王挺帥 王 娜 張榮臻 王明剛 黃少東 吳 聰 毛德文,4

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝病科，南寧市 530023，電子郵箱：603085856@qq.com；2 廣西骨傷醫(yī)院脾胃呼吸科，南寧市 530023；3 廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，南寧市 530023；4 廣西壯瑤藥技術(shù)研究中心，南寧市 530023)

在全球范圍內(nèi)，肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病后患者生存時(shí)間僅有6個(gè)月左右，被稱為“癌中之王”[1]。過去的幾十年里疾病診斷、防治等方面的研究顯著進(jìn)步，全球大多數(shù)國家的肝癌發(fā)病率和死亡率均顯著下降[2]。然而，亞洲地區(qū)每年仍有58萬多例新發(fā)肝癌病例，肝癌仍然是一個(gè)有待解決的挑戰(zhàn)，需要深入研究[3]。與其他癌癥一樣，基因變異、細(xì)胞環(huán)境和機(jī)體內(nèi)環(huán)境被認(rèn)為是肝癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制。

微小RNA(mircoRNA,miRNA)是一類非編碼RNA，已被證實(shí)與多種疾病特別是惡性腫瘤相關(guān)。研究表明，miRNA與肝癌的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后有著密切的關(guān)系[4]。例如，miRNA-519、miRNA-106b、miRNA-301、miRNA-423、miRNA-33a、miRNA-24等表達(dá)上調(diào)，可促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、遷移[5]；miRNA-122、miRNA-124、miRNA-203、miRNA-199a-5p等表達(dá)下調(diào)，可促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡、抑制肝癌細(xì)胞增殖[6-7]。因此，miRNA具有腫瘤抑制因子或癌基因的作用，可作為肝癌診斷、治療和預(yù)后的特異性標(biāo)志物。

了解肝癌的發(fā)生過程及患者預(yù)后狀況是有效治療肝癌的前提之一。雖然在過去的幾十年中，很多學(xué)者對(duì)肝癌的差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs)和差異表達(dá)miRNA(differentially expressed miRNAs,DEmiRNAs)進(jìn)行了研究，并報(bào)告了它們的一些功能，但由于對(duì)基因和miRNA的比較分析受到限制，它們?nèi)绾瓮ㄟ^分子途徑相互作用尚不明確。近年來，微陣列技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于腫瘤相關(guān)遺傳變異的鑒定。目前，通過生物信息學(xué)的方法，可以對(duì)微陣列技術(shù)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，從而了解DEGs和miRNA之間的相互作用，特別是相互作用網(wǎng)絡(luò)中的通路，最終分析它們?cè)诟伟┌l(fā)生、發(fā)展過程中的潛在機(jī)制[8-10]。本文通過GEO數(shù)據(jù)庫獲取肝癌相關(guān)的miRNA表達(dá)譜，分析肝癌組織和正常組織之間的DEGs和DEmiRNAs，隨后篩選肝癌的潛在靶基因，對(duì)其可能的分子機(jī)制進(jìn)行描述，旨在尋找最特異、最敏感的肝癌分子標(biāo)志物，進(jìn)而提高診治水平以改善患者預(yù)后。

1 資料與方法

1.1 篩選miRNA和mRNA信息 (1)提取miRNA信息。從GEO數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中檢索肝癌，設(shè)置關(guān)鍵詞為hepatocellular carcinoma(或HCC、liver cancer)、miRNA，得到miRNA相關(guān)信息。選擇組織為人(Homo sapiens)，研究類型為非編碼RNA微陣列分析(non-coding RNA profiling by array)，進(jìn)一步篩選。再根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了第2次篩選：① 研究樣本量≥10個(gè)；② 研究對(duì)象為組織樣本而不是細(xì)胞樣本；③ 僅研究肝組織樣本；④ 應(yīng)提供正常對(duì)照樣本或正常鄰近組織。(2)提取mRNA信息。從GEO數(shù)據(jù)庫中檢索肝癌，設(shè)置關(guān)鍵詞為hepatocellular carcinoma(或HCC、liver cancer)、mRNA，得到mRNA相關(guān)信息。選擇組織為人(Homo sapiens)，研究類型為Expression profiling by array，進(jìn)一步篩選。第2次篩選標(biāo)準(zhǔn)同miRNA。

