曹夢(mèng)笛，周浩純，李 赫, ，張 健，章期博，劉新旗，劉 宇

（1.北京工商大學(xué), 食品與健康學(xué)院, 國家大豆加工產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心, 北京 100048；2.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院, 綜合檢測中心, 北京100123；3.北京協(xié)同創(chuàng)新研究院, 北京100094）

燕麥中營養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，含有大量可溶性膳食纖維、維生素、礦物質(zhì)及生物活性成分，蛋白質(zhì)含量約占20%，在糧食作物中最高且必需氨基酸含量高出其他糧食作物兩倍左右[1]。蕎麥中蛋白質(zhì)含量約占12%，蛋白質(zhì)成分優(yōu)質(zhì)且有獨(dú)特的氨基酸組成比，含有人體必需的8種氨基酸[2]。燕麥和蕎麥與其它谷物相比，蛋白質(zhì)含量較高且氨基酸種類豐富，因此，其營養(yǎng)價(jià)值引起了學(xué)者們的關(guān)注。

谷物肽是以谷物中的蛋白質(zhì)為原料，經(jīng)過蛋白酶酶解、食品加工或者微生物發(fā)酵等方法制備的具有特殊生理功能的生物活性肽，是谷物蛋白水解的中間產(chǎn)物，一般少于20個(gè)氨基酸，分子量＜5800 Da[3]。已有研究表明谷物肽具有抗氧化[4?5]、抗高血壓[6]、降血糖[7]，抗腫瘤[8]、抗炎及降低膽固醇[9]等生理活性。ACE在腎素-血管緊張素系統(tǒng)中通過催化血管緊張素-1轉(zhuǎn)化為血管緊張素-2，加強(qiáng)心肌收縮，引起血壓升高。因此，通過抑制體內(nèi)ACE來降低血管緊張素-2的濃度具有重要意義。Hernández-Ledesma等[10]研究表明，低分子量的ACE抑制肽具有強(qiáng)降血壓活性。谷物肽可作為ACE抑制劑，通過與ACE活性位點(diǎn)結(jié)合，發(fā)揮降血壓作用[11]?？寡趸钚员徽J(rèn)為是谷物肽的另一基本功能，體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)和DNA等生物分子造成不同程度的損害，從而導(dǎo)致多種疾病如：炎癥、心血管疾病和癌癥等[12?13]，因此研究具有抗氧化作用的天然谷物肽具有重要的意義。已有研究表明，低分子量生物活性肽可直接被人體腸道吸收，從而能更好的發(fā)揮生物活性[14]。

飲食中的谷物蛋白消化利用率低，特別是老年人和胃腸道疾病患者，通過消化谷物蛋白獲取營養(yǎng)能力較弱，提高谷物中蛋白質(zhì)營養(yǎng)的利用率成為谷物加工的關(guān)注點(diǎn)。固態(tài)發(fā)酵或液態(tài)酶解谷物蛋白是獲取谷物肽的普遍方式，半固態(tài)酶解蛋白工藝研究鮮有報(bào)道。半固態(tài)酶解谷物蛋白是以谷物面團(tuán)為底物，經(jīng)調(diào)制攪拌器捏合及控溫酶解等步驟，可得含多肽的酶解谷物粉。相對(duì)于液態(tài)酶解，半固態(tài)酶解后的谷物面團(tuán)更易烘干，有利于谷物、谷物蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)加工。

本實(shí)驗(yàn)以燕麥和蕎麥兩種谷物作為研究對(duì)象，以酶解產(chǎn)物中多肽含量、抗氧化活性和ACE抑制活性為指標(biāo)確定了半固態(tài)酶解最佳工藝參數(shù)，以研究酶解產(chǎn)物的抗氧化、降血壓作用，為谷物高值化加工和功能性食品配料領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

