高?；?，黎玉瓊，汪 潔，扈寧霞，王培柱，吳學青，康曉冬*

(1.寧夏農(nóng)林科學院動物科學研究所，銀川 750002；2.陜西榆林市綏德縣名州區(qū)農(nóng)牧業(yè)綜合服務(wù)站，綏德 718000；3.寧夏吳忠市利通區(qū)扁擔溝鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)工作站，吳忠 751100)

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli,E.coli)為條件性致病菌，在一定條件下可單獨感染或者同其他致病菌混合感染引起發(fā)病。大腸埃希氏菌的血清型復(fù)雜，毒力基因種類多且經(jīng)常同時攜帶多種毒力基因，防控和治療任務(wù)艱巨。目前，在奶牛肉牛養(yǎng)殖中，抗生素是治療該病的首選藥物，寧夏回族自治區(qū)牛對阿米卡星敏感性最高[1]。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extend spectrum β-lactamase,ESBLs)是一種可以為大腸埃希氏菌提供多種β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的水解酶[2]，可以通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和接合等形式在細菌中傳播擴散耐藥基因，是細菌對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的主要耐藥機制[3]。國際上研究認為ESBLs是較為活躍的β-內(nèi)酰胺酶，尤其是在腸桿菌科細菌中起到較為重要的作用[4]。不同國家、地區(qū)獸醫(yī)用藥習慣、劑量不同，使得不同國家、地區(qū)基因型和基因亞型也存在差異。奶牛和肉牛是我區(qū)畜牧業(yè)重要的支柱產(chǎn)業(yè)，肉牛又是南部山區(qū)脫貧攻堅的主力軍，本研究開展牛源產(chǎn)ESBLs大腸埃希氏菌篩選、耐藥性比較，為牛源產(chǎn)ESBLs大腸埃希氏菌在我區(qū)感染和流行提供資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本 于2017年10月至2020年10月采集寧夏地區(qū)規(guī)?；鼋】翟锤厥米?20份，腹瀉源牛肛拭子157株，離心管收集，冰袋運輸。

1.1.2 藥品 ESBLs測定盒[頭孢他定(CAZ)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢他定/克拉維酸(CAZ/clav))、頭孢噻肟/克拉維酸(CTX/clav)]，本著經(jīng)濟、有效、廣譜、安全的原則，選用臨床常用抗菌藥物21種，具體如下：頭孢拉定(先鋒VI，30 μg/片，批號200513)，頭孢呋辛(30 μg/片，批號200525)，鏈霉素(10 μg/片，批號200524)，復(fù)方新諾明(23.78 μg SMZ/1.25 μg TM/片，200508)，紅霉素(15 μg/片，批號200520)，卡那霉素(30 μg/片，批號200513)，哌拉西林(100 μg/片，批號200607)，頭孢氨芐(頭胞力新，30 μg/片，批號200515)，四環(huán)素(30 μg/片，批號200515)，諾氟沙星(10 μg/片，批號200511)，頭孢噻肟(30 μg/片，批號200602)，環(huán)丙沙星(5 μg/片，批號200517)，頭孢唑啉(30 μg/片，批號200603)，慶大霉素(10 μg±2.5 μg/片，批號200513)，頭孢曲松(30 μg/片，批號200530)，阿米卡星(30 μg±7.5 μg/片，批號200609)，恩諾沙星(5 μg/片，批號200523)，氧氟沙星(5 μg/片，批號200605)，阿莫西林(10 μg/片，批號200517)，氨芐西林(10 μg/片，批號200527)，頭孢他啶(30 μg/片，批號200529)等，杭州濱和微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要試劑 麥康凱培養(yǎng)基MAC(批號161119)、伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基(EMB)(批號161020)、MH 瓊脂培養(yǎng)基 (批號161021)，青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；4.5 g/L NaCl溶液，法國梅里埃公司產(chǎn)品；細菌基因組DNA提取試劑盒、2×TaqPCR MasterMix、MarkerⅠ，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 全自動微生物鑒定系統(tǒng)(VITEK-2-Compact15)，法國梅里埃公司產(chǎn)品；PCR儀，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；超凈工作臺(SW-CJ-1FD)，蘇凈集團安泰公司產(chǎn)品；電子比濁儀(DensiCHEK Plus)，美國 BioMerieux公司產(chǎn)品；電熱恒溫培養(yǎng)箱(PHP-9162)，浙江托普儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 大腸埃希氏菌的分離鑒定 將肛拭子于營養(yǎng)肉湯中37℃過夜培養(yǎng)，培養(yǎng)物接種于EMB、MAC，培養(yǎng)16 h～24 h，鏡檢純化，VITEK 2 Compact進行菌種鑒定，挑選鑒定為陽性的大腸埃希氏菌進行16S rRNA鑒定[1]，引物序列見表1。