1.2 DEmiRNAs和DEGs的篩選 采用R語言中l(wèi)imma包進(jìn)行異DEmiRNAs和DEGs的篩選，設(shè)置閾值=2，矯正后的P值閾值為0.05。并用pheatmap包繪制DEGs和DEmiRNAs熱圖。

1.3 篩選肝癌的潛在靶基因 通過miRDB(http://mirdb.org/)、miRTarBase(http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php)和TargetScan(http://www.targetscan.org/mamm_31/)3個(gè)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行DEmiRNAs靶基因的篩選。再將篩選出來的靶基因與DEGs取交集，最終得到肝癌的潛在靶基因。采用Venny 2.1工具(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)進(jìn)行對(duì)比分析。

1.4 功能和通路富集分析 利用David數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)上傳1.3中獲取的交集靶基因，進(jìn)行基因本體(Gene Ontology,GO)功能富集分析，包括生物學(xué)過程、細(xì)胞組成、分子功能，同時(shí)進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)信號(hào)通路分析(P<0.05)。

1.5 miRNA-mRNA-通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的建立 采用Cytoscape軟件構(gòu)建miRNA-mRNA-通路的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并用Network Analyzer進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，計(jì)算其拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，從中得到重要miRNA、mRNA及信號(hào)通路，基于構(gòu)建的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)探討原發(fā)性肝癌的生物學(xué)過程及相關(guān)作用機(jī)制。

2 結(jié) 果

2.1 miRNA、mRNA、DEmiRNAs和DEGs的篩選結(jié)果 通過GEO數(shù)據(jù)庫獲得符合篩選標(biāo)準(zhǔn)的肝癌相關(guān)miRNA表達(dá)譜 (GSE112264)和mRNA表達(dá)譜(GSE118916)，前者包括正常組樣本41例、肝癌組樣本50例，后者包括正常組樣本8例、肝癌組樣本24例。采用limma包篩選得到213個(gè)DEmiRNAs和256個(gè)DEGs，熱圖見圖1。

DEmiRNAs DEGs

2.2 miRNA-mRNA交集 從miRDB、miRTarBase和TargetScan數(shù)據(jù)庫中共識(shí)別出4 010個(gè)DEmiRNAs靶基因。再將DEmiRNAs靶基因與DEGs取交集，獲得肝癌潛在靶基因34個(gè)(見圖2)。選擇潛在靶基因及與其對(duì)應(yīng)且存在負(fù)調(diào)控關(guān)系的miRNA作為miRNA-mRNA靶點(diǎn)對(duì)，最終共獲得55對(duì)miRNA-mRNA基因?qū)Γ?3個(gè)潛在靶基因和17個(gè)miRNA，其中miRNA均為表達(dá)上調(diào)，而危險(xiǎn)基因均為表達(dá)下調(diào)，見表1。

圖2 肝癌潛在靶基因的韋恩圖

表1 miRNA-mRNA基因?qū)?/p>

2.2 GO富集分析和KEGG信號(hào)通路分析 GO富集分析結(jié)果顯示，肝癌潛在靶點(diǎn)基因涉及22個(gè)生物學(xué)過程、8種分子功能、8個(gè)細(xì)胞組分。見圖3。其中生物學(xué)過程主要包括調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡、多細(xì)胞生物過程的正向調(diào)節(jié)、生物學(xué)過程的正向調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、組織發(fā)育、內(nèi)源性刺激的應(yīng)答、調(diào)節(jié)細(xì)胞連接、調(diào)節(jié)程序性細(xì)胞死亡等。