燕麥及蕎麥 均為市售商品；堿性蛋白酶（200 U/mg） 帝斯曼公司；中性蛋白酶（100 U/mg）丹尼斯克；凱氏定氮消化片 德國福斯公司；三吡啶基三嗪（tripyridyltriazine，TPTZ） 博奧拓達(dá)科技有限公司；谷胱甘肽、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸、馬尿酸上海源葉生物科技有限公司；血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶（ACE） 美國Sigma公司。其他試劑 均為AR級(jí)別。Milli-Q Integral 5純水儀 美國Millipore公司；KJELTEC 8000全自動(dòng)凱式定氮儀 丹麥FOSS公司；Cary 60 UV-Vis紫外-可見分光光度計(jì)美國Agilent科技有限公司；1260 Infinity高效液相色譜 美國Agilent科技有限公司；THZ-92B旋渦振蕩器 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；HH.S11-4電熱恒溫水浴鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；X-30R臺(tái)式高速離心機(jī) 美國Beckman公司；cientic EASY-nLC 1000 System（Nano HPLC）高效液相色譜 美國Thermo公司；NH 1500L調(diào)制攪拌器 山東旺林機(jī)械有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 兩種谷物粉半固態(tài)酶解工藝的優(yōu)化 燕麥及蕎麥分別經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過200目篩；在調(diào)質(zhì)攪拌器內(nèi)加水和堿性蛋白酶與中性蛋白酶以2:1的比例配制的復(fù)合酶，捏合形成谷物面團(tuán)，50 ℃控溫酶解；酶解結(jié)束后，將酶解面胚放入隧道爐中（溫度80 ℃）進(jìn)行烘干；最后，用粉碎機(jī)對(duì)其進(jìn)行粉碎得到含多肽的半固態(tài)酶解谷物粉并過200目篩。在半固態(tài)酶解過程中，復(fù)合酶添加量分別為1.25%、2.50%和3.75%，酶解時(shí)間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5及4.0 h。

1.2.2 半固態(tài)酶解產(chǎn)物肽含量的測定

1.2.2.1 半固態(tài)酶解物中多肽液的提取與純化 稱取酶解后谷物粉5.000 g，溶于125 mL蒸餾水中，在氣浴恒溫振蕩器中37 ℃恒溫振蕩30 min；將振蕩后的谷物粉溶液在4000 r/min，25 ℃恒溫離心30 min并收集上清液；將第1次離心所得沉淀添加125 mL蒸餾水進(jìn)行二次浸提，將兩次離心所得上清液混合并經(jīng)MD34-5M（300 Da）膜過濾提純，可得多肽提取液，測其多肽含量及抗氧化和ACE抑制活性。

1.2.2.2 多肽含量的測定 參考GB/T 6432-2018[15]并加以改進(jìn)。稱取20.000 g多肽提取液用22.5%三氯乙酸溶液定容至50 mL，搖勻后靜置10 min，使用中速濾紙過濾以除去提取液中的谷物蛋白。取10 mL濾液至消化管，加入12 mL濃硫酸及兩片消化片，于消化器中180 ℃消化30 min除去樣品中的水分，再調(diào)至420 ℃消化60 min。消化結(jié)束后冷卻至室溫并用凱氏定氮儀檢測樣品中的氮含量，通過公式1計(jì)算可得多肽含量。

式中：M為每100 g谷物粉中的多肽含量（g/100 g）；ω為提取液中的多肽含量（mg/mL）；m1為兩次提取所得上清液總質(zhì)量（g）；m2為兩次提取所得離心液總質(zhì)量（g）；K為蛋白轉(zhuǎn)化系數(shù)（燕麥為5.83，蕎麥為6.25）。

1.2.3 兩種谷物粉液態(tài)酶解工藝方法 參考文獻(xiàn)[16?18]并略作修改。將谷物粉200目過篩，加水配制成蛋白含量為8%的溶液，用1 mol/L NaOH及1 mol/L HCl調(diào)pH至7.0，加入復(fù)合蛋白酶，50 ℃恒溫酶解4 h，在整個(gè)酶解過程中對(duì)酶解液進(jìn)行恒速攪拌，酶解完成后，將溫度升至85 ℃滅酶10 min。液態(tài)酶解液在4000 r/min，25 ℃恒溫離心30 min，收集上清液。

1.2.4 酶解方式對(duì)酶解產(chǎn)物肽的蛋白轉(zhuǎn)化率的影響肽的蛋白轉(zhuǎn)化率是一定質(zhì)量谷物粉中多肽含量與蛋白質(zhì)含量的比值。在酶添加量為3.75%，酶解時(shí)間為3 h的酶解條件下用液態(tài)酶解和半固態(tài)酶解的方式酶解燕麥粉，在酶添加量為1.25%，酶解時(shí)間為1 h的條件下酶解蕎麥粉，通過測定蛋白轉(zhuǎn)化率比較兩種酶解方式對(duì)谷物蛋白酶解效果的差異。

