于 源，劉小芳，苗鈞魁，冷凱良,2, ，徐玉成

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部極地漁業(yè)開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東青島 266071；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室, 海洋藥物與生物制品功能實(shí)驗(yàn)室, 山東青島 266200；3.遼漁集團(tuán)有限公司, 遼寧大連 116001）

幾丁質(zhì)是自然界中含量第二豐富的大分子物質(zhì)，僅次于纖維素，主要β（1→4）連接的N-乙酰氨基葡萄糖構(gòu)成，在蝦蟹、昆蟲(chóng)的甲殼與一些真菌、海藻的細(xì)胞壁中廣泛分布[1?2]。殼聚糖是幾丁質(zhì)的衍生物，一般使用濃堿對(duì)幾丁質(zhì)進(jìn)行脫乙酰處理制備。殼聚糖的脫乙酰度大于50%，溶于酸溶液[3]。殼聚糖具有良好的抗菌活性、成膜特性、生物相容性、吸附性，同時(shí)具有較高的機(jī)械強(qiáng)度與可降解性[4?6]，廣泛應(yīng)用于食品保鮮防腐、水的凈化處理、抗菌膜的制備、傷口復(fù)原等方面[7?8]。殼寡糖是殼聚糖的降解產(chǎn)物，聚合度小于20，分子量低于3.9 kDa，相比于殼聚糖黏度更低。研究表明，殼寡糖對(duì)革蘭氏陰性菌株的抗菌效果與其脫乙酰度和聚合度有關(guān)，殼寡糖的C-2位游離氨基含量越高，抗菌活性越強(qiáng)[9?10]。殼寡糖可溶于水的特性使得其顯示出比殼聚糖更優(yōu)異的生物活性如抗菌、抗氧化、抗腫瘤、自由基清除、抗炎癥、降血壓、降血糖等，這些活性的發(fā)揮還與其聚合度與脫乙酰度息息相關(guān)[10?11]。酸水解與酶水解為殼寡糖最常見(jiàn)的制備方法，其中酶法降解反應(yīng)條件溫和，易于控制，有利于殼寡糖功能基團(tuán)的保持與聚合度的控制，有效保持殼寡糖的生物活性[12]。

南極磷蝦是南極生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，南極海域多種高等生物以南極磷蝦為食[13]。南極海洋生物資源保護(hù)委員會(huì)（CCAMLR）數(shù)據(jù)顯示，南極磷蝦的總生物量約六千余萬(wàn)噸，其中2018年捕撈量為31萬(wàn)余噸[14]。南極磷蝦是一種優(yōu)質(zhì)蛋白原，含有人類(lèi)全部必需氨基酸，生物學(xué)價(jià)值高于牛奶與禽蛋，同時(shí)氨基酸評(píng)分符合FAO的要求[15]。南極磷蝦脂質(zhì)富含n-3不飽和脂肪酸、磷脂型EPA、磷脂型DHA等成分，對(duì)人類(lèi)健康十分有益[16]。目前，南極磷蝦的開(kāi)發(fā)與研究以蛋白質(zhì)與磷蝦油為主，南極磷蝦油等產(chǎn)品已作為保健品上市并獲得消費(fèi)者認(rèn)可[17]。南極磷蝦的蝦頭、蝦殼占南極磷蝦總重的75%左右，大部分作為低值水產(chǎn)飼料進(jìn)行開(kāi)發(fā)，甚至作為廢棄物處理[18]。作為一種天然的生物資源，南極磷蝦殼中具有較高含量的甲殼素[19]。從南極磷蝦殼中對(duì)該類(lèi)聚合物進(jìn)行分離提取，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)殼聚糖與殼寡糖，有利于南極磷蝦資源的高效綜合利用。