圖3 生物學(xué)過程的GO富集分析(前20個(gè)生物學(xué)過程)

KEGG信號(hào)通路分析結(jié)果顯示，共得到88條信號(hào)通路，剔除與肝癌無關(guān)的31條信號(hào)通路，按其功能分類，主要富集在7個(gè)類型的通路上，包括細(xì)胞增殖與死亡、免疫系統(tǒng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、運(yùn)輸和分解代謝、癌癥、消化系統(tǒng)及氨基酸代謝，涉及p53 信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、Th17分化、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路、轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β,TGF-β)信號(hào)通路、核因子κB信號(hào)通路、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、Hippo信號(hào)通路、Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription,JAK/STAT)信號(hào)通路等，見圖4(圖4只顯示前20個(gè)信號(hào)通路，未顯示完全)。

圖4 KEGG信號(hào)通路分析(前20個(gè)信號(hào)通路)

2.3 miRNA-mRNA-通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 采用Cytoscape構(gòu)建miRNA-mRNA-通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并用Network Analyzer進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析。根據(jù)連接度(Degree值)大小，得到排名靠前的危險(xiǎn)miRNA為hsa-miRNA-195-5p、hsa-miRNA-16-5p、hsa-miRNA-124-3p、hsa-miRNA-107、hsa-miRNA-103a-3p等，危險(xiǎn)基因有轉(zhuǎn)錄因子FOS、生長停滯和DNA損傷可誘導(dǎo)蛋白45γ(growth arrest and DNA-damage-inducible 45 gamma,GADD45G)、環(huán)指蛋白125(ring finger protein 125,RNF125)、含鋅指和BTB結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)16(zinc finger and BTB domain containing 16,ZBTB16)、C-X-C基序趨化因子配體12(C-X-C motif chemokine ligand 12,CXCL12)、生長激素受體(growth hormone receptor,GHR)、R-海綿蛋白-3(R-spondin 3,RSPO3)、碳酸酐酶2(carbonic anhydrase 2,CA2)、DNA結(jié)合抑制因子1(inhibitor of DNA binding 1,ID1)、肌肽二肽酶1(carnosine dipeptidase 1,CNDP1)、磷脂磷酸酶3(phospholipid phosphatase 3,PLPP3)、早期生長應(yīng)答因子1(early growth response 1,EGR1)等，信號(hào)通路為癌癥通路、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、細(xì)胞凋亡、MAPK信號(hào)通路、肝細(xì)胞癌、p53 信號(hào)通路、膽汁分泌等。見圖5、表2。

圖5 miRNA-mRNA-通路的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

表2 miRNA-mRNA-通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)特征

3 討 論

miRNA是一類由內(nèi)源性基因編碼的長度為20～25個(gè)核苷酸的非編碼RNA，主要與3′-非翻譯區(qū)的靶向mRNA結(jié)合，miRNA能促進(jìn)靶向mRNA的降解或抑制其翻譯，最終調(diào)節(jié)靶基因的生物學(xué)功能[11]。同一miRNA可以調(diào)控不同的基因，而同一基因可由不同的miRNA調(diào)控。在過去的幾十年里，已有研究充分證實(shí)了miRNA參與多種生理和病理事件的發(fā)生，特別是在腫瘤方面[12]。miRNA與腫瘤的關(guān)系可概括為以下幾個(gè)方面：(1)miRNA作為癌基因或抑癌基因，參與了腫瘤發(fā)生和發(fā)展相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控，在腫瘤的增殖、遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移以及血管生成、細(xì)胞周期進(jìn)展、凋亡、自噬等過程中發(fā)揮著重要作用[13-14]。(2)miRNA在人腫瘤中具有組織和疾病特異性，提示miRNA可作為腫瘤早期診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)的新生物學(xué)標(biāo)志物[15]。(3)miRNA在腫瘤治療中的應(yīng)用，主要包括抑制miRNA和替換miRNA兩種策略。在中國，肝癌是發(fā)病率排名第4位的惡性腫瘤，也是癌癥相關(guān)死亡的第2大原因[1]。然而，肝癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制仍有待闡明，這嚴(yán)重阻礙了對(duì)肝癌的早期發(fā)現(xiàn)和有效治療。因此，從miRNA深入研究miRNA-mRNA-通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，有助于進(jìn)一步探明肝癌的發(fā)生和進(jìn)展過程，建立早期篩查和預(yù)后評(píng)估的危險(xiǎn)模型，以及研發(fā)抗肝癌的藥物。