1.2.5 酶解產(chǎn)物分子量分布測定 參考GB/T 22492-2008的方法并加以改進(jìn)[19]。燕麥在酶解時(shí)間為3 h，蕎麥酶解時(shí)間為1 h的條件下，研究酶添加量及酶解方式對(duì)酶解產(chǎn)物分子量分布的影響。將標(biāo)準(zhǔn)品配制成1 mg/mL的溶液，樣品和標(biāo)品均需過0.22 μm微濾膜，隨后在HPLC-DAD系統(tǒng)中過TSKgelG2000swxL 300 mm×7.8 mm色譜柱進(jìn)行檢測分析。流動(dòng)相為乙腈:水:三氟乙酸=45:5:0.1，進(jìn)樣體積為10 μL，流速為30 mL/h，檢測波長為220 nm。用峰面積歸一法可計(jì)算到不同肽段相對(duì)分子質(zhì)量的分布情況，按式2進(jìn)行計(jì)算：

式中：X為試樣中某相對(duì)分子質(zhì)量肽段所占總肽段的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；A為某相對(duì)分子質(zhì)量肽段的峰面積；A總為各相對(duì)分子質(zhì)量肽段的峰面積之和。

1.2.6 酶解產(chǎn)物中多肽抗氧化活性測定

1.2.6.1 總抗氧化能力（FRAP法）測定方法 參考文獻(xiàn)[18]并略作修改。燕麥在酶解時(shí)間為3 h，蕎麥酶解時(shí)間為1 h的條件下，研究酶添加量及酶解方式對(duì)酶解產(chǎn)物總抗氧化能力的影響。配制0.3 mol/L pH=3.6醋酸緩沖液、20 mmol/L FeCl3溶液以及10 mmol/L TPTZ溶液，并以10:1:1的比例混合。配制不同濃度（0.2、0.5、1.0、1.5、1.8、2.0 mmol/L）的FeSO4·7H2O標(biāo)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取30 μL樣品溶液加入4 mL FRAP試劑，加1 mL水，充分混合并于37 ℃靜置15 min，在593 nm波長測其吸光度。以谷胱甘肽做參照，圖4樣品多肽濃度及谷胱甘肽濃度均為1 mg/mL。

1.2.6.2 羥自由基清除能力測定方法 參考文獻(xiàn)[20]并略作修改。燕麥在酶解時(shí)間為3 h，蕎麥酶解時(shí)間為1 h的條件下，研究酶添加量及酶解方式對(duì)酶解產(chǎn)物羥自由基清除能力的影響。取0.5 mL樣品溶液依次加入1 mL 6mmol/L FeSO4、1 mL 6mmol/L H2O2混勻，靜置10 min；加入1 mL 6 mmol/L水楊酸混勻靜置30 min，510 nm波長下測吸光度即A1。按式3計(jì)算谷物肽羥自由基清除率：

式中：Ac為空白組，使用蒸餾水替代樣品；A1為樣品組，加入標(biāo)品或者樣品的吸光度。

1.2.7 酶解產(chǎn)物中多肽ACE抑制活性測定 參考Boschin等[21]和Wu等[22]的方法加以改進(jìn)。燕麥在酶解時(shí)間為3 h，蕎麥酶解時(shí)間為1 h的條件下，研究酶添加量及酶解方式對(duì)酶解產(chǎn)物ACE抑制能力的影響。配制緩沖液一（100 mmol/L Tris-HCOOH，300 mmol/L NaCl，pH=8.3），緩沖液二（100 mmol/L Tris-HCOOH，300 nmol/L NaCl，10 mol/L ZnCl2，pH=8.3），配制1 mmol/L HHL溶液，1 mU ACE 溶液。取100 μL HHL加入1.5 mL離心管中，加入10 μL樣品，37℃水浴反應(yīng)15 min；預(yù)反應(yīng)結(jié)束后加入15 μL ACE溶液反應(yīng)1 h后加125 μL 0.1 mol/L HCl中斷反應(yīng)。樣品過0.22 μm水相膜，濾液備進(jìn)樣用。儀器自動(dòng)進(jìn)樣后，可根據(jù)馬尿酸標(biāo)品出峰時(shí)間以及峰面積確定馬尿酸的生成量，計(jì)算樣品的ACE抑制活性大小，同時(shí)做空白對(duì)照。圖6樣品多肽濃度為1 mg/mL。按式4計(jì)算谷物肽ACE抑制率：