本研究以南極磷蝦殼為原料，經(jīng)乳酸-中性蛋白酶處理獲得幾丁質(zhì)，以氫氧化鈉溶液進(jìn)行脫乙酰處理，探究堿溶液濃度、脫乙酰溫度、處理時(shí)間對(duì)殼聚糖產(chǎn)品脫乙酰度的影響，選取適宜的條件制備殼聚糖；選取商品化殼聚糖酶對(duì)殼聚糖進(jìn)行酶法降解，探究酶添加量與酶解時(shí)間對(duì)殼寡糖產(chǎn)量的影響，選取適宜的條件制備殼寡糖，并對(duì)殼寡糖的結(jié)構(gòu)特性進(jìn)行表征，以期為南極磷蝦產(chǎn)品開(kāi)發(fā)與該資源的綜合利用提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南極磷蝦冷凍蝦殼 遼漁集團(tuán)提供，冷凍蝦殼經(jīng)融化后于60 ℃烘干至恒重，粉碎后使用；中性蛋白酶 5 萬(wàn)U/g，索萊寶公司；殼聚糖酶 10 萬(wàn)U/g，最適pH5.6～5.8，最適溫度50～60 ℃，上海源葉生物科技有限公司；乙腈 色譜純，購(gòu)德國(guó)Merck公司；D2O Sigma公司；乳酸、鹽酸、氫氧化鈉、溴化鉀、甲醇等試劑 分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

Nexus470紅外光譜儀 美國(guó)Thermo公司；Agilent 1290-6460三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀 Agilent公司；AVANCE III 400核磁共振儀 德國(guó)Bruck公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 南極磷蝦殼聚糖制備 本研究中南極磷蝦殼聚糖與殼寡糖的制備工藝流程如圖1所示。

圖1 南極磷蝦殼聚糖與殼寡糖的制備工藝流程Fig.1 The preparation process of chitosan and chitooligosaccharide from Antarctic krill

參考前期報(bào)道的工藝進(jìn)行南極磷蝦甲殼素的制備，以南極磷蝦殼為原料，使用10% （V/V）的乳酸，以1:15 （m/V）的料液比處理4 h脫鈣；脫鈣后添加1% （m/V）的中性蛋白酶，以1:15 （m/V）的料液比，在pH 6的環(huán)境下酶解3 h脫蛋白，制備南極磷蝦甲殼素[20]。在南極磷蝦殼聚糖的制備過(guò)程中，使用氫氧化鈉對(duì)南極磷蝦甲殼素進(jìn)行脫乙酰處理，每組實(shí)驗(yàn)量取5 g甲殼素，以60% （m/V）氫氧化鈉、處理溫度100 ℃、處理時(shí)間3 h、反應(yīng)體系料液比1:20 （m/V）作為初始處理?xiàng)l件，分別探究氫氧化鈉溶液濃度（40%、50%、60%和70%）、不同處理溫度（90、100、110和120 ℃）、不同處理時(shí)間（1、2、3、4和5 h）各因素條件下的脫乙酰效果。脫乙酰處理后獲得的殼聚糖各試樣使用蒸餾水洗至中性，以殼聚糖質(zhì)量的剩余量與脫乙酰度作為檢測(cè)指標(biāo)，評(píng)價(jià)南極磷蝦甲殼素的脫乙酰效果。

1.2.2 南極磷蝦殼寡糖的制備 參考趙華等[21]報(bào)道，采用殼聚糖酶酶解法制備南極磷蝦殼寡糖，并結(jié)合本研究中殼聚糖酶的最適條件，對(duì)酶解條件稍作調(diào)整。稱(chēng)取1 g南極磷蝦殼聚糖，根據(jù)殼聚糖酶的最適pH與最適溫度，在100 mL pH為5.8的0.2 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖溶液體系下完全溶解。分別探索殼聚糖酶添加量分別為0.05%、0.1%、0.2% （m/V）時(shí)南極磷蝦殼寡糖生成量隨酶解時(shí)間（1～16 h）的變化規(guī)律，確定適宜的南極磷蝦殼寡糖制備條件。

