麻和平，彭章普，張文齊，劉彩云，王 潔，王曙陽(yáng),3, ，邵建寧,

（1.甘肅省科學(xué)院生物研究所 甘肅省微生物資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730000；2.甘肅省科學(xué)院，甘肅蘭州 730000；3.中國(guó)科學(xué)院近代物理研究所，甘肅蘭州 730000）

乳酸菌是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的對(duì)人類健康有益的食品級(jí)微生物，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[1?3]。乳酸菌細(xì)菌素是乳酸菌通過(guò)核糖體途徑產(chǎn)生的具有抗菌活性的肽和蛋白類物質(zhì)，具有高效、安全無(wú)毒、無(wú)殘留、無(wú)抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，可以防止食品中腐敗菌和病原菌的生長(zhǎng)[4?7]，已商品化的乳酸菌細(xì)菌素十分有限，僅限于Nisin和Pediocin PA-1等[8]，生物合成量低也是細(xì)菌素應(yīng)用受限的主要原因之一[9]。國(guó)內(nèi)外許多實(shí)驗(yàn)室正致力于從不同原料中篩選高產(chǎn)菌株、發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化、誘變育種、原生質(zhì)體融合、基因工程方法、群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控等方面提高乳酸菌細(xì)菌素合成量，開(kāi)展乳酸菌細(xì)菌素的研究、開(kāi)發(fā)與利用[10?13]，大范圍的收集、篩選乳酸菌株，挖掘廣譜、高效的乳酸菌細(xì)菌素已經(jīng)成為生物防腐劑研究領(lǐng)域中正在研究的熱點(diǎn)[14?17]。甘肅牧區(qū)具有獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境，當(dāng)?shù)厣贁?shù)民族牧民沿用傳統(tǒng)制作方法制作的發(fā)酵乳品，作為自然長(zhǎng)期馴化乳酸菌的載體，含有豐富的乳酸菌資源[18?19]。

針對(duì)從傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中初步分離篩選的乳酸菌細(xì)菌素產(chǎn)量偏低、基因工程菌公眾接受度低等商業(yè)化瓶頸，本研究以甘肅牧區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離篩選出的產(chǎn)細(xì)菌素植物乳桿菌Lp1作為出發(fā)菌株，應(yīng)用相比傳統(tǒng)誘變?cè)淳哂懈咄蛔兟?、廣突變譜的重離子束輻照微生物育種技術(shù)[20?24]，開(kāi)展產(chǎn)細(xì)菌素植物乳桿菌重離子束輻照誘變育種及其突變株產(chǎn)細(xì)菌素性能遺傳穩(wěn)定性研究，解決前期分離篩選的乳酸菌產(chǎn)細(xì)菌素量偏低的問(wèn)題，建立和優(yōu)化產(chǎn)細(xì)菌素植物乳桿菌重離子束輻照誘變育種研究方法，為選育高產(chǎn)細(xì)菌素植物乳桿菌提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

出發(fā)菌：植物乳桿菌Lp1（Lactobacillus plantarumLp1） 分離自甘南牧區(qū)牦牛酸奶，指示菌：大腸埃希氏菌（Escherichia coli）ATCC25922、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC26003 甘肅省科學(xué)院生物研究所食品生物技術(shù)室保藏；MRS肉湯、MRS瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯（NB）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司。

JA2003N 電子天平 上海精密儀器有限公司；DELTA 320 pH計(jì) 梅 特 勒-托 利 多（METTLER TOLEDO）集團(tuán)；DG-1 多功能培養(yǎng)箱 上海醫(yī)療器械修造廠；LDZF-75L-II 立式高壓蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2D 超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；BH-2 顯微鏡 日本奧林巴斯（中國(guó)）有限公司；HiCC-S1型全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)及抑菌圈測(cè)量?jī)x杭州萬(wàn)深檢測(cè)科技有限公司；動(dòng)菌落計(jì)數(shù)及抑菌圈測(cè)量?jī)x 杭州萬(wàn)深檢測(cè)科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重離子束12C6+輻照誘變 將甘油法保藏的出發(fā)菌株植物乳桿菌Lp1接種于MRS肉湯培養(yǎng)基，37 ℃恒溫活化、擴(kuò)大培養(yǎng)后，在無(wú)菌條件下將待輻照菌懸液1.5 mL置于35 mm無(wú)菌塑料平皿中，利用中科院近代物理所重離子加速器淺層輻照終端提供的80 MeV/u，劑量率20 Gy/min 的12C6+重離子束進(jìn)行輻照處理[25]，輻照劑量分別為 0（CK）、50、100、150、200、300 Gy，每個(gè)劑量設(shè)置3個(gè)平行。