式中：Ac為不加抑制劑，用緩沖液一代替樣品測得的峰面積；AN為不加ACE，用緩沖液二代替ACE酶測得的峰面積；As為樣品組測得的峰面積。

色譜條件：HPLC 系統(tǒng)：HPLC-DAD；色譜柱：Eclipse Plus C18分 析用色譜 柱（5 μm，4.6 mm×150 mm）；流速：30 mL/h；檢測波長：228 nm；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：水:乙腈=80:20。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 谷物粉半固態(tài)酶解參數(shù)對(duì)酶解產(chǎn)物肽含量的影響

本課題選用堿性蛋白酶與中性蛋白酶以2:1的比例配制的復(fù)合酶。復(fù)合酶比單一酶有更多的酶切位點(diǎn)，可更充分地水解谷物蛋白，且堿性蛋白酶和中性蛋白酶酶切位點(diǎn)為疏水性氨基酸和芳香族氨基酸，對(duì)多肽的抗氧化及ACE抑制活性均有積極影響。

為避免不同樣品中蛋白含量差異的影響，試驗(yàn)中酶添加量為加酶量與谷物粉中蛋白質(zhì)含量之比。由圖1可得，相比酶添加量為1.25%及2.50%組，燕麥粉中酶添加量為3.75%時(shí)，所得多肽含量較高且在酶解時(shí)間為3 h達(dá)到最高，隨著酶解時(shí)間增加，多肽含量增加不顯著（P＞0.05）。酶解時(shí)間0～1.0 h時(shí)，蕎麥粉中多肽含量迅速上升，且當(dāng)酶解時(shí)間為1 h，酶添加量為1.25%、2.50%、3.75%時(shí)酶解所得多肽含量無顯著差異（P＞0.05），繼續(xù)延長酶解時(shí)間蕎麥粉中肽含量呈平衡趨勢(shì)，當(dāng)?shù)鞍酌高_(dá)到一定量時(shí)，暴露的谷物蛋白質(zhì)基本達(dá)到完全水解，加大添加量并不會(huì)對(duì)多肽含量產(chǎn)生明顯影響[23]。綜上可得，以酶解產(chǎn)物中多肽含量為標(biāo)準(zhǔn)，燕麥最佳半固態(tài)酶解條件為：酶解時(shí)間3 h，酶添加量3.75%；蕎麥為：酶解時(shí)間1 h，酶添加量1.25%。林洋等[24]以豆粕為原料，設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)確定復(fù)合酶的組成，結(jié)果表明在堿性蛋白酶:中性蛋白酶=2:1、溫度45 ℃、時(shí)間4.5 h酶解條件下大豆蛋白酶解效果最好。

圖1 半固態(tài)酶解工藝參數(shù)對(duì)（A）燕麥和（B）蕎麥酶解產(chǎn)物肽含量的影響Fig.1 Effect of semi-solid enzymatic hydrolysis process parameters on peptide content of (A) oat and (B) buckwheat enzymatic hydrolysis products

2.2 酶解方式對(duì)酶解產(chǎn)物肽的蛋白轉(zhuǎn)化率的影響

液態(tài)酶解是提高谷物蛋白轉(zhuǎn)化率的主要方式，實(shí)驗(yàn)對(duì)半固態(tài)酶解能否獲得相同的蛋白轉(zhuǎn)化率進(jìn)行了探討，分析半固態(tài)酶解工藝的可行性。由圖2（A）和（B）可得燕麥和蕎麥的半固態(tài)酶解蛋白轉(zhuǎn)化率顯著高于（P＜0.05）液態(tài)酶解。半固態(tài)酶解底物中的部分蛋白被淀粉包裹，復(fù)合酶會(huì)集中酶解裸露出的谷物蛋白，相比液態(tài)酶解，不僅半固態(tài)酶解底物濃度相對(duì)較高，而且調(diào)制攪拌器多方向不斷捏合酶解谷物面團(tuán)，也能夠促進(jìn)酶與底物蛋白接觸。相同酶添加量時(shí)，半固態(tài)酶解顯示出更高的蛋白轉(zhuǎn)化率。