1.2.3 指標(biāo)測(cè)定

1.2.3.1 南極磷蝦殼聚糖剩余量與脫乙酰度測(cè)定殼聚糖剩余量（%）的計(jì)算方式如下：

殼聚糖剩余量（%）= 脫乙酰反應(yīng)后殼聚糖質(zhì)量（g）/脫乙酰反應(yīng)前殼聚糖質(zhì)量（g）×100

殼聚糖脫乙酰度測(cè)定參考GB 29941-2013中所述電位滴定法[22]，以鹽酸溶液溶解南極磷蝦殼聚糖，使用氫氧化鈉溶液滴定，通過(guò)滴定過(guò)程中出現(xiàn)的兩個(gè)“突躍”點(diǎn)之間消耗的氫氧化鈉量可以計(jì)算待測(cè)樣品的脫乙酰度，計(jì)算方式如下：

脫乙酰度（%）=16.1×氫氧化鈉溶液濃度（mol/L）×氫氧化鈉消耗體積（mL）/ 殼聚糖質(zhì)量（g）×100

1.2.3.2 南極磷蝦殼聚糖品質(zhì)指標(biāo)測(cè)定 根據(jù)各因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取適宜的脫乙酰條件制備南極磷蝦殼聚糖，測(cè)定終產(chǎn)品的粘均分子量。南極磷蝦殼聚糖粘均分子量（Mw）采用烏氏粘度計(jì)法測(cè)定，通過(guò)測(cè)得的殼聚糖特性粘度[η]，根據(jù)公式計(jì)算粘均分子量[23]：

其中K值為1.81×10?3，α值為0.93。

殼聚糖的水分含量測(cè)定參考GB 5009.3所述[24]；灰分含量測(cè)定參考GB 5009.4所述[25]；酸不溶物含量測(cè)定參考SC/T 3403-2018所述[26]；殼聚糖溶液pH的測(cè)定參考GB 29941-2013所述[20]。

1.2.3.3 南極磷蝦殼寡糖含量的測(cè)定 參考李克成等[27]報(bào)道的方法，使用3, 5-二硝基水楊酸法（DNS法）測(cè)定南極磷蝦殼寡糖的含量（以還原糖含量計(jì)）。根據(jù)殼寡糖的單糖組成，DNS標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定實(shí)驗(yàn)采用濃度梯度為0～1 mg/mL的N-氨基葡萄糖溶液為標(biāo)準(zhǔn)品（標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程：y=0.347x?0.029,R2=0.999）。取1 mL待測(cè)酶解液與1 mL DNS混合煮沸5 min，迅速冷卻后定容至10 mL，于520 nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度值，代入DNS標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算待測(cè)酶解液中殼寡糖的濃度。向酶解液中添加5倍體積（V/V）乙醇沉淀殼寡糖，烘干稱(chēng)重，計(jì)算殼寡糖得率，計(jì)算方式如下：

南極磷蝦殼寡糖得率（%）= 酶解后乙醇沉淀所得殼寡糖質(zhì)量（g）/ 酶解前殼聚糖質(zhì)量（g）×100

1.2.4 南極磷蝦殼寡糖的結(jié)構(gòu)表征

1.2.4.1 紅外光譜分析 南極磷蝦殼寡糖的紅外光譜分析參考高雪梅等[28]報(bào)道，量取1 mg干燥的南極磷蝦殼寡糖，加入100 mg溴化鉀在研缽中粉碎均勻，以壓片機(jī)壓制透明薄片后于紅外光譜儀掃描，進(jìn)行紅外光譜解析。紅外光譜條件：掃描波段4000～500 cm?1；掃描次數(shù)20次。

1.2.4.2 核磁共振分析 南極磷蝦殼寡糖的1H、13C核磁共振分析參考程功等[29]報(bào)道并稍作調(diào)整。量取10 mg 南極磷蝦殼寡糖以1 mL D2O溶解，并交換三次，使樣品中氫原子完全被氘原子置換，將溶液轉(zhuǎn)移至核磁管，加入一滴氘代丙酮作為內(nèi)標(biāo)物，于核磁共振儀進(jìn)行1H、13C圖譜的分析。