1.2.2 重離子束12C6+輻照致死率及正、負(fù)突變率測(cè)定

1.2.2.1 輻照致死率測(cè)定 將不同劑量輻照后的菌懸液10倍系列稀釋后，選擇適宜稀釋度,采用平板傾注法，用MRS瓊脂進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，每個(gè)稀釋度3個(gè)平行，37 ℃恒溫倒置培養(yǎng)48 h。菌落計(jì)數(shù)參照GB 4789.2-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定。

1.2.2.2 輻照正、負(fù)突變率測(cè)定 將不同劑量輻照后的菌懸液10倍系列稀釋后，選擇適宜稀釋度的稀釋勻液，采用涂布平板法，在MRS瓊脂平板37 ℃恒溫倒置培養(yǎng)24～48 h，挑選出所有單菌落，分別接入裝有10 mL MRS肉湯培養(yǎng)基的試管中，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h后，4 ℃靜置24 h。以大腸埃希氏菌為指示菌對(duì)分離菌株發(fā)酵上清液進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)分離得到菌株總數(shù)和與出發(fā)菌株抑菌圈直徑比較變化大于10%的分離菌株數(shù)，進(jìn)行正負(fù)突變率計(jì)算。

1.2.3 高產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌突變株篩選

1.2.3.1 初篩 將重離子束輻照后菌懸液，稀釋一定濃度，采用涂布平板法，在MRS瓊脂平板37 ℃培養(yǎng)24～48 h，無(wú)菌條件下挑出單個(gè)菌落，接入裝有10 mL MRS 肉湯培養(yǎng)基的試管中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，4 ℃靜置24 h，取發(fā)酵上清液以大腸埃希氏菌為指示菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，測(cè)量抑菌圈直徑，挑選正突變株進(jìn)行保藏[26]備用。

1.2.3.2 復(fù)篩 初篩的正突變株用MRS 肉湯培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)24 h，8000 r/min離心10 min，收集上清液。上清液用1 mol/L NaOH調(diào)pH至5.5，排除有機(jī)酸的干擾；再在80 ℃保溫10 min，排除過(guò)氧化氫的干擾；最后經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌[27]備用。以大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌為指示菌對(duì)上述處理后上清液分別進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，測(cè)量抑菌圈直徑，挑選對(duì)2種指示菌抑菌圈直徑均大于出發(fā)菌抑菌圈直徑的突變株為復(fù)篩菌株進(jìn)行保藏。

1.2.3.3 高產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌突變株遺傳穩(wěn)定性測(cè)試 將復(fù)篩的高產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌突變株接種于MRS肉湯培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，連續(xù)傳代5次，對(duì)每一代菌株發(fā)酵液按1.2.4的方法處理后進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，測(cè)定抑菌圈直徑，評(píng)價(jià)突變株遺傳穩(wěn)定性[28]。

1.2.4 抑菌實(shí)驗(yàn) 采用雙層瓊脂擴(kuò)散法[29]，在水平放置的無(wú)菌培養(yǎng)皿中先加入10 mL滅菌后冷卻至50 ℃左右的1%瓊脂水溶液，至完全凝固后均勻擺放6個(gè)牛津杯，再加入15 mL含大腸埃希氏菌或金黃色葡萄球菌約106CFU/mL的48 ℃左右的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，等完全凝固后取出牛津杯，在形成的圓孔內(nèi)，3個(gè)孔分別滴加分離菌株待測(cè)樣液100 μL，其余3個(gè)孔分別滴加出發(fā)菌株待測(cè)樣液100 μL，37 ℃培養(yǎng)20 h，用HiCC-S1型全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)及抑菌圈測(cè)量?jī)x測(cè)定抑菌圈直徑。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用Micorsoft Excel 2019軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 輻照劑量對(duì)致死率的影響

