李雅琪，郜玉鋼，臧 埔, ，李兆春

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長春 130118；2.白山靖珍天麻開發(fā)有限公司，吉林靖宇 135200）

天麻（Gastrodia elataBl.），具有息風(fēng)止痙，平抑肝陽，祛風(fēng)通絡(luò)之功效[1]?，F(xiàn)代藥理表明，天麻具有降血壓[2]，增加心腦血流量[3]，調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)[4]，抗炎與提高機體免疫[5]、治療抑郁癥[6]、阿爾茨海默癥[7]等作用。

國家衛(wèi)健委發(fā)布“關(guān)于對黨參等9種物質(zhì)開展按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材的物質(zhì)管理試點工作的通知國衛(wèi)食品函〔2019〕311號”后，國內(nèi)外需求量急劇增加，長白山烏桿天麻（Gastrodia elataBl.f.glauca）是天麻中的“極品”更受到人們的青睞[8]。野生天麻資源匱乏，需人工種植供應(yīng)。但天麻多代無性種植，因病害重失去栽培價值[9]。有性繁殖天麻種子無胚乳，必須依靠小菇屬（Mycena）真菌侵染種胚細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì)，才能完成種子萌發(fā)[10]。因此萌發(fā)菌菌種質(zhì)量的好壞直接影響著天麻的產(chǎn)量和質(zhì)量。自1980年，徐錦堂等[11]從天麻種子萌發(fā)形成的原球莖中分離出對天麻種子萌發(fā)具有促進(jìn)作用的12種真菌以來，有性繁殖成為天麻栽培的主要方式。秦麗媛等[12?13]對天麻萌發(fā)菌小菇生長條件及其多樣性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)萌發(fā)菌小菇屬真菌為弱腐生菌，培養(yǎng)條件苛刻，培養(yǎng)過程中存在著生長時間過長，生物量偏低的問題，且多代繁殖過程中易發(fā)生種性退化，從而導(dǎo)致天麻萌發(fā)率下降。羅陽蘭等[14]通過研究不同脅迫條件對天麻種子共生萌發(fā)的影響，發(fā)現(xiàn)天麻種子共生萌發(fā)受多種因素的影響，其中受環(huán)境脅迫影響較大。如外來萌發(fā)菌與長白山烏桿天麻種子的親和性不穩(wěn)定，嚴(yán)重影響了天麻有性繁殖[15]。又由于長白山區(qū)已禁止伐林栽培天麻，只能非林地種植，而非林地與林地環(huán)境不同。因此篩選適宜長白山烏桿天麻非林地栽培的本地優(yōu)良萌發(fā)菌菌株已勢在必行。本研究分離鑒定篩選出與長白山烏桿天麻種子親和性穩(wěn)定并適合非林地栽培的優(yōu)良萌發(fā)菌菌株，對提高天麻種子萌發(fā)率和天麻產(chǎn)量具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

分離用樣品 采集于長白山區(qū)吉林省靖宇、輝南等地野生天麻生長地的葉片、野生天麻原球莖，非林地栽培萌發(fā)用天麻種子采集于白山靖珍天麻開發(fā)有限公司；PDA培養(yǎng)基 本實驗室配制；葡萄糖 北京化工廠；瓊脂 上海滬試；無水乙醇 北京化工廠；EB（溴化乙錠）Tiangen公司；瓊脂糖 西班牙Biowest agarose；真 菌 通 用 引 物ITS4、ITS5 TAKARA公司；1%剛果紅染液、真菌基因組DNA提取試劑盒、50×TAE 緩沖液、2×Taq PCR Master Mix、ddH2O、D2000 DNA Ladder 北京索萊寶科技有限公司。

AUY220電子分析天平 精度為0.0001 g，日本島津公司；YXQ-LS-100G立式壓力蒸汽滅菌器上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；4270電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海錦屏儀器儀表有限公司通州分公司；SW-CJ-2D光學(xué)顯微鏡 南京凱旋電子光學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-2D超凈工作臺 江蘇通凈凈化設(shè)備有限公司；XW-80A漩渦混合器 江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠；Sure Cycler 8800梯度PCR儀 安捷倫科技有限公司；DYY-6B電泳儀 北京六一儀器廠；GGM/D2凝膠成像系統(tǒng) 英國SYNGENE。

