馬治國(guó)，劉相岑，袁辰陽(yáng)，杜桂林，鈕 冰 ，張保國(guó), ，史吉平

（1.上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 上海200444；2.中國(guó)科學(xué)院上海高等研究院, 上海201210；3.上?？萍即髮W(xué), 上海201210）

甾體藥物廣泛應(yīng)用于各類疾病治療和健康保健等，如消炎、抗菌、抗腫瘤等[1]，全球每年市場(chǎng)總銷售額超過(guò)100億美元[2?3]，是除了抗生素外的第二大類藥物。22-羥基-23,24-雙降甾-1,4-二烯-3-酮（HPD）作為植物甾醇的側(cè)鏈不完全降解產(chǎn)物，可以作為重要的甾體藥物中間體[4]，而植物甾醇主要來(lái)源于食品中，所有植物性的食物中都包含植物甾醇，它對(duì)人體健康很有好處，食品中植物甾醇攝入量越高，人們患心臟病和其他慢性疾病的危險(xiǎn)相對(duì)越低，此外它還有降低膽固醇、抗癌等功效，植物甾醇以及植物甾醇的某些中間代謝產(chǎn)物也可以應(yīng)用在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域[5]，如用于油脂、面包主食、食物色拉和可口可樂(lè)等，利用HPD可以合成1-脫氫孕酮等孕激素、氫化可的松、地塞米松等皮質(zhì)類激素[6?9]，可以緩解類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[10]等癥狀。傳統(tǒng)孕激素和皮質(zhì)類激素以化學(xué)合成法合成，但是化學(xué)合成法存在很多問(wèn)題，嚴(yán)重限制了甾體藥物在藥學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展[11?12]，隨著甾體藥物市場(chǎng)需求不斷擴(kuò)大,利用微生物轉(zhuǎn)化植物甾醇來(lái)生產(chǎn)重要的甾體藥物中間體受到了越來(lái)越多的關(guān)注[13]。

3-甾酮-Δ1脫氫酶（KstD）是微生物轉(zhuǎn)化植物甾醇過(guò)程中一個(gè)關(guān)鍵酶[14]，能夠催化22-羥基-23,24-雙降甾-4-烯-3-酮（4-HP）的A環(huán)C1,2脫氫形成雙鍵而制得HPD[15]，比如皮質(zhì)醇和可的松的1號(hào)位脫氫衍生物比其本身可表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗風(fēng)濕和抗過(guò)敏活性[16]。KstD不但可以催化4-HP上A環(huán)C1,2脫氫形成HPD，并且在植物甾醇代謝和其他甾體藥物合成中也起著重要的作用[17?18]，Zhang等[19]在大腸桿菌異源表達(dá)KstD基因，直接將4-HP轉(zhuǎn)化成HPD。但是以4-HP為底物通過(guò)酶法轉(zhuǎn)化合成HPD的工藝，由于底物成本較高、酶催化工藝復(fù)雜[20?22]，所以該路線并不適合工業(yè)化生產(chǎn)；Xu等[23]通過(guò)基因編輯改造獲得了能轉(zhuǎn)化植物甾醇產(chǎn)HPD的菌株，但摩爾產(chǎn)率較低，同時(shí)含有4-HP、ADD等副產(chǎn)物，需要進(jìn)一步提高產(chǎn)量。而通過(guò)對(duì)菌株改造以植物甾醇為底物直接得到HPD，工藝簡(jiǎn)單且成本很低，極具工業(yè)化生產(chǎn)的潛力，如何獲得可以直接轉(zhuǎn)化植物甾醇生產(chǎn)HPD的優(yōu)良菌株，目前成為HPD產(chǎn)業(yè)化過(guò)程中研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

為了提高HPD的產(chǎn)量，在一株基因突變菌株Mycobacterium neoaurumDSM 1381[24]中過(guò)表達(dá)KstD基因構(gòu)建一株3-甾酮-Δ1脫氫酶過(guò)表達(dá)的菌株；再通過(guò)單因素篩選和響應(yīng)面試驗(yàn)來(lái)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)一步提高生產(chǎn)HPD的能力，實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)HPD工藝的優(yōu)化和產(chǎn)量的提升。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新金分枝桿菌Mycobacterium neoaurumDSM 1381（DSM 1381）、大 腸 桿 菌Escherichia coliDH5α、整合表達(dá)質(zhì)粒pMV306-Psmyc實(shí)驗(yàn)室?80 ℃保藏；Phanta Max Master Mix、限制性內(nèi)切酶EcoRI和SaIl TaKaRa公司；吐溫?80、卡那霉素上海麥克林有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、4-HP、HPD標(biāo)品 Axygen公司；玉米漿 山東佳達(dá)生物飼料有限公司；植物甾醇 云南生物制品有限公司；乙酸乙酯、正己烷等 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏等 上海生工生物工程有限公司。