對(duì)重離子束12C6+不同劑量輻照后的植物乳桿菌Lp1菌懸液，采用傾注平板法菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算出各個(gè)輻照劑量致死率，以輻照劑量為橫坐標(biāo)，致死率為縱坐標(biāo)，繪制致死率曲線。結(jié)果如圖1所示，出發(fā)菌株植物乳桿菌Lp1對(duì)重離子束的輻照較為敏感，通過(guò)不同劑量的重離子束12C6+輻照后，隨著重離子束輻照劑量的增大，誘變致死率不斷升高。在整個(gè)輻照試驗(yàn)中，當(dāng)輻照劑量從50 Gy升高至300 Gy時(shí)，出發(fā)菌株植物乳桿菌Lp1的致死率從58.62%上升至86.3%，致死率提高了27.68%。其中，當(dāng)輻照劑量從50 Gy升高至150 Gy時(shí)致死率提高了5.83%，劑量從150 Gy升高至300 Gy時(shí)致死率提高了21.85%。本次研究最大輻照劑量為300 Gy，植物乳桿菌Lp1的致死率達(dá)到了86.3%，如果想得到更高致死率劑量，可以在大于300 Gy的重離子束輻照劑量下再進(jìn)一步增大輻照劑量來(lái)研究[30?31]。

圖1 重離子束輻照誘變植物乳桿菌Lp1致死曲線和正、負(fù)突變率曲線Fig.1 Lethality curv and positve & negative mutation rate curve of Lactobacillus plantarum Lp1 irradiatied by heavy ion beams

2.2 輻照劑量對(duì)正負(fù)突變率的影響

在分離菌株發(fā)酵上清液抑菌試驗(yàn)中，將與出發(fā)菌株抑菌圈直徑比較變化大于10%的菌株定義為突變菌株，抑菌圈直徑比較變化在10%內(nèi)的菌株定義為非突變菌株，統(tǒng)計(jì)分離的正負(fù)突變株菌株數(shù)和總菌數(shù)。以輻照劑量為橫坐標(biāo)，正、負(fù)突變率為縱坐標(biāo)，繪制正、負(fù)突變率隨輻照劑量的變化曲線。正、負(fù)突變率曲線如圖1所示，菌株的正突變率隨著輻照劑量的增大逐步提升，當(dāng)輻照劑量為 300 Gy時(shí)，正突變率達(dá)到28.28%，相比其它輻照劑量可篩選得到較多正突變菌株，試驗(yàn)結(jié)果表明在本次研究設(shè)置輻照劑量下，重離子束12C6+輻照最佳劑量為300 Gy。菌株的負(fù)突變率也隨著輻照劑量的增加而升高，輻照劑量為300 Gy時(shí)，負(fù)突變率達(dá)到33.33%。在 300 Gy時(shí)，正、負(fù)突變率均達(dá)到最高，同時(shí)致死率也達(dá)到86.3%。根據(jù)相關(guān)誘變研究得到的現(xiàn)代育種理論表明，當(dāng)被誘變微生物致死率為 70%～80%時(shí)，所采用的輻照劑量下，菌株更容易出現(xiàn)較高的正突變菌株，當(dāng)在更高的致死率下，雖然突變率可能較高，但在此情況下，正、負(fù)突變率都會(huì)較高[32?33]。

2.3 高產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌突變菌株篩選

2.3.1 初篩 對(duì)重離子束12C6+300 Gy劑量輻照后的出發(fā)菌株Lp1菌懸液稀釋液涂布平板，分離單菌落，以大腸埃希氏菌為指示菌，對(duì)分離菌株發(fā)酵上清液進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，分離出了抑菌圈直徑大于出發(fā)菌株抑菌圈直徑10%的正突變株28株。出發(fā)菌株Lp1的平均抑菌圈直徑為（15.57±0.41）mm，從正突變菌株中再選出抑菌圈直徑大于出發(fā)菌株抑菌圈直徑15%的菌株9株，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，初篩的9株菌株其抑菌圈直徑較出發(fā)菌株抑菌圈直徑提高了16.83%～20.55%，均與出發(fā)菌株Lp1對(duì)大腸埃希氏菌的平均抑菌圈直徑差異極顯著（P＜0.01）。