1.2 實驗方法

1.2.1 萌發(fā)菌葉片分離法 將野生天麻生長地采集的樹葉在70%酒精中浸泡3 min后，用無菌水沖洗2～3次，接入PDA培養(yǎng)基中，移至恒溫培養(yǎng)箱中24 ℃條件下培養(yǎng)，待有菌落出現(xiàn)時，將白色菌落轉(zhuǎn)入新的PDA培養(yǎng)基上，淘汰雜色菌落，該過程重復(fù)數(shù)次，直至菌株純化為止[15]。

1.2.2 萌發(fā)菌原球莖分離法 將采集的葉片與天麻種子拌勻后播入花盆中，用鋸末加砂配土覆蓋，每隔15 d噴施適量水分，保持種子在溫度為24 ℃濕度為50%的環(huán)境中萌發(fā)[16]，待種子萌發(fā)后采集原球莖。將原球莖用清水洗凈，酒精棉輕輕擦拭表面后，在超凈工作臺中用無菌水沖洗數(shù)次，用無菌濾紙擦拭表面除去水分，切成均勻小塊接種在無菌PDA培養(yǎng)基上，在恒溫培養(yǎng)箱中24 ℃條件下培養(yǎng)，待有菌落出現(xiàn)時，將白色菌落轉(zhuǎn)入新的PDA培養(yǎng)基上，淘汰雜色菌落，該過程重復(fù)數(shù)次，直至菌株純化為止[17]。

1.2.3 萌發(fā)菌形態(tài)學(xué)鑒定 將純化的菌株接種在PDA培養(yǎng)基上，每天在同一時間對各菌落的形態(tài)特征（顏色、表面特征、萌發(fā)時間、生長速度）進(jìn)行觀察。另接種純化的菌株，采用周永強等[18]的方法，待菌落生長范圍適中，將滅菌后的蓋玻片呈45°傾斜插入培養(yǎng)基內(nèi)，待菌絲爬片之后取出蓋玻片，采用1%剛果紅染液染色制片，通過光學(xué)顯微鏡觀察菌絲形態(tài)結(jié)構(gòu)并拍照。參照《真菌鑒定手冊》[19]，進(jìn)行初步的鑒定。

1.2.4 萌發(fā)菌分子生物學(xué)鑒定 純化后培養(yǎng)的萌發(fā)菌DNA通過真菌DNA提取試劑盒提取，將提取后的DNA純化并于?20 ℃下儲存?zhèn)溆?。然后采用大連寶生物公司合成的真菌通用引物ITS4和ITS5對提取的真菌DNA的ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴增，PCR反應(yīng)條件：ITS引物（ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，ITS5 5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）[20]；PCR反應(yīng)體系（12.5 μL 2×Taq MasterMix for PAGE，上下游引物10 μmol/L各1.0 μL，DNA模板3.0 μL，去離子水7.5 μL，共25 μL）；PCR變溫程序（95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30次循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min）[21]。擴增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察是否有特異性條帶出現(xiàn)。將PCR產(chǎn)物4 ℃保存送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將測序得到的堿基序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫中，進(jìn)行BLAST同源性比對，找出與各菌相似性最高的菌株以確定其生物學(xué)分類地位[22]。

1.2.5 萌發(fā)菌遺傳多樣性分析 結(jié)合步驟1.2.4的BLAST同源性比對，利用Clustal–W軟件對所有序列進(jìn)行人工校正，使用Mega7.0生物軟件計算序列的K-2-P距離，使用鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析比較萌發(fā)菌序列的種間和種內(nèi)遺傳距離（自舉檢驗1000次），構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[23]。

1.2.6 天麻種子萌發(fā)試驗 萌發(fā)實驗參照徐錦堂等[24]的方法，將分離鑒定的各萌發(fā)菌接于滅菌的培養(yǎng)基菌袋中，待菌絲長滿袋后備用。于5月中旬進(jìn)行非林地田間栽培試驗，稱取質(zhì)量相同的天麻種子以及相同質(zhì)量的不同萌發(fā)菌菌塊，攪拌均勻后分別播種于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)藥植園和白山靖珍天麻有限公司基地的非林地農(nóng)田。每種萌發(fā)菌分別設(shè)計10個重復(fù)，3個平行組別，4個月后按單位面積（10 cm×10 cm）收獲圓球莖，測定其數(shù)量、重量和長度，進(jìn)行評價。