圖2 酶解方式對(duì)（A）燕麥和（B）蕎麥的蛋白轉(zhuǎn)化率的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis on the protein conversion rate of (A) oat and (B) buckwheat

2.3 酶解產(chǎn)物分子量分布的測定

谷物蛋白酶解產(chǎn)物功能活性不僅與其濃度有關(guān)，還受分子量大小的影響，已有研究表明具有2～10個(gè)氨基酸組成的低分子量肽生物活性較強(qiáng)，且其更容易穿過腸屏障發(fā)揮生理作用[25]。表1在最佳酶解時(shí)間條件下研究復(fù)合酶添加量對(duì)多肽分子量分布的影響，可得：酶解時(shí)間為3 h，燕麥半固態(tài)酶解產(chǎn)物中分子量＜1000 Da的低分子量肽多肽占比約95%；酶解時(shí)間為1 h，蕎麥酶解產(chǎn)物中分子量＜1000 Da的低分子量肽多肽占比大于85%，可得燕麥與蕎麥中的蛋白經(jīng)半固態(tài)酶解均可得到較多的低分子量肽。燕麥酶添加量為3.75%的條件下多肽含量最高（圖1A），且與酶添加量為1.25%組相比，酶解產(chǎn)物中＜1000 Da低分子量肽占比也明顯提高；蕎麥在酶解時(shí)間為1 h，酶添加量為1.25%時(shí)多肽含量較高（圖1B），但酶解產(chǎn)物中＜1000 Da低分子量肽占比低于酶添加量為2.50%及3.75%組。這是由于半固態(tài)酶解底物中的部分蛋白被淀粉包裹，復(fù)合酶會(huì)集中酶解裸露出的谷物蛋白，隨著酶添加量的增多，酶切位點(diǎn)水解越完全，低分子量肽占比更大。

表1 半固態(tài)酶解酶添加量對(duì)酶解產(chǎn)物分子量的影響Table 1 Effect of the amount of semi-solid enzymatic hydrolysate on molecular weight of polypeptide in hydrolysate

通過液態(tài)酶解和半固態(tài)酶解的方式，在酶解時(shí)間為3 h，酶添加量為3.75%的條件下酶解燕麥粉，在酶解時(shí)間為1 h，酶添加量為1.25%的條件下酶解蕎麥粉。由表2可得，燕麥和蕎麥液態(tài)酶解產(chǎn)物中分子量＜1000 Da的多肽占比分別為66.0%和76.3%，遠(yuǎn)低于半固態(tài)酶解產(chǎn)物的94.9%和86.0%。在半固態(tài)酶解反應(yīng)體系中，復(fù)合酶集中酶解暴露出的谷物蛋白，從而生成較多低分子量的肽。因此，相對(duì)于液態(tài)酶解，燕麥在酶解時(shí)間為3 h，酶添加量為3.75%酶解條件下，蕎麥在酶解時(shí)間1 h，酶添加量為1.25%酶解條件下，半固態(tài)酶解谷物蛋白不僅所得多肽含量高，而且酶解產(chǎn)物中＜1000 Da的低分子量肽占比更高。

表2 酶解方式對(duì)谷物蛋白酶解產(chǎn)物分子量的影響Table 2 Effect of enzymatic hydrolysis on molecular weight of semi-solid enzymatic hydrolysates of grain protein

2.4 酶解產(chǎn)物中多肽抗氧化活性的比較

由圖3可得，燕麥經(jīng)半固態(tài)酶解所得多肽的總抗氧化能力及羥自由基清除能力均顯著高于谷物原料且均隨著酶添加量的增多而增強(qiáng)，蕎麥酶添加量為2.50%組抗氧化活性顯著高于酶添加量為1.25%組（P＜0.05）且與及3.75%組無顯著差異（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)選用的復(fù)合酶由堿性蛋白酶和中性蛋白酶復(fù)配而成，其酶切位點(diǎn)包括羧基側(cè)是芳香族或疏水性氨基酸構(gòu)成的肽鍵及氨基側(cè)是疏水性氨基酸構(gòu)成的肽鍵。已有研究表明芳香族氨基酸殘基易向缺電子基團(tuán)提供質(zhì)子，從而提高氨基酸殘基的自由基清除能力，疏水氨基酸殘基如Val或Leu可以促進(jìn)多肽清除自由基[26]。因此，半固態(tài)酶解所得多肽越多，即可暴露更多抗氧化氨基酸殘基，蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化活性可能越強(qiáng)。燕麥在酶解時(shí)間為3 h時(shí)（圖1A），隨著酶添加量的增加，所得多肽濃度增加，對(duì)其抗氧化能力有顯著增強(qiáng)作用（P＜0.05）。由此可得，燕麥在酶解時(shí)間為3 h，酶添加量為3.75%條件下，半固態(tài)酶解所得燕麥肽含量最高且抗氧化活性最強(qiáng)。

