郭俏儷，武志博，周玉碧，甘 霖，王雪芹，郝佳辰，左合君,

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)沙漠治理學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.阿拉善盟林業(yè)治沙研究所，內(nèi)蒙古阿拉善左旗 750306；3.中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所，青海西寧 810008；4.阿拉善盟科技信息研究所，內(nèi)蒙古阿拉善左旗 750306；5.阿拉善盟林業(yè)和草原局種苗工作站，內(nèi)蒙古阿拉善左旗 750306；6.阿拉善盟航空護(hù)林站，內(nèi)蒙古阿拉善左旗 750306；7.內(nèi)蒙古自治區(qū)風(fēng)沙物理與防沙治沙工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

蘭州肉蓯蓉（Cistanche lanzhouensis）是列當(dāng)科肉蓯蓉屬的一種草本寄生植物，生于荒漠草原、半荒漠的山前平原及沙質(zhì)梁地和黃土丘陵、河谷溝等地，分布地僅為甘肅蘭州[1]。蘭州肉蓯蓉寄主單一，目前僅發(fā)現(xiàn)其寄生于植物紅砂（Reaumuria soongorica）的根上[2]。肉蓯蓉入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為名貴的滋補(bǔ)中藥材[3]，目前以肉蓯蓉作為原料廣泛應(yīng)用于國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局已批準(zhǔn)的保健食品，主要的產(chǎn)品型態(tài)有酒類、茶類、片劑、顆粒、膠囊、口服液等[4]。近年來，由于肉蓯蓉資源被廣泛開發(fā)利用，大量采挖造成其資源匱乏，研究發(fā)現(xiàn)其同屬不同種植物同樣具有與之相近的有效成分[5?7]，因此我國(guó)不少地區(qū)也將本屬其它植物入藥使用[8]，蘭州肉蓯蓉在蘭州地區(qū)被作為肉蓯蓉替代品入藥[9]。

多糖是由多個(gè)單糖通過糖苷鍵連接而成的一種高分子化合物，多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，化學(xué)成分多樣。肉蓯蓉藥材主要含苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜、木脂素及其苷類、酚苷、單萜苷、生物堿、糖類、糖醇、甾醇等成分[10]，研究表明肉蓯蓉多糖具有調(diào)節(jié)免疫活性[11]、保護(hù)神經(jīng)[12]、抗骨質(zhì)疏松[13]等藥理作用，肉蓯蓉多糖也對(duì)于衰老模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有一定的改善[14]，具有增強(qiáng)記憶力的功能。自由基和天然抗氧化劑的研究是目前抗氧化和抗衰老方面研究的重點(diǎn)內(nèi)容。自由基是人體生命活動(dòng)中各種生化反應(yīng)的中間代謝產(chǎn)物，具有高度的氧化活性，極不穩(wěn)定，若體內(nèi)自由基積累過多或清除過慢，會(huì)造成機(jī)體內(nèi)生物大分子物質(zhì)和組織器官的損傷，加速機(jī)體衰老并引發(fā)各種疾病。近年來，隨著人們對(duì)合成抗氧化劑毒性的認(rèn)識(shí)，研究和開發(fā)安全的天然抗氧化劑已成為一個(gè)重要的研究方向。目前，肉蓯蓉多糖對(duì)于自由基的清除能力也有一定的研究[15]，肉蓯蓉多糖的研究比較成熟，針對(duì)肉蓯蓉多糖含量和相對(duì)分子質(zhì)量及分布的測(cè)定研究也較廣泛[16]，但對(duì)蘭州肉蓯蓉的研究尚淺，僅有藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，蘭州肉蓯蓉具有一定的潤(rùn)腸通便作用[9]。且研究得出蘭州肉蓯蓉中毛蕊花糖苷的含量高于肉蓯蓉[17]，尚未有蘭州肉蓯蓉多糖測(cè)定和組成分析及其抗氧化作用的研究報(bào)道。