表1 基因檢測引物序列及大小Table 1 Primer sequences and fragment size of gene detection

1.2.2 大腸埃希氏菌ESBLs篩選 用麥氏比濁儀調(diào)整菌液濃度為0.5個麥氏單位，接種于MH平板上，均勻涂布，采用雙紙片協(xié)同法，貼ESBLs測定盒中的CTX(30 μg)、CTX/CLA(30 μg/10 μg)，CAZ(30 μg)、CAZ/CAL(30 μg/10 μg)兩組于平板，37℃過夜培養(yǎng)，比較加入克拉維酸與不加克拉維酸的抑菌直徑≥5 mm者判定為產(chǎn)ESBLs菌株。

1.2.3 耐藥性試驗 試驗采用K-B法進行，確定大腸埃希氏菌的藥物敏感性，結(jié)果按照臨床實驗室標準化委員會(CLSI)標準判定。

2 結(jié)果

2.1 大腸埃希氏菌的分離鑒定

277份肛拭子樣本中分離到142株大腸埃希氏菌，陽性率51.26%，分離株在EMB上呈具有黑色金屬光澤菌落，在MAC上呈圓形、突起光滑、濕潤的粉色菌落，純化菌株經(jīng)VITEK 2 Compact鑒定為大腸埃希氏菌。

2.2 大腸埃希氏菌的16S rRNA鑒定

擴增2.1中鑒定株的16S rRNA基因，符合目的條帶的部分產(chǎn)物送測序，經(jīng)Blast比對確定為大腸埃希氏菌。

2.3 ESBLs檢測結(jié)果

抑菌圈直徑分析顯示，腹瀉源性74株大腸埃希氏菌有51株為產(chǎn)ESBLs菌株，23株為非產(chǎn)ESBLs菌株，陽性率為68.92%。非腹瀉源68株大腸埃希氏菌有35株為產(chǎn)ESBLs菌株，33株為非產(chǎn)ESBLs菌株，陽性率為51.47%。

2.4 藥敏試驗結(jié)果

2.4.1 74株腹瀉源大腸埃希氏菌藥敏試驗結(jié)果 74株腹瀉源大腸埃希氏菌對試驗藥物多數(shù)呈耐藥狀態(tài)，對阿米卡星和頭孢他啶較敏感，產(chǎn)ESBLs株耐藥率普遍高于非產(chǎn)ESBLs株，產(chǎn)ESBLs與非產(chǎn)ESBLs株對阿米卡星耐藥率分別為15.69%和4.35%，頭孢他啶耐藥率分別為11.76%和4.35%，差異不顯著(P>0.5)，對其他藥物耐藥率高，差異不顯著(P>0.5)，具體見表2和表3。

2.4.2 68株健康源大腸埃希氏菌藥敏試驗結(jié)果 68株健康源大腸埃希氏菌耐藥率整體低于腹瀉源大腸埃希氏菌，對阿米卡星和頭孢呋辛較敏感，產(chǎn)ESBLs株耐藥率均高于非產(chǎn)ESBLs株，產(chǎn)ESBLs與非產(chǎn)ESBLs株對頭孢氨芐耐藥率分別為81.82%和17.14%，差異顯著(P<0.05)；對頭孢呋辛耐藥率分別為21.21%和0，對卡那霉素分別為63.64%和20.00%，對紅霉素分別為63.64%和14.29%，對其他藥物均耐藥率較高，但差異不顯著(P>0.05)，具體見表2和表3。

M.DNA MarkerⅠ；1.陰性對照；2～8.分離株P(guān)CR產(chǎn)物M.DNA MarkerⅠ;1.Negative control;2-8.PCR products of isolates圖1 16S rRNA PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of 16S rRNA

表2 產(chǎn)ESBLs大腸埃希氏菌藥敏試驗結(jié)果Table 2 Results of drug susceptibility test of Escherichia coli producing ESBLs strains