1.2.7 菌種種性退化檢驗 為了探究分離得萌發(fā)菌是否存在多次繼代種性退化的問題，對篩選所得優(yōu)良菌株進(jìn)行了種性退化檢驗。在無菌條件下，從分離純化的母種挑取單菌落接種在無菌PDA培養(yǎng)基上，在恒溫培養(yǎng)箱中24 ℃條件下培養(yǎng)，并反復(fù)傳代6次，每代三次重復(fù)，觀察繼代菌種的萌發(fā)時間、生長速度及菌落形態(tài)是否有衰退趨勢[25]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)整理采用Excel 2010軟件，顯著性分析采用SPSS 19.0軟件[26]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)學(xué)特征

共分離、純化出15個菌株，其中由葉片分離得6株、原球莖分離得9株萌發(fā)菌。因菌絲弱、生長不旺盛等原因，在傳代過程中部分菌株遭到淘汰，最后獲得6個菌株，JFGL-01、JFGL-02、JFGL-03分離自葉片，JFGL-04、JFGL-05、JFGL-06分離自原球莖。從表1可以看出6個萌發(fā)菌菌株的生物學(xué)特征各異，菌株菌絲萌發(fā)時間在2～3 d，其中JFGL-06菌絲萌發(fā)需要的時間最長，其他菌株間菌絲萌發(fā)時間差異不明顯；比較不同菌株菌絲生長速度可得出：生長速度最快的是JFGL-01菌株，最慢的菌株是JFGL-06，其他菌株菌絲生長速度在0.241～0.269 cm/d范圍內(nèi)，差異不顯著（P＞0.05）；從菌絲形態(tài)方面進(jìn)行比較可以發(fā)現(xiàn)：6株萌發(fā)菌均潔白、絨毛狀、氣生根發(fā)達(dá)，JFGL-06呈逆時針方向生長，JFGL-02、JFGL-03、JFGL-04、JFGL-01呈順時針方向生長，JFGL-05呈輻射狀生長。菌落具體形態(tài)特征詳情見表1和圖1。

圖1 6株萌發(fā)菌的菌落形態(tài)及顯微觀察特征（400×）Fig.1 Colony morphology and microscopic observation characteristics of 6 germinating fungi（400×）

表1 6株萌發(fā)菌在相同培養(yǎng)條件下的生長特性Table 1 Growth characteristics of 6 germinating fungi under the same culture conditions

2.2 分子生物學(xué)鑒定

各菌株DNA擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖2所示，電泳均只出現(xiàn)一條清晰、明亮條帶，在750 bp有條帶出現(xiàn)，符合真菌ITS序列長度范圍，表明兩種通用引物成功地擴增了萌發(fā)菌的ITS區(qū)基因序列。在BLAST同源性比對中發(fā)現(xiàn)，6株萌發(fā)菌的堿基序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的注冊基因同源性均超過98%，相同堿基覆蓋率均超過90%，在GenBank中的對比結(jié)果如表2所示。

表2 6株萌發(fā)菌在GenBank中同源性比對Table 2 Homology alignment of 6 germinating fungi in GenBank

圖2 6株萌發(fā)菌PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.2 The electrophoresis of PCR products of 6 strains germinating fungi

2.3 遺傳多樣性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

由BLAST同源性比對發(fā)現(xiàn)（圖3），6個菌株與Mycena purpureofusca（紫 褐 小 菇）和Mycena citrinomarginata（黃緣小菇）的同源性均為95%以上，通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，6個萌發(fā)菌株均與Mycena purpureofusca（紫褐小菇）菌株聚類在同一個分支上，自展支持率為99%，親緣關(guān)系密切，說明6個菌株均為Mycena purpureofusca（紫褐小菇）。使用Mega 7.0軟件計算序列的K-2-P距離，菌株JFGL-05與菌株JFGL-01、JFGL-02、JFGL-03、JFGL-04、JFGL-06種間遺傳距離為0.0016最大；菌 株JFGL-06與 菌 株JFGL-01、JFGL-02、JFGL-03、JFGL-04種間遺傳距離為0最小。

圖3 基于6株萌發(fā)菌ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 6 germinating fungi