針對(duì)目前所存在的問題，本文擬以蘭州肉蓯蓉為研究對(duì)象，提取其中的多糖類物質(zhì)，并對(duì)其多糖進(jìn)行分離，采用高效凝膠滲透色譜法（High Performance-Gel Permeation Chromatography，HPGPC）對(duì)多糖的分子量進(jìn)行測(cè)定，并利用高效快速、靈敏度較高、穩(wěn)定性好的高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）法深入研究其多糖的組成[18]，最后采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH）自由基清除能力和總抗氧化能力試驗(yàn)分析其抗氧化活性，旨在研究蘭州肉蓯蓉的單糖組成和抗氧化作用，為證實(shí)蘭州肉蓯蓉的功效和提高蘭州肉蓯蓉附加價(jià)值提供理論依據(jù)，也為其資源的開發(fā)利用提供一定的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘭州肉蓯蓉采于蘭州九州區(qū)，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)孫學(xué)剛教授鑒定為列當(dāng)科肉蓯蓉屬植物蘭州肉蓯蓉；二乙氨乙基纖維素（DEAE纖維素） 上海恒信化學(xué)試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）美國(guó)Sigma-Aldrich公司；總抗氧化能力試劑盒（ABTS法） 碧云天生物技術(shù)有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

YB-250型高速多功能粉碎機(jī) 永康市速鋒工貿(mào)有限公司；UV-5500PC紫外可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；SJZX多功能酶標(biāo)儀 珀金埃爾儀器有限公司；LC-10AD液相色譜儀（配有可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器和CLASS-VP色譜工作站） 島津日本公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蘭州肉蓯蓉粗多糖的制備 稱取蘭州肉蓯蓉肉質(zhì)莖鮮樣2.5 kg，將其進(jìn)行切片后按1:5（v/v）料液比加入12.5 L蒸餾水煮沸3 h，進(jìn)行三次煮沸提取，煮沸后過濾，收集三次過濾液，合并后加75%乙醇靜置過夜，醇沉液用離心機(jī)4000 r/min進(jìn)行離心30 min，收集沉淀，將沉淀物揮發(fā)乙醇用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行干燥[19]，得粗多糖CLP。

1.2.2 蘭州肉蓯蓉多糖的柱層析 取一定量DEAE-纖維素充分浸泡溶脹后，攪勻并進(jìn)行脫氣處理。采用DEAE-纖維素陰離子交換色譜柱（55 cm×10.5 cm I.D.）裝柱后依次用3倍柱體積的蒸餾水和3倍柱體積0.5 mol/L NaCl溶液進(jìn)行平衡。

準(zhǔn)確稱取100.00 mg粗多糖溶于10 mL超純水中，以11.00 mL/min的流速進(jìn)行上樣，后以同樣流速進(jìn)行蒸餾水洗脫，收集3倍柱體積洗脫液，濃縮，冷凍干燥后得中性糖CLP-1；以19.63 mL/min流速進(jìn)行0.5 mol/L NaCl溶液洗脫，收集3倍柱體積洗脫液，經(jīng)MD 34透析袋（透析分子量：3500 D）透析后濃縮，冷凍干燥得酸性糖CLP-2。

1.2.3 蘭州肉蓯蓉多糖的紫外光譜檢測(cè) 將CLP-1、CLP-2樣品配制為1.0 mg/mL濃度多糖，在紫外可見分光光度計(jì)的210～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描，根據(jù)在260 nm和280 nm處是否出峰來檢測(cè)多糖樣品中是否含有蛋白質(zhì)及核酸。

1.2.4 蘭州肉蓯蓉多糖的基本成分測(cè)定

1.2.4.1 總糖含量的測(cè)定 采用苯酚-硫酸法測(cè)定樣品中的總糖含量[20]。用移液管分別量取0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0、0.2 、0.4、0.6、0.8、1.0 mL轉(zhuǎn)于玻璃試管（1.8×18 cm）中，向試管中加蒸餾水補(bǔ)至1.0 mL，每組進(jìn)行三個(gè)重復(fù)，分別于每支試管中加入6%苯酚試劑0.5 mL，濃硫酸2.5 mL，迅速振蕩搖勻，然后冷卻至室溫。在分光光度計(jì)λ490nm處測(cè)定吸光度。以吸收度為縱坐標(biāo)，糖含量為橫坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。分別取濃度為0.1 mg/mL的樣品溶液l mL，每個(gè)濃度三個(gè)重復(fù)，分別于每支試管中加入6%苯酚試劑0.5 mL，濃硫酸2.5 mL，迅速振蕩均勻，冷卻至室溫。在λ490nm處測(cè)定吸光度A。根據(jù)樣品吸光度值和回歸方程計(jì)算各樣品中的糖含量。