圖3 半固態(tài)酶解酶添加量對(duì)酶解產(chǎn)物中多肽抗氧化活性的影響Fig.3 Effect of the amount of enzyme added in semi-solid enzymatic hydrolysis on antioxidant activity of polypeptides in enzymatic hydrolysates

蕎麥在酶解時(shí)間為1 h時(shí)（圖1B），酶添加量為1.25%組與2.50%和3.75%組所得谷物肽的含量無顯著差異（P＞0.05），酶添加量為2.50%組及3.75%組在酶解產(chǎn)物肽的分子量分布上較為相似（表1），相應(yīng)的酶解產(chǎn)物肽在總抗氧化能力及羥自由基清除能力上均未有顯著差異（P＞0.05）。酶添加量為1.25%組酶解產(chǎn)物肽的分子量分布的低分子量占比低于另外兩組（表1），其抗氧化能力及羥自由基清除能力均顯著低于另外兩組（P＜0.05）。因此，蕎麥在酶解時(shí)間為1 h，酶添加量為2.50%或3.75%條件下，半固態(tài)酶解所得蕎麥肽含量較高且抗氧化活性較強(qiáng)。

多肽的抗氧化活性還與其氨基酸組成有關(guān)，氨基酸是肽的基本組分，它們的類型、含量和序列對(duì)肽的抗氧化活性具有很大的影響[27]。相同濃度肽含量時(shí)低分子量肽占比較高其抗氧化活性更強(qiáng)。Herrera Chalé等[28]研究了黧豆蛋白酶解產(chǎn)物中不同肽級(jí)分的抗氧化能力，得出分子量最小的肽級(jí)分，即＜1000 Da的肽級(jí)分抗氧化能力最強(qiáng)。

由圖4可得，在多肽質(zhì)量濃度均為1 mg/mL時(shí)，燕麥和蕎麥半固態(tài)酶解所得多肽的總抗氧化能力和羥自由基清除能力均顯著高于液態(tài)酶解組（P＜0.05），結(jié)合表2分子量分布實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得：分子量是影響谷物肽抗氧化活性的重要因素，低分子量肽的抗氧化活性更強(qiáng)。半固態(tài)酶解產(chǎn)物中，＜1000 Da的低分子量肽占比遠(yuǎn)大于液態(tài)酶解，所以半固態(tài)酶解所得多肽抗氧化活性顯著高于相同質(zhì)量濃度液態(tài)酶解所得多肽。

圖4 酶解方式對(duì)酶解產(chǎn)物中多肽抗氧化活性的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis process on the antioxidant activity of polypeptides in hydrolysis products

2.5 酶解產(chǎn)物中多肽ACE抑制活性的比較

比較相同質(zhì)量谷物粉經(jīng)半固態(tài)酶解后所得多肽的ACE抑制能力。結(jié)果由圖5所示，燕麥和蕎麥原料經(jīng)半固態(tài)酶解后ACE抑制活性顯著提高（P＜0.05）。燕麥隨著酶添加量的增多酶解產(chǎn)物中多肽含量增高（圖1A），則其ACE抑制活性增強(qiáng)。Asoodeh[29]等人的研究表明，ACE的C末端是疏水環(huán)境，ACE抑制肽采用阻止底物與ACE活性位點(diǎn)相結(jié)合降低其催化活性，ACE抑制肽通常在N-或C-末端位置含有疏水性氨基酸殘基。本實(shí)驗(yàn)選用堿性蛋白酶及中性蛋白酶復(fù)配的復(fù)合酶，因此，半固態(tài)酶解所得多肽越多，即可暴露更多疏水性氨基酸殘基，蛋白酶解產(chǎn)物ACE活性更可能越強(qiáng)。