1.2.4.3 質(zhì)譜分析 南極磷蝦的質(zhì)譜分析參考張靜文等[30]報(bào)道并稍作調(diào)整。南極磷蝦取南極磷蝦殼寡糖溶解于70% (V/V)甲醇溶液，離心后過(guò)0.22 μm濾膜，使溶液濃度達(dá)到10 pmol/L，進(jìn)行質(zhì)譜分析。質(zhì)譜條件：負(fù)離子ESI模式；進(jìn)樣量5 μL；流動(dòng)相100%甲醇；流速0.3 mL/min；洗脫時(shí)間3 min；質(zhì)量掃描范圍m/z 50～1000；吹干與噴霧氣體：N2。

1.3 數(shù)據(jù)處理

各實(shí)驗(yàn)設(shè)置三平行，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，使用SPSS 22.0軟件完成各數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 南極磷蝦殼聚糖的制備

本研究使用較高濃度的堿溶液完成南極磷蝦甲殼素的脫乙酰處理，考察了氫氧化鈉濃度、脫乙酰反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間三個(gè)因素對(duì)殼聚糖脫乙酰度的影響，如圖2所示。結(jié)果表明，隨著氫氧化鈉濃度的逐漸增大，殼聚糖產(chǎn)品的脫乙酰度從14.75%上升至82.20%，殼聚糖的余重也呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明乙?；拿摮Ч饾u增強(qiáng)。在理想狀態(tài)下，全部由N-氨基葡萄糖（Mw=179 Da）組成的殼聚糖占由乙酰氨基葡萄糖（Mw=221 Da）組成的甲殼素重量的81.0%。本研究中，使用50%氫氧化鈉溶液制備的殼聚糖脫乙酰度僅47.05%，脫乙酰反應(yīng)尚未完全。在已有的報(bào)道中，使用50%的氫氧化鈉進(jìn)行脫乙酰反應(yīng)的報(bào)道較多，如Bernardi等[5]處理成品甲殼素，所得殼聚糖脫乙酰度為72.3%；Knidri等[31]使用微波輔助脫乙酰法于100 ℃處理蝦殼2.5 h，所得殼聚糖脫乙酰度為75.08%～81.50%；Tokatl?等[32]在100 ℃處理蝦殼12 h，所得殼聚糖脫乙酰度為80.06%。本研究的結(jié)果表明，從不同來(lái)源的蝦殼制備殼聚糖的難易程度有顯著不同，為提高南極磷蝦殼聚糖的制備效果，需適當(dāng)提高氫氧化鈉的使用濃度。使用70%氫氧化鈉的處理組，殼聚糖的脫乙酰度雖然提高至82.20%，但殼聚糖的余重降至78.31%，低于81.0%，表明高濃度的氫氧化鈉溶液處理可能導(dǎo)致殼聚糖結(jié)構(gòu)的破壞。相比之下60% （m/V）氫氧化鈉的處理組的殼聚糖余重為81.55%，脫乙酰度為73.79%，該數(shù)值介于上述報(bào)道之間（72.3%～81.5%），表明該條件較適用于南極磷蝦殼寡糖的制備。

圖2 氫氧化鈉溶液濃度、脫乙酰反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間對(duì)南極磷蝦殼聚糖脫乙酰度與余重的影響Fig.2 Effects of sodium hydroxide concentration, deacetylation temperature and reaction time on the deacetylation degree and residual weight of Antarctic krill chitosan

反應(yīng)溫度的提高有利于乙?；摮Ч奶嵘?，在60% （m/V）氫氧化鈉濃度下，反應(yīng)溫度為90 ℃時(shí)，脫乙酰度為42.52%；溫度升高至110 ℃時(shí)，殼聚糖的脫乙酰度升高至80.95%，此時(shí)殼聚糖余重為80.10%，因而該溫度為較合適的反應(yīng)溫度。在已有報(bào)道中，大部分殼聚糖脫乙酰過(guò)程采用90～110 ℃高溫反應(yīng)。Mohanasrinivasan等[33]報(bào)道以70%氫氧化鈉于室溫處理蝦殼72 h，所得殼聚糖脫乙酰度為74.82%，由于反應(yīng)溫度較低，需要更高的堿溶液濃度以及較長(zhǎng)時(shí)間的反應(yīng)才能達(dá)到良好的脫乙酰效果，表明較高的反應(yīng)溫度可顯著提升脫乙酰反應(yīng)效率。然而，進(jìn)一步提高反應(yīng)溫度至120 ℃時(shí)，殼聚糖的脫乙酰度沒(méi)有提升，而殼聚糖的余重下降至78.13%，樣品的顏色呈黃色，表明高溫可能引起了殼聚糖產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)破壞。