1.2.4.2 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定樣品的蛋白質(zhì)含量[21]。取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和濃度為0.1 mg/mL的樣品溶液l.0 mL，進(jìn)行三個(gè)重復(fù)，分別向每支試管中加入考馬斯亮藍(lán)溶液4.0 mL，快速振蕩搖勻后，靜置5 min后在分光光度計(jì)λ595 m處測(cè)定光吸收值A(chǔ)595nm，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算各樣品中的蛋白質(zhì)含量。

1.2.4.3 糖醛酸含量的測(cè)定 采用間羥基聯(lián)苯法測(cè)定樣品中糖醛酸含量[22]。取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和0.1 mg/mL的樣品溶液0.4 mL，向各管溶液中分別對(duì)應(yīng)加入40 μL氨基磺酸（pH2.5），振蕩搖勻后，向各管加入2.5 mL濃硫酸溶液，將各管中的溶液混合均勻，沸水浴25 min，在取出后立即用涼水（流動(dòng)水）冷卻到室溫，向各管中分別加入40 μL 0.3%間羥基聯(lián)苯/0.5%氫氧化鈉溶液，混勻后，常溫放置30 min，測(cè)定吸光度A525nm值，測(cè)定后再根據(jù)回歸方程計(jì)算各樣品中糖醛酸含量。

1.2.5 蘭州肉蓯蓉多糖的分子量測(cè)定 采用高效凝膠色譜儀HPGPC[23]法測(cè)定蘭州肉蓯蓉多糖相對(duì)分子量。

1.2.5.1 樣品的前處理 將CLP、CLP-1、CLP-2樣品各稱取10.00 mg溶于1.00 mL 0.15 mol/L NaCl溶液中，并經(jīng)過0.22 μm微濾膜過濾處理，取多糖混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行相同處理。

1.2.5.2 色譜條件 TSK-Gel G3000 PWXL（7.8 mm I.D.×30 cm）色譜柱，柱溫設(shè)定為40 ℃，流動(dòng)相采用0.15 mol/LNaCl溶液，流速設(shè)定為0.6 mL/min，進(jìn)樣量設(shè)定為20 μL，使用示差檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，記錄各樣品的洗脫體積。

1.2.6 蘭州肉蓯蓉多糖的單糖組成測(cè)定 采用高效液相色譜儀HPLC進(jìn)行單糖組成測(cè)定。

1.2.6.1 樣品的前處理 a. 酸水解 稱取10.00 mg蘭州肉蓯蓉多糖樣品溶于1 mL 2 mol/L TFA（三氟乙酸）溶液中，于120 ℃烘箱加熱2 h后將液體轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，于45 ℃水浴鍋中蒸發(fā)至無酸味[24]。

b. 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍生化向蒸發(fā)皿中加入1 mL NaOH/PMP（1，3，5-吡唑酮）溶液（0.5 mL 0.5 mol/L PMP和0.5 mL 0.3 mol/L NaOH等量均勻混合），充分溶解樣品后，每個(gè)樣品取100 μL溶液分別置于1.5 mL離心管中，于70 ℃水浴鍋衍生反應(yīng)30 min，冷卻后向每個(gè)管中加入50 μL 0.3 mol/L HCl，渦旋混勻2 s后加入50 μL UP水，渦旋混勻，再加入1 mL CHCl3（氯仿）渦旋混勻后萃取，吸去下層的CHCl3層，保留上層H2O層，按此步驟重復(fù)操作3遍[25?26]。

c. 9種單糖混合標(biāo)準(zhǔn)品處理 取9種單糖各50 μL加入1.5 mL離心管中渦旋混勻后加入50 μL 0.5 mol/L PMP和50 μL 0.3 mol/LNaOH（v/v=1:1），置于70 ℃水浴鍋中水浴30 min后加入50 μL 0.3 mol/L HCl和50 μL H2O，再加入1 mLCHCl3（氯仿）渦旋混勻后萃取，用注射器吸去下層的氯仿層，保留上層H2O層，按此步驟重復(fù)操作3遍。將保留下的水層經(jīng)0.22 μm水系濾膜過濾加進(jìn)進(jìn)樣瓶。