表3 非產(chǎn)ESBLs大腸埃希氏菌藥敏試驗結(jié)果Table 3 Results of drug susceptibility test of Escherichia coli non-producing ESBLs strains

2.4.3 產(chǎn)ESBLs與非產(chǎn)ESBLs株藥敏試驗結(jié)果 產(chǎn)ESBLs株對頭孢他啶耐藥率中，腹瀉源性大腸埃希氏菌極顯著低于健康源大腸埃希氏菌(P<0.01)，非產(chǎn)ESBLs株對頭孢氨芐、紅霉素耐藥率中，腹瀉源性大腸埃希氏菌顯著高于健康源大腸埃希氏菌(P<0.05)，對頭孢呋辛耐藥率中，腹瀉源性大腸埃希氏菌極顯著高于健康源大腸埃希氏菌(P<0.01)。

2.5 多重耐藥結(jié)果

10重耐藥以上產(chǎn)ESBLs大腸埃希氏菌中，腹瀉源極顯著高于健康源(P<0.01)，腹瀉源多重耐藥為10耐及以上，1株為全部耐藥，健康源多重耐藥為2耐及以上，無全部耐藥。非產(chǎn)ESBLs大腸埃希氏菌中，腹瀉源5株為19重耐藥，健康源無19重耐藥，健康源中3株不存在耐藥情況，1株為非耐藥株。產(chǎn)ESBLs大腸埃希氏菌多重耐藥率高于非產(chǎn)ESBLs大腸埃希氏菌，但差異不顯著(P>0.05)，具體見表4和表5。分離株多重耐藥情況嚴重，腹瀉源產(chǎn)ESBLs大腸埃希氏菌耐藥情況最嚴重。

表4 產(chǎn)ESBLs大腸埃希氏菌多重耐藥情況Table 4 Multiple drug resistance of Escherichia coli producing ESBLs strains

表5 非產(chǎn)ESBLs大腸埃希氏菌多重耐藥情況Table 5 Multiple drug resistance of Escherichia coli non-producing ESBLs strains

3 討論

大腸埃希氏菌是腸道正常菌群，維護腸道健康，使細菌耐藥基因產(chǎn)生、傳遞、轉(zhuǎn)移更加方便[5]。隨著對抗生素的廣泛使用，多重耐藥菌及耐藥基因急劇增長，對公共衛(wèi)生安全構(gòu)成威脅。ESBLs主要由腸桿菌科產(chǎn)生，由質(zhì)粒介導(dǎo)，編碼ESBLs酶的基因可通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合、整合等途徑擴散到細菌中，使大腸埃希氏菌對新型廣譜 β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性增加[6-7]。對分離自寧夏地區(qū)277株牛源大腸埃希氏菌進行ESBLs表型檢測，腹瀉源與健康源產(chǎn)ESBLs菌株陽性率分別為68.92%和51.47%，均高于四川省禽源大腸埃希氏菌產(chǎn)ESBLs菌株檢出率(36.83%)[8]，高于廣東省食品動物(雞、鴨、鵝和豬)中大腸埃希氏菌產(chǎn)ESBLs菌株的檢出率(19.37%)[9]，低于青島雞源大腸埃希氏菌產(chǎn)ESBLs菌株檢出率(93.13%)[10]，低于虎源大腸埃希氏菌產(chǎn)ESBLs菌株檢出率(70.00%)[11]。不同畜種、來源、地區(qū)，大腸埃希氏菌產(chǎn)ESBLs菌株的流行分布存在差異，且寧夏地區(qū)牛源產(chǎn)ESBLs大腸埃希氏菌在寧夏地區(qū)牛養(yǎng)殖場中流行普遍，需要引起重視。

研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)ESBLs株、非產(chǎn)ESBLs株中腹瀉源性、健康源大腸埃希氏菌藥物敏感性存在差異。

產(chǎn)ESBLs株對頭孢他啶耐藥率中，腹瀉源性大腸埃希氏菌極顯著低于健康源大腸埃希氏菌(P<0.01)。非產(chǎn)ESBLs株對頭孢呋辛耐藥率中，腹瀉源性大腸埃希氏菌極顯著高于健康源大腸埃希氏菌(P<0.01)，非產(chǎn)ESBLs株對頭孢氨芐、紅霉素耐藥率中，腹瀉源性大腸埃希氏菌顯著高于健康源大腸埃希氏菌(P<0.05)。分離菌株長期處于多種抗生素的選擇壓力下，不同地區(qū)、不同管理模式均會影響藥物敏感性，導(dǎo)致產(chǎn)ESBLs株、非產(chǎn)ESBLs、腹瀉源、健康源大腸埃希氏菌耐藥情況復(fù)雜。