由圖5可得，蕎麥在酶添加量為2.50%及3.75%組，酶解所得多肽ACE抑制活性無顯著差異（P＞0.05），但均顯著高于酶添加量1.25%組（P＜0.05）。Anne等[30]研究表明，低分子量的肽更容易接近ACE的活性位點(diǎn)，所以＜1000 Da的肽具有更高的ACE抑制活性。蕎麥酶添加量為1.25%組酶解產(chǎn)物中低分子量肽占比低于另外兩組（表1），相應(yīng)的酶解產(chǎn)物肽的ACE抑制能力低于另外兩組。

圖5 半固態(tài)酶解酶添加量對(duì)酶解產(chǎn)物中多肽ACE抑制效果的影響Fig.5 Effect of the amount of enzyme added in semi-solid enzymatic hydrolysis on ACE inhibition of polypeptides in Hydrolysates

因此，結(jié)合半固態(tài)酶解產(chǎn)物中谷物肽含量及其ACE抑制活性分析可得燕麥在酶解時(shí)間為3 h，酶添加量為3.75%，蕎麥在酶解時(shí)間為1 h，酶添加量為2.50%或3.75%條件下酶解效果最好。

在多肽質(zhì)量濃度均為1 mg/mL條件下，比較燕麥、蕎麥分別經(jīng)半固態(tài)、液態(tài)酶解后所得多肽的ACE抑制活性差異，研究酶解方式對(duì)多肽ACE抑制能力的影響。由圖6可得燕麥和蕎麥半固態(tài)酶解產(chǎn)物中多肽的ACE抑制活性顯著高于液態(tài)酶解組（P＜0.05）。燕麥和蕎麥半固態(tài)酶解所得＜1000 Da的低分子量肽占比高于液態(tài)酶解（表2），所以半固態(tài)酶解所得多肽的ACE抑制活性比液態(tài)酶解更強(qiáng)。

圖6 酶解方式對(duì)酶解產(chǎn)物中多肽ACE抑制效果的影響Fig.6 Effect of enzymatic hydrolysis process on the inhibitory activity of ACE of polypeptides in hydrolysis products

Herrera Chalé[28]等用超濾膜將虎爪豆蛋白酶解產(chǎn)物分離成＞10000，5000～10000，3000～5000，1000～3000，＜1000 Da的不同組分，比較它們的抗氧化及ACE抑制活性，結(jié)果表明各組分均有一定的抗氧化及ACE抑制活性且＜1000 Da的低分子量肽活性最強(qiáng)。多肽序列中的疏水性氨基酸和芳香族氨基酸有助于增強(qiáng)其抗氧化活性；芳香族氨基酸占比高的多肽，尤其是羧基末端是芳香族氨基酸的三肽，ACE抑制活性較強(qiáng)，疏水性氨基酸更易與ACE活性位點(diǎn)結(jié)合從而抑制其活性[31?33]，從而達(dá)到實(shí)現(xiàn)降低血壓。實(shí)驗(yàn)選用復(fù)合酶由堿性蛋白酶和中性蛋白酶復(fù)配而成，識(shí)別位點(diǎn)為疏水性氨基酸及芳香族氨基酸，隨著酶解反應(yīng)的進(jìn)行，暴露出更多的疏水性及芳香族氨基酸殘基，從而增強(qiáng)酶解所得谷物肽的抗氧化及ACE抑制活性。

3 結(jié)論

本文以燕麥及蕎麥為原料，通過新型半固態(tài)酶解工藝得到具有生物活性的酶解產(chǎn)物，以酶解產(chǎn)物中多肽含量為指標(biāo)進(jìn)行了酶解時(shí)間和復(fù)合蛋白酶酶添加量的實(shí)驗(yàn)，結(jié)合酶解產(chǎn)物抗氧化、ACE抑制活性以及酶解效率可得燕麥、蕎麥最佳半固態(tài)酶解工藝參數(shù)分別為：燕麥酶解時(shí)間3 h，酶添加量3.75%；蕎麥酶解時(shí)間1 h，酶添加量2.50%。對(duì)比液體酶解工藝，半固態(tài)酶解工藝的酶解產(chǎn)物中低分子量肽占比較高，且其抗氧化活性、ACE抑制活性均顯著高于相同條件下液態(tài)酶解所得谷物肽（P＜0.05）。綜上說明谷物蛋白半固態(tài)酶解工藝具有更佳效果，半固態(tài)酶解工藝應(yīng)用于谷物高值化加工具有可行性。