1.2.6.2 色譜條件 Bonshell C18plus（7.8 mmI.D.×30 cm）色譜柱，柱溫35 ℃，流動(dòng)相為82% 0.1 mol/L pH=7.0磷酸緩沖液（PBS）和18%乙腈（CH3CN），上樣時(shí)間為25 min，流速為0.5 mL/min，進(jìn)樣體積2 μL，在波長(zhǎng)為245 nm的紫外檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.7 蘭州肉蓯蓉多糖的體外抗氧化實(shí)驗(yàn) 將蘭州肉蓯蓉多糖配制成濃度為0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL的多糖溶液，測(cè)定其DPPH自由基清除率以及總抗氧化能力。多糖清除自由基測(cè)定參考Blois[27]和Wang[28]的方法，并作適當(dāng)修改。不同濃度的2 mL樣品溶液，加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH 95%乙醇溶液，混勻，在避光條件下室溫放置15 min，然后在轉(zhuǎn)速4000 r/min條件下離心15 min。用分光光度計(jì)測(cè)定在517 nm下的吸光值，以Vc作對(duì)照組?；旌弦旱奈庵蹬c其清除自由基能力呈負(fù)相關(guān)。DPPH自由基清除能力的計(jì)算公式如下：

式中，A0：2 mL DPPH溶液+2 mL 95%乙醇；Ai：2 mL DPPH溶液+2 mL樣品溶液；Aj：2 mL樣品溶液+2 mL 95%乙醇。

總抗氧化能力的測(cè)定采用總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒ABTS快速法進(jìn)行檢測(cè)，按其說明書進(jìn)行操作和計(jì)算。取10 mmol/LTrolox標(biāo)準(zhǔn)液用雙蒸餾水稀釋成濃度為：0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mmol/L的溶液進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作，96孔板的每個(gè)檢測(cè)孔里加入20 μL的過氧化物酶工作液，加入10 μL樣品或標(biāo)準(zhǔn)液，再加入170 μL的ABTS工作液，混勻后靜置6 min，采用酶標(biāo)儀在405 nm下進(jìn)行測(cè)定。所得總抗氧化能力標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=?1.9001X+2.1039（R2=0.9968），線性良好，其總抗氧化能力的計(jì)算公式如下：

式中，測(cè)定OD值：酶標(biāo)儀上測(cè)定的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次重復(fù)，數(shù)據(jù)由三組平行實(shí)驗(yàn)完成，所得數(shù)據(jù)由SPSS Statistics 22計(jì)算，Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)表格繪制、OriginPro 8進(jìn)行繪圖處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘭州肉蓯蓉多糖組成分析

2.1.1 紫外光譜分析 蛋白質(zhì)中含有的酪氨酸和色氨酸對(duì)280 nm的紫外線有最大的吸收值[29]。根據(jù)圖1可以看出，CLP-1在280 nm處出現(xiàn)明顯吸收峰，證明其可能含有糖蛋白；CLP-2在260 nm以及280 nm處均沒有明顯峰，但其紫外吸收譜線較高，可能是其本身顏色較深的緣故，因此無法準(zhǔn)確判斷其是否有核酸和蛋白質(zhì)存在。