處理時(shí)間的延長(zhǎng)有利于甲殼素乙?；摮Ч奶嵘?，在氫氧化鈉濃度為60%，反應(yīng)溫度100 ℃的條件下，脫乙酰度從第1 h的55.81%上升至4 h的81.01%，而后基本保持穩(wěn)定，因而脫乙酰反應(yīng)時(shí)間可控制在4 h。

殼聚糖在制備過(guò)程中一般使用約50%的氫氧化鈉在100 ℃左右完成脫乙酰處理，但從不同來(lái)源的蝦殼制備的殼聚糖，其脫乙酰條件和脫乙酰效果均有差異，脫乙酰度介于59.7%～81.5%之間[5,31?34]，低于本研究（表1）。與蝦殼來(lái)源的殼聚糖不同，Yen等[35]以40%氫氧化鈉于105 ℃處理蟹殼3 h，所得殼聚糖脫乙酰度達(dá)93.3%；Kumari等[34]以40%氫氧化鉀于90 ℃處理蟹殼6 h，所得殼聚糖脫乙酰度為70%，上述報(bào)道表明以不同水產(chǎn)品原料制備殼聚糖的難易程度與產(chǎn)品品質(zhì)不盡相同。本研究通過(guò)提高氫氧化鈉溶液濃度與處理溫度，在不影響南極磷蝦殼聚糖品質(zhì)的前提下，有效提升了殼聚糖的脫乙酰效果。

表1 不同脫乙酰條件對(duì)蝦殼殼聚糖脫乙酰度的影響Table 1 Effect of different deacetylation conditions on chitosan deacetylation degree from shrimp

100 g南極磷蝦殼在乳酸-中性蛋白酶處理后，使用60% （m/V）的氫氧化鈉于110 ℃脫乙酰處理4 h完成南極磷蝦殼聚糖的最終制備，最終獲得4.09 g殼聚糖，其脫乙酰度為85.74%，屬中脫乙酰度殼聚糖[26]。經(jīng)測(cè)定，南極磷蝦殼聚糖粘均分子量為305.65 kDa，水分含量4.66%，灰分含量0.98%，酸不溶物含量0.40%，10 g/L殼聚糖水溶液pH為7.8。本研究中制備的殼聚糖水分含量低于10%，灰分含量低于1%，酸不溶物含量低于1%，符合食品級(jí)殼聚糖的理化指標(biāo)要求[25]。

2.2 南極磷蝦殼寡糖的制備

殼聚糖酶添加量和酶解時(shí)間對(duì)南極磷蝦殼寡糖產(chǎn)生量的影響如圖3所示。結(jié)果表明，添加0.05%、0.1%殼聚糖酶的實(shí)驗(yàn)組，在酶解6 h后，酶解產(chǎn)生還原糖的速率顯著提升，酶解至第16 h時(shí)，還原糖含量分別為1.96 mg/mL與2.99 mg/mL，不過(guò)，還原糖的含量仍然處于上升趨勢(shì)，這是由于殼聚糖酶的添加量不足，導(dǎo)致酶解反應(yīng)尚不完全。繼續(xù)提高殼聚糖酶添加量至0.2%，酶解4 h后，還原糖生成量迅速提高，至酶解第14 h時(shí)，還原糖的含量趨于平穩(wěn)，酶解過(guò)程基本完全。酶解第16 h時(shí)還原糖含量為5.27 mg/mL，因此殼寡糖的酶解制備條件確定為殼聚糖酶添加量0.2%，酶解16 h，該條件下，從南極磷蝦殼聚糖制備殼寡糖的產(chǎn)品得率為46.0%。

