謝 軍 龍曉茹 任 洛 劉恩梅 謝曉虹

(1 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院兩江呼吸科，2 兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、國(guó)家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心、兒童發(fā)育重大疾病國(guó)家國(guó)際科技合作基地、兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市 400014，電子郵箱：cyxiejun@126.com；3 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院兩江感染科，重慶市 400014)

β干擾素Toll/白細(xì)胞介素1受體結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(Toll/interleukin 1 receptor domain containing adaptor inducing interferon-β，TRIF)是含TIR結(jié)構(gòu)域接頭蛋白家族中最長(zhǎng)的分子，含712個(gè)氨基酸，也是Toll受體(Toll-like receptor，TLR)家族中TLR3、TLR4信號(hào)通路關(guān)鍵的銜接分子，參與天然免疫和適應(yīng)性免疫，在抗病毒感染中有重要作用[1]。研究表明，呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)感染可活化TRIF，介導(dǎo)γ-干擾素高表達(dá),從而參與氣道炎癥和氣道高反應(yīng)，而非特異性抑制TRIF可減輕RSV引起的氣道炎癥和高反應(yīng)性[2-3]。為了更好地探討TRIF信號(hào)通路在病毒感染，尤其是在RSV感染中的作用，建立一個(gè)局部TRIF低表達(dá)動(dòng)物模型十分必要，而目前尚沒有肺組織局部沉默TRIF的小鼠模型。本研究旨在采用一種簡(jiǎn)便且無(wú)創(chuàng)的慢病毒介導(dǎo)短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)干擾技術(shù)建立BALB/c小鼠局部肺組織TRIF低表達(dá)模型，探討TRIF在RSV感染中的作用及其潛在的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 TRIF慢病毒載體的構(gòu)建 本實(shí)驗(yàn)中所用的shRNA慢病毒載體由上海吉?jiǎng)P基因有限公司提供。事先已設(shè)計(jì)并合成4條針對(duì)TRIF的shRNA干擾質(zhì)粒，并采用小鼠巨噬細(xì)胞系RAW246.7篩選出沉默效果最優(yōu)的干擾序列，然后進(jìn)行載體的構(gòu)建和慢病毒包裝。TRIF-shRNA序列5′-GGACCACTCAGAAACATCT-3′，對(duì)照CON-shRNA序列5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。質(zhì)粒載體信息：GV115載體，原件順序hU6-MCS-CMV-EGFP。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型的建立 無(wú)特定病原體級(jí)6～8周齡雌性Balb/c小鼠18只，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK(渝)2018-003],飼養(yǎng)于ⅣC級(jí)環(huán)境中，飼料、飲用水均經(jīng)過(guò)嚴(yán)格消毒滅菌，實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程均按照重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)要求進(jìn)行[SCXK(渝) 2012-0001以及SYXK(渝) 2012-0001]。采用隨機(jī)數(shù)字表法將Balb/c小鼠分為空白組、實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組，每組6只。采用水合氯醛0.3 mL/kg腹腔注射麻醉小鼠，待麻醉成功后將50 μL滴度為1×108TU/mL的病毒液(病毒滴度的設(shè)置參考文獻(xiàn)[4])經(jīng)鼻滴注：提起小鼠雙耳及頭頸部皮膚，使其完全豎直，將含TRIF-shRNA(實(shí)驗(yàn)組)或?qū)φ章《据d體(對(duì)照組)的病毒液25 μL 經(jīng)一側(cè)鼻孔快速滴入(時(shí)間在10 s內(nèi))，導(dǎo)入小鼠肺組織內(nèi)，然后用絲線鉤住小鼠牙齒，懸掛小鼠使其身體豎直約3 min后再于另一側(cè)鼻孔滴入25 μL病毒液(時(shí)間在10 s內(nèi))，空白組按照上述方法經(jīng)兩側(cè)鼻孔分別滴入磷酸緩沖鹽溶液25 μL。所有操作均在生物安全柜中進(jìn)行，滴鼻后小鼠仍飼養(yǎng)于ⅣC級(jí)環(huán)境中，第8天處死小鼠后收集其肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、心臟組織。

1.3 肺組織冰凍切片 脫頸處死小鼠后，取出肺組織，于4%多聚甲醛中固定24 h，30%蔗糖脫水24 h，于-20℃冰凍切片機(jī)內(nèi)包埋、切片，連續(xù)10 μm切薄片并予載玻片附貼組織切片，室溫下避光放置30 min后，磷酸緩沖鹽溶液清洗3次，使用5 mg/mL的4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI；碧云天公司，批號(hào)：C1005)在室溫下行細(xì)胞核染色30 min后，磷酸緩沖鹽溶液清洗3次后干燥封片，于熒光顯微鏡(日本Olympus公司,BX53)下觀察肺組織綠色熒光蛋白表達(dá)情況。