圖1 紫外可見全波長(zhǎng)掃描曲線圖Fig.1 UV-visible full spectrum scan

2.1.2 蘭州肉蓯蓉多糖基本成分分析 DEAE-纖維素陰離子交換色譜柱層析能夠分離多糖，主要是其可吸附離子型的物質(zhì)和雜質(zhì)于柱上，其中性糖則可順利流出，從而達(dá)到分離的目的[30]，通過改變洗脫液中的鹽濃度，可進(jìn)一步洗脫得到酸性多糖等。將水洗脫液濃縮干燥后得中性糖CLP-1 34.68 mg，經(jīng)NaCl溶液洗脫濃縮干燥后得酸性糖CLP-2 16.52 mg。

實(shí)驗(yàn)所得總糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=12.104 X +0.0373，R2= 0.9959；所得蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.0079X+0.0134，R2=0.9951；糖醛酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.0148X+0.0046，R2=0.9993。對(duì)分離前、后蘭州肉蓯蓉的基本成分進(jìn)行測(cè)定，其總糖、蛋白質(zhì)、糖醛酸含量所占比例如表1。DEAE-纖維素陰離子交換色譜柱對(duì)粗多糖更多的是起到了分離作用，由于總糖的測(cè)定以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，因此CLP-1和CLP-2中的總糖含量比多糖中真實(shí)值偏小，但能明顯看出CLP、CLP-1和CLP-2三者中的化學(xué)組成成分有一定的差異，其中，CLP-1中總糖和蛋白質(zhì)含量最高，CLP-2中糖醛酸含量最高，三者的總糖與糖醛酸含量差異性顯著（P＜0.05），CLP與CLP-2中蛋白質(zhì)含量差別并不大，證明鹽洗并未對(duì)CLP中的蛋白質(zhì)含量造成很大的影響。經(jīng)過DEAE-纖維素陰離子交換色譜柱后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中蛋白質(zhì)結(jié)果偏大，極大可能是形成了結(jié)合蛋白[31]。

表1 蘭州肉蓯蓉多糖的基本成分Table 1 Basic composition of polysaccharides from Cistanchelanzhouensis

2.1.3 蘭州肉蓯蓉多糖分子量 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的分子量（Mw）和出峰體積（Ve），柱子的外水體積Vo=6.049 mL，總體積Vt=13.234 mL，依據(jù)公式Kav=（Ve-Vo）/（Vt-Vo），得回歸方程Kav=?0.1897lgMw+1.039，R2=0.9926。CLP-1、CLP-2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，代入方程可得其Mw的值，進(jìn)一步計(jì)算得出其數(shù)均分子量Mn、重均分子量Mw和分散系數(shù)D，如表2所示，數(shù)均分子量和重均分子量是按不同的統(tǒng)計(jì)方法的平均數(shù)分子量來表征分子的大小，根據(jù)重均分子量和數(shù)均分子量可得到其分布寬度D，D值越大證明其分散程度越大。由表2可以看出CLP-1和CLP-2的分子量主要分布在0～10 kDa之間，因此其為不均一的小分子量多糖。采用HPGPC鑒定蘭州肉蓯蓉粗多糖經(jīng)DEAE-纖維素柱層析分離后的中性糖CLP-1和酸性糖CLP-2，2種蘭州肉蓯蓉多糖在洗脫時(shí)按分子量大小依次被洗脫，按出峰順序，其分子量大小如表2所示，且其HPGPC圖譜上均呈現(xiàn)5個(gè)以上洗脫峰，峰形寬窄不同并且不對(duì)稱，證明蘭州肉蓯蓉多糖具有不均一性，從而推斷出CLP-1和CLP-2均是由幾種多糖組成的混合物[32]。

圖2 CLP-1、CLP-2的HPGPC圖Fig.2 HPGPC of CLP-1 and CLP-2

表2 保留峰時(shí)間與分子量計(jì)算Table 2 retention peak time and molecular weight calculation