通過生物信息學(xué)分析，我們共篩選出與肝癌相關(guān)的213個(gè)DEmiRNAs以及256個(gè)DEGs，取交集后獲得34個(gè)肝癌潛在靶基因，這些基因參與調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡、多細(xì)胞生物過程的正向調(diào)節(jié)、生物學(xué)過程的正向調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、組織發(fā)育、內(nèi)源性刺激的應(yīng)答、調(diào)節(jié)細(xì)胞連接、調(diào)節(jié)程序性細(xì)胞死亡等生物學(xué)過程。最終獲得55對(duì)miRNA-mRNA基因?qū)?，包?3個(gè)潛在靶基因和17個(gè)miRNA；通過構(gòu)建miRNA-mRNA-通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，篩選出肝癌的危險(xiǎn)miRNA為hsa-miRNA-195-5p、hsa-miRNA-16-5p、hsa-miRNA-124-3p、hsa-miRNA-107、hsa-miRNA-103a-3p等，危險(xiǎn)基因有FOS、GADD45G、RNF125、ZBTB16、CXCL12、EGR1等，涉及信號(hào)通路包括癌癥通路、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、細(xì)胞凋亡、MAPK信號(hào)通路、肝細(xì)胞癌、p53 信號(hào)通路、膽汁分泌等。在miRNA-mRNA-通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，F(xiàn)OS的連接度最高，與hsa-miRNA-221-3p、hsa-miRNA-29b-3p、hsa-miRNA-222-3p 3個(gè)miRNA相關(guān)，涉及癌癥通路、細(xì)胞凋亡、MAPK信號(hào)通路等11條信號(hào)通路。