圖3 殼聚糖酶添加量與酶解時(shí)間對(duì)殼寡糖產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of chitosanase addition and hydrolysis time on the yield of chitooligosaccharide

2.3 南極磷蝦殼寡糖的結(jié)構(gòu)表征

南極磷蝦殼寡糖經(jīng)凝膠過(guò)濾層析脫鹽后，使用紅外光譜、質(zhì)譜與核磁共振儀器分析法對(duì)殼寡糖的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行鑒定。南極磷蝦殼寡糖的紅外光譜圖如圖4所示，通過(guò)殼寡糖的紅外光譜可獲得一系列表征殼寡糖結(jié)構(gòu)的吸收峰，包括3400 cm?1附近的O-H振動(dòng)收縮峰與N-H非對(duì)稱(chēng)拉伸峰，2885 cm?1處的C-H振動(dòng)收縮峰[36]，1560 cm?1處的N-H2振動(dòng)吸收峰[8]，1409 cm?1處的C-H2振動(dòng)吸收峰[12]，1153 cm?1處的糖環(huán)C-O-C振動(dòng)收縮峰[8]，1072 cm?1處的糖環(huán)C-O振動(dòng)收縮峰[12]。而表征乙?；奶卣鞣迦?650 cm?1的酰胺I鍵吸收峰與1373 cm?1的酰胺III鍵吸收峰的峰強(qiáng)度相對(duì)偏低，表明南極磷蝦殼寡糖的脫乙酰程度較高。

圖4 南極磷蝦殼寡糖的紅外光譜譜圖Fig.4 Infrared spectrum of Antarctic krill chitooligosaccharide

通過(guò)核磁共振技術(shù)進(jìn)一步對(duì)殼寡糖的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行鑒定。1H譜各氫信號(hào)化學(xué)位移歸屬如圖5與表2所示。酶法降解使得殼寡糖還原端產(chǎn)生α與β異構(gòu)現(xiàn)象，譜圖中5.22 ppm與4.45 ppm處分別代表殼寡糖α與β異頭氫信號(hào)[37]。殼寡糖H-2位的信號(hào)峰出現(xiàn)在2.70 ppm附近，表明殼寡糖的游離氨基含量較高[37?38]，當(dāng)殼寡糖的乙?；枯^高時(shí)，H-2信號(hào)位于較低場(chǎng)3.1～3.2 ppm處，本研究中殼寡糖在該處信號(hào)峰強(qiáng)度較弱，表明其乙?；枯^低，而表征乙?；谆鶜涞男盘?hào)出現(xiàn)在1.96 ppm[8]。殼寡糖其他氫原子信號(hào)峰集中于3.3～3.9 ppm之間，其中H-3與H-4位的氫 信號(hào)位于3.61～3.85 ppm，H-5與H-6位的氫信號(hào)位于3.31～3.55 ppm[39]。13C譜各碳信號(hào)化學(xué)位移歸屬如圖5與表3所示。根據(jù)譜圖與報(bào)道，殼寡糖的異頭碳信號(hào)位于101.33 ppm，其余各碳信號(hào)分別為C-2: 56.33 ppm，C-3: 69.95 ppm，C-4: 76.18 ppm，C-5: 74.8 ppm，C-6: 60.04 ppm[8]。乙?；聂驶寂c甲基碳的信號(hào)位于181.4 ppm與23.3 ppm，峰強(qiáng)度相對(duì)較低。當(dāng)寡糖C-4位有糖苷鍵連接時(shí)，C-4與C-3信號(hào)峰位于較低場(chǎng)，同樣在譜圖中體現(xiàn)[39]。以上各碳信號(hào)均顯示出殼寡糖的結(jié)構(gòu)特征，且未出現(xiàn)任何雜質(zhì)的信號(hào)峰，表明殼寡糖樣品的純度較高。

圖5 南極磷蝦殼寡糖的1H與13C NMR譜圖Fig.5 1H and 13C NMR spectra of Antarctic krill chitooligosaccharide