2.1.4 蘭州肉蓯蓉多糖中單糖組成成分分析 根據(jù)HPLC分析，9種單糖標(biāo)準(zhǔn)品、CLP-1和CLP-2的色譜峰及出峰時(shí)間如圖3所示，對(duì)比9種單糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間，得出CLP-1中較明顯的5種單糖及占比分別為：甘露糖2.78%、半乳糖醛酸4.07%、葡萄糖88.62%、半乳糖1.80%、阿拉伯糖2.39%；CLP-2中較明顯的4種單糖及占比分別為：鼠李糖5.79%、半乳糖醛酸7.78%、葡萄糖9.99%、半乳糖13.30%，且在12.58 min處出現(xiàn)的色譜峰介于木糖（12.33 min）和阿拉伯糖（12.65 min）中間，需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明其單糖的種類。整體來說，水解后的CLP-1和CLP-2中的單糖含量有很大差別。其中，CLP-1中葡萄糖相對(duì)含量高達(dá)88.62%，CLP-2中僅為9.99%。且CLP-2中鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖含量均為5%以上，色譜峰較明顯，且其半乳糖醛酸含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于CLP-1，進(jìn)一步證明分離所得CLP-2多糖為酸性多糖。

圖3 單糖組成HPLC圖Fig.3 HPLC of monosaccharide composition

2.2 蘭州肉蓯蓉多糖的抗氧化分析

2.2.1 DPPH自由基清除結(jié)果 DPPH法是一種靈敏、快速、簡(jiǎn)便的評(píng)價(jià)物質(zhì)抗氧化活性的方法[33]。由圖4可明顯看出，蘭州肉蓯蓉多糖清除DPPH自由基的能力整體弱于Vc，Vc對(duì)DPPH自由基的清除率為95.45%，CLP和CLP-1對(duì)DPPH自由基的清除率明顯高于CLP-2，在0.25～4.0 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，CLP、CLP-1對(duì)DPPH自由基的清除率先上升后平穩(wěn)，當(dāng)濃度達(dá)到2.0 mg/mL時(shí)，CLP-1對(duì)DPPH自由基的清除率為91.73%，濃度為1.0 mg/mL時(shí)，CLP對(duì)DPPH自由基的清除率為80.90%。CLP、CLP-1對(duì)DPPH自由基清除能力的IC50分別為0.438、0.383 mg/mL。

圖4 DPPH自由基清除率圖Fig.4 DPPH radical scavenging capacity

2.2.2 總抗氧化能力（ABTS法）實(shí)驗(yàn)結(jié)果 ABTS自由基呈通常呈綠色，但與抗氧化劑結(jié)合后被還原，顏色消失，在734 nm或405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度即可測(cè)定并計(jì)算出樣品的總抗氧化能力[34]。Trolox是一種VE的類似物，具有和VE相近的抗氧化能力，用作其它抗氧化物總抗氧化能力的參考。根據(jù)總抗氧化能力（ABTS法）試劑盒實(shí)驗(yàn)方法，Trolox濃度可作為樣品抗氧化能力的對(duì)比指標(biāo)。在0～4.0 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，CLP、CLP-1和CLP-2的總抗能力均處于上升趨勢(shì)，其中，CLP-1的總抗氧化能力的增加趨勢(shì)明顯高于CLP和CLP-2。雖然蘭州肉蓯蓉多糖的總抗氧化能力明顯低于Vc，總抗氧化能力較弱，但總體來說隨濃度增大，CLP、CLP-1、CLP-2的總抗氧化能力不斷增強(qiáng)，濃度越高總抗氧化能力越強(qiáng)（圖5）。

圖5 ABTS測(cè)定總抗氧化能力Fig.5 ABTS measure total antioxidant capacity

由DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)和總抗氧化能力實(shí)驗(yàn)得出，CLP、CLP-1和CLP-2均具備一定的抗氧化活性，尤其是在DPPH自由基清除方面，濃度為2.0 mg/mL的CLP-1的DPPH自由基清除率高達(dá)91.73%，同等濃度下，Vc的清除率為95.55%，其清除能力與Vc相近。

3 討論與結(jié)論

蘭州肉蓯蓉作為肉蓯蓉屬同屬植物，其形態(tài)、生理特征均與肉蓯蓉相似，但其有效成分又與其有所差別，能否代替肉蓯蓉入藥目前尚存在爭(zhēng)論。本文通過HPGPC法對(duì)蘭州肉蓯蓉多糖研究初步證明其多糖分子量主要分布在0～10 kDa之間，含多個(gè)洗脫峰，為不均一小分子量雜多糖，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果與郭元亨[35]在荒漠肉蓯蓉的分子量研究中較為相似。