1.4 定量PCR檢測(cè)TRIF表達(dá)水平 根據(jù)RNA提取試劑盒(TaKaRa公司，RNAiso Plus，批號(hào)：9108)說(shuō)明書提取肺臟、肝臟、脾臟、心臟、腎臟組織總RNA，紫外分光光度計(jì)定量后，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa Clontech公司，批號(hào)：639547)說(shuō)明書取2 μg RNA 37℃反轉(zhuǎn)錄15 min，85℃反轉(zhuǎn)錄5 s。采用TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems公司，批號(hào)：4304437)檢測(cè)TRIF表達(dá)水平，反應(yīng)體系包括Mix 10 μL、上游引物 0.3 μL、下游引物 0.3 μL、cDNA 2 μL、超純水7.4 μL。反應(yīng)步驟：50℃ 2 min;95℃ 10 min;95℃ 15 s;60℃ 1 min， 40個(gè)循環(huán)。PCR儀購(gòu)自Bio-Rad公司(型號(hào)：CFX960 Touch)。TRIF及內(nèi)參β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)引物均由華大基因合成，引物序列見表1。采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)肺組織TRIF蛋白表達(dá) 按照全蛋白提取試劑盒(美國(guó)Active Motif公司，批號(hào)：40010)操作說(shuō)明提取肺組織總蛋白，按照蛋白定量試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：KGP902)操作說(shuō)明，采用二喹啉甲酸法定量蛋白。80 μg總蛋白上樣，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠經(jīng)過(guò)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗TRIF(Abcam公司，批號(hào)：ab13810；稀釋比例1 ∶20 000)、β-actin(康為世紀(jì)生物科技有限公司，批號(hào)：CW0096M；稀釋比例1 ∶10 000)4 ℃孵育過(guò)夜，經(jīng)洗膜后二抗(杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：GAR0072；稀釋比例1 ∶10 000)室溫孵育1 h，隨后采用ECL化學(xué)發(fā)光液(Bio-Rad公司，批號(hào)：1705062)檢測(cè)蛋白信號(hào)并通過(guò)Quantity One 軟件 (Bio-Rad公司) 進(jìn)行蛋白定量分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 5.03軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肺組織中綠色熒光蛋白的表達(dá) 轉(zhuǎn)染后實(shí)驗(yàn)組肺組織可見明顯綠色熒光蛋白表達(dá)，見圖1，藍(lán)色DAPI表示細(xì)胞核，綠色EGFP代表綠色熒光蛋白。

2.2 各組小鼠肺組織中TRIF mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)水平 實(shí)驗(yàn)組小鼠肺組織中TRIF的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)水平均低于空白組與對(duì)照組(均P<0.05)，而空白組與對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見表1和圖2。

圖2 3組小鼠肺組織中TRIF蛋白的表達(dá)情況

1.4 各組小鼠肝臟、脾臟等其他組織中TRIF的表達(dá)情況 為了解經(jīng)鼻滴入法轉(zhuǎn)染慢病毒干擾載體是否會(huì)影響其他組織TRIF表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)了肝臟、脾臟、腎臟、心臟組織中TRIF基因表達(dá)水平情況。3組小鼠不同組織中TRIF mRNA相對(duì)表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見表2。

表2 3組小鼠不同組織中TRIF mRNA相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

3 討 論

RNA干擾是近些年發(fā)展起來(lái)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默技術(shù)，可以通過(guò)促使特定基因的mRNA降解來(lái)高效、特異地阻斷體內(nèi)特定基因表達(dá)，目前已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究[5]。而慢病毒載體可以將外源基因或外源shRNA有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)目的序列的效果[6]。應(yīng)用慢病毒載體沉默基因，不僅具有特異性高、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，還可節(jié)約成本、周期更短[7-8]。本研究通過(guò)采用一種簡(jiǎn)便易行的方法成功建立了小鼠肺組織TRIF沉默模型，有助于更好地研究TRIF在病毒感染中的作用，尤其是在RSV感染后病理生理中的角色。

本研究采用輕微麻醉、經(jīng)滴鼻方式將慢病毒液轉(zhuǎn)入肺部，從而沉默肺組織中TRIF表達(dá)。課題組已經(jīng)具有經(jīng)滴鼻方式轉(zhuǎn)入RSV或質(zhì)粒進(jìn)入肺組織的豐富經(jīng)驗(yàn)，從而成功建立了RSV感染不同類型小鼠模型及干擾肺部基因動(dòng)物模型[9-10]。本研究通過(guò)滴鼻方式將慢病毒轉(zhuǎn)染至肺部，免疫熒光檢測(cè)結(jié)果提示肺組織中存在明顯綠色熒光蛋白表達(dá)，這表明慢病毒確已轉(zhuǎn)入肺組織中并成功表達(dá)。而實(shí)驗(yàn)組肺組織中TRIF的基因及蛋白表達(dá)均降低，證實(shí)有效TRIF沉默，提示建立成功模型。肺部shRNA給藥有多種方式，包括靜脈給藥、氣管給藥、經(jīng)鼻給藥以及霧化給藥等方式[11]。各種方式均具有各自的優(yōu)點(diǎn)，相對(duì)于靜脈給藥，局部給藥直達(dá)肺部所需劑量更少，系統(tǒng)副作用更小，且能夠增強(qiáng)沉默效果[12]。本研究采用經(jīng)鼻給藥建立模型，操作簡(jiǎn)單、損傷小，不需要?dú)獾啦骞?、?duì)氣道創(chuàng)傷小，成功率高，小鼠死亡率低，且病毒液使用量少，沉默效果顯著。而通過(guò)檢測(cè)肝臟、腎臟、心臟等組織中TRIF的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)局部給予TRIF沉默慢病毒載體，并不影響肺外組織TRIF的表達(dá)，因而特異性高，能更好地模擬局部基因表達(dá)缺陷對(duì)病毒感染尤其是RSV感染的影響。

總之，本研究采用慢病毒載體介導(dǎo)的shRNA干擾技術(shù)成功構(gòu)建了小鼠局部肺組織TRIF沉默模型，該方法操作簡(jiǎn)單，病毒滴度容易獲得，這為研究TRIF在病毒感染中的作用提供了有效的方式。