本研究中腹瀉源產(chǎn)ESBLs菌株的耐藥性普遍高于非產(chǎn)ESBLs菌株，腹瀉源產(chǎn)ESBLs株對其他藥物耐藥率均大于54.80%,非產(chǎn)ESBLs株對其他藥物耐藥率均大于47.80%，但差異不顯著(P>0.05)。對阿米卡星、頭孢他啶較敏感。史量全等[12]發(fā)現(xiàn)通遼地區(qū)牛腹瀉大腸埃希氏菌對阿米卡星、哌拉西林、亞胺培南、美洛培能敏感，王理想[13]試驗表明腹瀉牛臟器源大腸埃希氏菌對左氧氟沙星、慶大霉素敏感。健康源產(chǎn)ESBLs菌株的耐藥性明顯高于非產(chǎn)ESBLs菌株，分離株對阿米卡星、頭孢呋辛較敏感。對頭孢氨芐耐藥率分別為81.82%和17.14%，差異顯著(P<0.05)，其他藥物均差異不顯著(P>0.05)。坤清芳等[14]研究發(fā)現(xiàn)兔源產(chǎn)ESBLs大腸埃希氏菌對頭孢他啶、阿米卡星、頭孢西丁、頭孢唑啉和諾氟沙星的耐藥率顯著高于非產(chǎn)ESBLs菌株。腹瀉源與健康源產(chǎn)ESBLs株耐藥率水平基本相當，腹瀉源非產(chǎn)ESBLs株耐藥率高于健康源非產(chǎn)ESBLs株。ESBLs是介導(dǎo)大腸埃希氏菌對β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥的主要因素[15]，編碼ESBLs酶的基因可以與其他非ESBLs酶耐藥基因整合于同一質(zhì)粒，將耐藥基因進行傳播[14,16]，不同地區(qū)、不同畜種、不同養(yǎng)殖規(guī)模、不同生產(chǎn)管理條件都會影響耐藥基因的表達。

產(chǎn)酶菌株對頭孢噻肟等抗菌藥物的耐藥率均高于非產(chǎn)酶菌株[17]，80.60% 的產(chǎn)ESBLs菌株表現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象[18]。本研究中產(chǎn)ESBLs菌株多重耐藥率高于非產(chǎn)ESBLs菌株，研究結(jié)果一致。本研究顯示產(chǎn)ESBLs大腸埃希氏菌中，腹瀉源多重耐藥為10耐及以上，1株為全部耐藥，健康源多重耐藥10耐及以上占比77.14%，無全部耐藥，腹瀉源極顯著高于健康源(P<0.01)。非產(chǎn)ESBLs大腸埃希氏菌中，腹瀉源5株為19重耐藥，健康源無19重耐藥，3株為單重耐藥，1株為非耐藥?？赡芨篂a源性大腸埃希氏菌中部分為致病菌，毒力水平和耐藥水平較高，分離株多重耐藥現(xiàn)象普遍存在，腹瀉源產(chǎn)ESBLs大腸埃希氏菌耐藥情況最嚴重。藥物的廣泛應(yīng)用及新抗菌藥物的臨床應(yīng)用，使得大腸埃希氏菌產(chǎn)ESBLs酶株越來越多，多重耐藥現(xiàn)象越來越復(fù)雜，應(yīng)該引起更多的關(guān)注。

寧夏地區(qū)牛源產(chǎn)ESBLs大腸埃希氏菌檢出率高，多重耐藥現(xiàn)象嚴重，尤其是腹瀉牛，提示寧夏地區(qū)牛場中產(chǎn)ESBLs菌株流行普遍。牛是耐藥大腸埃希氏菌的重要宿主，ESBLs酶編碼基因常常存在于質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子或整合子等可移動元件上，可以通過食用牛奶、牛肉等方式傳遞給人類，有重要公共衛(wèi)生意義，應(yīng)定期開展ESBLs水平監(jiān)測，平時治療時減少抗生素的使用。