經(jīng)HPLC測(cè)定后發(fā)現(xiàn)，蘭州肉蓯蓉中性糖CLP-1中含有大量的葡萄糖，而吳向美等[36]對(duì)肉蓯蓉中性多糖的研究中證明其由葡萄糖組成，CLP-2中有鼠李糖、葡萄糖、半乳糖等；吳波等[37]采用薄層層析法對(duì)野生肉蓯蓉分離純化后的多糖進(jìn)行研究也得出其含有鼠李糖、葡萄糖和半乳糖。因此證明蘭州肉蓯蓉分離純化后與肉蓯蓉具有相同的單糖組分。且本文實(shí)驗(yàn)得出其多糖中含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖，這與王鑫彤等[38]研究肉蓯蓉中單糖組成的結(jié)果一致，CLP-2中酸性糖成分半乳糖醛酸含量明顯高于CLP-1。楊婷等[39]實(shí)驗(yàn)表明管花肉蓯蓉藥渣中的多糖具有抗氧化活性，且濃度為0.04 mg/mL時(shí)其DPPH自由基清除率為59%，同濃度下Vc的清除率為89%，且滕立平等[40]實(shí)驗(yàn)得出管花肉蓯蓉粗多糖對(duì)DPPH自由基清除能力的IC50為0.079 mg/mL，而蘭州肉蓯蓉粗多糖對(duì)DPPH自由基清除能力的IC50為0.438 mg/mL。證明蘭州肉蓯蓉的抗氧化能力弱于管花肉蓯蓉。

本實(shí)驗(yàn)采用傳統(tǒng)水提醇沉法對(duì)蘭州肉蓯蓉進(jìn)行提取，通過DEAE-纖維素柱層析將蘭州肉蓯蓉粗多糖CLP進(jìn)行分級(jí)純化，得到中性糖CLP-1和酸性糖CLP-2。對(duì)3種多糖進(jìn)行總糖、蛋白質(zhì)、糖醛酸含量的測(cè)定和紫外光譜掃描，并進(jìn)行分子量、單糖組成的測(cè)定和抗氧化活性實(shí)驗(yàn)，可得出如下結(jié)論：CLP、CLP-1和CLP-2三者組成成分相似，但各自含量差別較大。DEAE-纖維素色譜柱更多地起到了分離作用和初步純化作用，純化效果不明顯。CLP-1和CLP-2均有多個(gè)洗脫峰，且分子量分布都在0～10 kDa之間，證明蘭州肉蓯蓉多糖為小分子量的雜多糖。對(duì)CLP1-1和CLP1-2進(jìn)行單糖組成測(cè)定，得出CLP-1中較明顯的單糖及占比為：甘露糖2.78%、半乳糖醛酸4.07%、葡萄糖88.62%、半乳糖1.80%、阿拉伯糖2.39%；CLP-2中為：鼠李糖5.79%、半乳糖醛酸7.78%、葡萄糖9.99%、半乳糖13.30%。根據(jù)抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，CLP1-1的抗氧化效果最好，其DPPH自由基清除的IC50為0.383 mg/mL，且同一濃度下總抗氧化能力高于CLP和CLP-2。

綜上可知，本文針對(duì)蘭州肉蓯蓉多糖的組成分析及抗氧化活性方面進(jìn)行了探索性研究，得到了科學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并且取得了明顯研究進(jìn)展，在目前文獻(xiàn)中尚未見有關(guān)蘭州肉蓯蓉多糖的相同報(bào)道，所得結(jié)果對(duì)于蘭州肉蓯蓉資源的深入開發(fā)利用具有一定參考價(jià)值，且蘭州肉蓯蓉作為重要的沙產(chǎn)業(yè)產(chǎn)品，其資源的開發(fā)利用能夠進(jìn)一步帶動(dòng)我國(guó)荒漠地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展，因此關(guān)于蘭州肉蓯蓉多糖的研究具有重要意義，有待進(jìn)一步深入研究。