表2 南極磷蝦殼寡糖的1H NMR化學(xué)位移歸屬Table 2 The 1H NMR chemical shift assignment of Antarctic krill chitooligosaccharide

表3 南極磷蝦殼寡糖的13C NMR化學(xué)位移歸屬Table 3 The 13C NMR chemical shift assignment of Antarctic krill chitooligosaccharide

南極磷蝦殼寡糖的聚合度通過(guò)ESI負(fù)離子質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行解析，殼寡糖的質(zhì)譜譜圖如圖6所示。結(jié)果顯示m/z 339、560、721三個(gè)碎片峰的豐度較高，其中m/z 339碎片峰代表由兩分子氨基葡萄糖GlcN構(gòu)成的二糖；m/z 560代表由兩分子GlcN與一分子乙酰氨基葡萄糖GlcNAc構(gòu)成的三糖；m/z 721代表由三分子GlcN與一分子GlcNAc構(gòu)成的四糖。上述結(jié)果表明寡糖主要由二糖、三糖、四糖構(gòu)成。除此之外，四糖碎片峰m/z 661 （GlcN）4、五糖碎片峰m/z 823 （GlcN）5；m/z 882 （GlcN）4-GlcNAc同時(shí)產(chǎn)生。m/z 984表征六糖（GlcN）6的碎片峰豐度較低，表明南極磷蝦殼寡糖樣品的聚合度為2至5（表4）。殼聚糖產(chǎn)品未顯示出單一的聚合度，且酶解終產(chǎn)物中未檢測(cè)到單糖的碎片峰，因而本研究中用到的殼聚糖酶的水解方式為內(nèi)切[40]。質(zhì)譜結(jié)果顯示殼聚糖酶解終產(chǎn)物為二糖（GlcN）2與三糖（GlcN）2-GlcNAc，但未顯示任何表征三糖（GlcN）3的碎片峰，推測(cè)該殼聚糖酶通過(guò)識(shí)別（GlcN）2重復(fù)單元的兩端的糖苷鍵完成對(duì)殼聚糖的酶解，因此酶解過(guò)程中未產(chǎn)生（GlcN）3片段。本研究中酶解終產(chǎn)物與大腸桿菌外源表達(dá)的殼聚糖酶CDA20與芽孢表達(dá)的殼聚糖酶BsCsn46A的酶解終產(chǎn)物三糖（GlcN）3有所不同[37,41]。

表4 南極磷蝦殼寡糖質(zhì)譜碎片峰解析Table 4 MS fragmentation analysis of Antarctic krill chitooligosaccharide

圖6 南極磷蝦殼寡糖的ESI負(fù)離子質(zhì)譜譜圖Fig.6 ESI negative ion mass spectrometry of Antarctic krill chitooligosaccharide

3 結(jié)論

本研究在乳酸-中性蛋白酶處理制備甲殼素的基礎(chǔ)上，探索了堿溶液脫乙酰制備南極磷蝦殼聚糖與酶法制備南極磷蝦殼寡糖的工藝，制備了較高品質(zhì)的南極磷蝦殼聚糖與殼寡糖。其中殼聚糖的脫乙酰度為85.74%，粘均分子量為 305.65 kDa，水分含量4.66%、灰分含量0.98%、酸不溶物含量0.40%，理化指標(biāo)均符合食品級(jí)殼聚糖的要求；以適宜的酶解條件，從南極磷蝦殼聚糖制備的殼寡糖產(chǎn)品得率為46.0%，儀器分析結(jié)果顯示南極磷蝦殼寡糖主要由二糖、三糖與四糖構(gòu)成。鑒于殼聚糖與殼寡糖良好的抗菌、抗氧化等活性，從南極磷蝦殼中大量制備較高品質(zhì)的殼聚糖與殼寡糖，進(jìn)一步拓展南極磷蝦產(chǎn)品在食品工業(yè)的應(yīng)用范圍，實(shí)現(xiàn)南極磷蝦資源的全效綜合利用。