Fos蛋白是原癌基因c-Fos的表達(dá)產(chǎn)物，由堿性氨基酸組成，F(xiàn)os家族為細(xì)胞核內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，其編碼的蛋白質(zhì)為細(xì)胞核內(nèi)重要的癌蛋白[16]。Fos蛋白可與Jun蛋白結(jié)合形成具有轉(zhuǎn)錄激活活性的異二聚體，即轉(zhuǎn)錄因子激活子蛋白1(activator protein 1,AP-1)，調(diào)控細(xì)胞存活、增殖和分化，參與癌癥的形成及其上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[17]。Bakiri等[18]構(gòu)建肝癌小鼠模型，發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞特異性c-Fos缺失可防止肝癌的發(fā)生，而c-Fos表達(dá)增加有利于肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化和癌變。有研究顯示，AP-1的活化可通過MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)Fos、Jun蛋白的活化和磷酸化，從而促進(jìn)癌癥的進(jìn)展[19]。除此之外，AP-1在調(diào)控細(xì)胞死亡和存活方面起重要作用，也是細(xì)胞轉(zhuǎn)化的重要標(biāo)志。GADD45G又稱為CR6，屬于GADD45蛋白家族。GADD45G可影響細(xì)胞周期，調(diào)控G/M細(xì)胞周期點(diǎn)、維持基因組穩(wěn)定性，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起重要作用，也與DNA損傷修復(fù)密切相關(guān)[20]。此外，GADD45G可負(fù)調(diào)控細(xì)胞生長，抑制腫瘤細(xì)胞生長并促進(jìn)其凋亡。RNF125是一種泛素連接酶，是RIG-I的負(fù)調(diào)控因子，可通過介導(dǎo)視黃醇誘導(dǎo)基因-I的k48連接多泛素化從而導(dǎo)致視黃醇誘導(dǎo)基因-I蛋白被蛋白酶體降解。泛素化幾乎參與所有細(xì)胞過程，其功能包括內(nèi)化和溶酶體靶向、蛋白質(zhì)相互作用的調(diào)節(jié)、亞細(xì)胞分布的改變、轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)、DNA修復(fù)和跨膜信號(hào)的傳播[21]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，RNF125可通過激活TGF-β1-SMAD3-ID1信號(hào)通路促進(jìn)膽囊腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移[22]。基質(zhì)衍生因子1α，也稱為CXCL12，是CXCR4和CXCR7的特異性配體，三者共同推動(dòng)了胚胎發(fā)育過程中的祖細(xì)胞遷移。有研究表明，CXCL12可能在肝癌的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移[23]。ESR1可以編碼轉(zhuǎn)錄因子，增強(qiáng)對(duì)不同組織類型的雌激素和生長因子等的刺激反應(yīng)[24]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，ESR1可能在肝癌中發(fā)揮潛在的抑癌作用，并與某些腫瘤抑制因子(例如HNF4A和PPAR)存在關(guān)聯(lián)[25]。此外，也有研究顯示，ESR1可以抑制白細(xì)胞介素6介導(dǎo)的炎癥過程，減輕肝損傷和肝細(xì)胞代償性增殖[26]。

越來越多的證據(jù)表明，miRNA表達(dá)失調(diào)是肝癌發(fā)病機(jī)制的重要組成部分。本研究最后篩選出來的17個(gè)miRNA中，根據(jù)拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果可知hsa-miRNA-195-5p是最顯著的miRNA之一，以ZBTB16、RNF125、GHR、PPAP2B等為靶點(diǎn)。hsa-miRNA-195-5p在多種癌癥中都有表達(dá)，包括肝癌、胃癌、乳腺癌和腎上腺皮質(zhì)癌。hsa-miRNA-195-5p在肝癌細(xì)胞中的過度表達(dá)可降低PHF19的水平，導(dǎo)致肝癌細(xì)胞在體外的侵襲、遷移和增殖受到抑制[27]。miRNA-221是人類腫瘤中最常見且持續(xù)表達(dá)上調(diào)的miRNA之一，被認(rèn)為是腫瘤的啟動(dòng)子。最近的一項(xiàng)研究表明，miRNA-221的過度表達(dá)可以加速肝細(xì)胞的增殖，并可能促進(jìn)肝腫瘤的發(fā)生[28]。本研究中，has-miRNA-221和has-miRNA-222是顯著上調(diào)的關(guān)鍵miRNA， 都與ESR1、FOS等DEGs關(guān)聯(lián)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)， has-miRNA-221可與ESR1、CXCL12、FOS等DEGs相互作用[14]；而has-miRNA-222是研究中表達(dá)上調(diào)最顯著的miRNA，與ZBTB41相關(guān)聯(lián)并可通過激活蛋白激酶B途徑增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的侵襲性和運(yùn)動(dòng)性[14]。

綜上所述，F(xiàn)OS、GADD45G、RNF125、ZBTB16、CXCL12、EGR1等DEGs，以及hsa-miRNA-195-5p、hsa-miRNA-16-5p、hsa-miRNA-124-3p、hsa-miRNA-107、hsa-miRNA-103a-3p等DEmiRNAs，或可為肝癌的診斷和治療提供新的線索。然而，缺乏實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證是本研究的局限之一，在今后的研究中，將通過實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白免疫印跡等實(shí)驗(yàn)對(duì)這些生物信息學(xué)分析的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)一步加以驗(yàn)證。