表1 重離子輻照誘變植物乳桿菌Lp1初篩突變株Table 1 Positve mutation strains of Lactobacillus plantarum Lp1 of preliminary screening

2.3.2 復(fù)篩 對(duì)初篩出的9株菌株進(jìn)行復(fù)篩，9株菌株發(fā)酵液經(jīng)除有機(jī)酸、過(guò)氧化氫、菌體處理后，以大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌分別為指示菌，進(jìn)行抑菌圈試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2 可知，初篩的9株突變株發(fā)酵液排除有機(jī)酸、過(guò)氧化氫、菌體干擾后，仍有明顯抑菌效果。復(fù)篩出2株抑菌圈較大菌株，L092菌株對(duì)大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為（16.95±0.53）、（17.48±0.54）mm，比出發(fā)菌株Lp1對(duì)大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑提高20.64%和17.16%。L085菌株對(duì)大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為（16.77±0.23）、（17.03±0.23）mm，比出發(fā)菌株Lp1對(duì)大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑提高19.36%和14.14%。L092、L085菌株對(duì)大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑與出發(fā)菌株抑菌圈直徑差異極顯著（P＜0.01）。

表2 重離子輻照誘變植物乳桿菌Lp1復(fù)篩突變株Table 2 Positve mutation strains of Lactobacillus plantarum Lp1 of secondary screening

2.4 高產(chǎn)細(xì)菌素突變菌株遺傳穩(wěn)定性

為了驗(yàn)證復(fù)篩高產(chǎn)細(xì)菌素突變菌株遺傳穩(wěn)定性，對(duì)復(fù)篩菌株Lp085、Lp092進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)，37 ℃恒溫，MRS 肉湯培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)24 h，連續(xù)傳代5次，菌株每一代發(fā)酵液均經(jīng)除有機(jī)酸、過(guò)氧化氫、菌體處理后進(jìn)行抑菌圈試驗(yàn)，結(jié)果如表3所示，2株復(fù)篩菌株Lp085、Lp092連續(xù)傳代5次，Lp092菌株對(duì)大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別在 16.41～16.95、16.66～17.48 mm，Lp085菌株對(duì)大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌待抑菌圈直徑分別在 16.01～16.77、16.36～17.03 mm，連續(xù)傳代5次，各代的抑菌圈直徑變化均在5%之內(nèi)，說(shuō)明菌株Lp085、Lp092具有較穩(wěn)定的產(chǎn)細(xì)菌素遺傳特性。

表3 復(fù)篩突變株突的遺傳穩(wěn)定性研究Table 3 Genetic stability of mutant strain of secondary screening

3 結(jié)論

采用重離子束12C6+對(duì)產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌出發(fā)菌株植物乳桿菌Lp1進(jìn)行輻照選育，輻照劑量在50～300 Gy時(shí)，致死率呈上升趨勢(shì)，出發(fā)菌株植物乳桿菌Lp1的致死率從58.62%上升至86.3%。在輻照劑量300 Gy時(shí)，出發(fā)菌株植物乳桿菌Lp1的正突變率為28.28%，負(fù)突變率為33.33%。在輻照劑量300 Gy菌懸液中選育出高產(chǎn)細(xì)菌素突變菌株Lp085、Lp092，Lp092對(duì)大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌待抑菌圈直徑分比出發(fā)菌株Lp1抑菌圈直徑提高21.40%、18.9%；Lp085對(duì)大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌待抑菌圈直徑比出發(fā)菌株Lp1抑菌圈直徑提高 20.27%、16.91%。經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代5次試驗(yàn)，2株菌株Lp085、Lp092均具有良好的產(chǎn)細(xì)菌素遺傳穩(wěn)定性。本研究表明，利用重離子束12C6+輻照產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌可以得到高產(chǎn)細(xì)菌素的突變菌株，可用于高產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌種的選育，為高產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌選育提供了一定理論依據(jù)和試驗(yàn)基礎(chǔ)。