之，MgIG能改善BLM誘導(dǎo)肺纖維化大鼠肺纖維化，機(jī)制可能與減輕氧化應(yīng)激，抑制炎性因子表達(dá)，促進(jìn)抗纖維化因子分泌有關(guān)。