2.4 不同菌株對非林地種植天麻種子萌發(fā)的影響

由表3可知，非林地條件下，不同萌發(fā)菌萌發(fā)長白山烏桿天麻種子原球莖數(shù)顯著不同（P＜0.05），其中，JFGL-06平均萌發(fā)原球莖數(shù)最多，JFGL-01次之，而JFGL-02不具備萌發(fā)能力。不同萌發(fā)菌株萌發(fā)所得原球莖長度不同（P＜0.05），由長到短依次為JFGL-06＞JFGL-01＞JFGL-04＞JFGL-03＞JFGL-05＞JFGL-02；不同菌株萌發(fā)種子所得原球莖重量不同（P＜0.05），原球莖重量由大到小依次為JFGL-06＞JFGL-05＞JFGL-01＞JFGL-03＞JFGL-04＞JFGL-02。說 明JFGL-06菌株對非林地條件下天麻種子萌發(fā)作用和促進(jìn)生長作用最好。

表3 不同萌發(fā)菌菌株對非林地種植天麻種子萌發(fā)力影響Table 3 Comparison of germinating power of different germinating fungi

2.5 菌種種性退化檢驗

如表4、圖4所示，在菌種繼代過程中，菌株JFGL-06的萌發(fā)時間、生長速度及菌落形態(tài)與原代相比均無明顯退化趨勢。

圖4 菌株JFGL-06不同繼代次數(shù)菌落形態(tài)圖Fig.4 Colony morphology of strain JFGL-06 with different subculture times

表4 菌株JFGL-06不同繼代次數(shù)生長趨勢Table 4 Growth trend of strain JFGL-06 with different subculture times

3 結(jié)論與討論

萌發(fā)菌隸屬于擔(dān)子菌綱、傘菌目、口蘑科、小菇屬，主要包括紫萁小菇（Mycena osmundieola）、石斛小菇（Mycena dendrobii）、開唇小菇（Mycena asmundicola）三類[27]。萌發(fā)菌通過侵染天麻種子為其萌發(fā)提供營養(yǎng)基礎(chǔ)，是天麻生產(chǎn)中必不可少的共生菌[28]。紫萁小菇和石斛小菇在天麻有性繁殖時被廣泛應(yīng)用，另外汪鋆植[29]等報道蘭小菇（Mycena orchidicola）、大白栓菌（Trametes laclinea）的真菌等也可以促進(jìn)天麻萌發(fā)。小菇屬真菌雖然種類多，但具有萌發(fā)作用的種類所占比例較少，本實驗證明Mycena purpureofusca（紫褐小菇）可促進(jìn)天麻種子萌發(fā)，并篩選出適宜非林地栽培的長白山烏桿天麻的本地優(yōu)良萌發(fā)菌JFGL-06，不僅豐富了天麻萌發(fā)菌種質(zhì)資源，還對長白山烏桿天麻有性繁殖具有重要意義。

天麻產(chǎn)區(qū)均有天麻種子萌發(fā)菌分布，但自然條件下，樹葉不易感染土壤中的萌發(fā)菌，常造成樹葉菌床播種法產(chǎn)量不穩(wěn)定，空穴率高，人工感染萌發(fā)菌是天麻種子萌發(fā)更有效的途徑，可見分離萌發(fā)菌十分必要[30]。但不同地區(qū)分離得到的萌發(fā)菌，對促進(jìn)天麻種子萌發(fā)的效果是不同的，優(yōu)良菌株的篩選十分必要。目前關(guān)于長白山烏桿天麻萌發(fā)菌菌種的親緣關(guān)系無研究報道，本研究分離得6個菌株經(jīng)鑒定為Mycena purpureofusca（紫褐小菇）的不同亞種,雖然與虞小燕等[31]檢驗分析的秦巴山區(qū)12個天麻萌發(fā)菌菌株在遺傳上存在一定差異，但同樣具有不同程度的萌發(fā)效果，并且證明分離自本地的萌發(fā)菌JFGL-06促進(jìn)長白山烏桿天麻種子萌發(fā)效果更好。本研究證實不同菌株對天麻種子發(fā)芽效果及原球莖生長速度有很大差異，菌株JFGL-06為適宜非林地長白山烏桿天麻種子萌發(fā)的最優(yōu)菌株。但菌株JFGL-06與市場流通商品菌株對非林地長白山烏桿天麻種子萌發(fā)力作用的異同有待進(jìn)一步研究，從根本上解決萌發(fā)菌對環(huán)境適宜性和與天麻親和性問題，對提高長白山烏桿天麻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展起到積極的促進(jìn)作用。