BSA 224S-CW型電子天平、PB-10型pH計(jì)德國(guó)Sartorius；LC-2010型高效液相色譜儀 日本島津公司；HWS-12型恒溫水浴鍋 上海一恒公司；Centrifuge5430低溫離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；EPS300型電泳儀 上海天能有限公司；DU730型紫外分光光度計(jì) 德國(guó)BecKman；MLS-3780型高壓蒸汽滅菌鍋 日本三洋；S1000TM型PCR儀 美國(guó)Thermal BIO-RAD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基及植物甾醇母液配制 LB培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，pH7.0，115 ℃，滅菌30 min；種子培養(yǎng)基：NH4NO315 g/L，Glu 10 g/L，K2HPO41.0 g/L，NaNO32.0 g/L，吐溫?80 2 g/L，pH7.5～8.0，115 ℃，滅菌30 min；初始培養(yǎng)基：（NH4）2SO410 g/L，Glu 10 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，K2HPO41.0g/L，吐溫?80 2 g/L，植物甾醇5 g/L，pH7.5-8.0，115 ℃，滅菌30 min；植物甾醇母液：稱取5 g的植物甾醇，加入1 g吐溫?80和20 g羥丙基-β-環(huán)糊精，用水定容至100 mL配成50 g/L，攪拌60 min，200 W超聲溶解20 min，115 ℃，滅菌30 min備用。

1.2.2 過(guò)表達(dá)整合質(zhì)粒pMV306-Psmyc-KstD的構(gòu)建 以實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建pMV306-Psmyc質(zhì)粒為模板；然后根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室測(cè)序得到的DSM 1381基因組上的KstD1基因序列為模板設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物KstD1-F/R（tatgggatccgaattcGTGTTCTACATGACTGCCCA/ta gttaactacgtcgacTCAGGCCTTTCCAGCGAGAT）擴(kuò)增KstD1基因，將它同源重組到pMV306-Psmyc整合質(zhì)粒的EcoRI和SalI位點(diǎn)之間，構(gòu)建過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pMV306-Psmyc-KstD，過(guò)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建方法如圖1所示，然后用pMV306質(zhì)粒上的位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并送上海杰李測(cè)序公司測(cè)序驗(yàn)證。

圖1 質(zhì)粒pMV306-Psmyc-KstD的構(gòu)建過(guò)程[25]Fig.1 Construction of plasmid pMV306-Psmyc-KstD[25]

1.2.3 新金分枝桿菌電轉(zhuǎn)及陽(yáng)性菌株篩選 將構(gòu)建好的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pMV306-Psmyc-KstD電入新金分枝桿菌的感受態(tài)中[26]，涂入含50 μg/mL的卡那霉素抗性的LB平板上，3～4 d后挑取單克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證，PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃，5 min，95 ℃，30 s，58 ℃，30 s，72 ℃，1 kb/min，35循環(huán)；72 ℃，5 min，16 ℃，5 min，PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)測(cè)序得到陽(yáng)性菌株即構(gòu)建的菌株。

1.2.4 重組菌株生長(zhǎng)曲線 將重組菌株單克隆劃線于固體LB培養(yǎng)基，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d后挑取單克隆接種于10 mL種子培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期（約60 h），得到液體菌種，然后以1:10體積的接種量接入50 mL種子培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min恒溫箱振蕩培養(yǎng)，每過(guò)4 h取樣檢測(cè)菌液的吸光度值OD600，然后以培養(yǎng)時(shí)間h為橫坐標(biāo)，吸光度值OD600為縱坐標(biāo)繪制菌株的生長(zhǎng)曲線，每組做三個(gè)平行。

1.2.5 菌株培養(yǎng)和植物甾醇轉(zhuǎn)化條件過(guò)表達(dá) 菌和野生菌株液體種子培養(yǎng)方法如1.2.4，發(fā)酵培養(yǎng)基中接入10%體積的液體菌種；放置30 ℃、200 r/min恒溫振蕩箱培養(yǎng)120 h時(shí)取樣檢測(cè)產(chǎn)物。

1.2.6 產(chǎn)物檢測(cè)方法 具有共軛結(jié)構(gòu)的甾體化合物4-HP和HPD在UV254 nm下有吸收值可以利用高效液相色譜檢測(cè)，然后比對(duì)標(biāo)品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以測(cè)定產(chǎn)物的相對(duì)含量[27?29]，

HPD的標(biāo)準(zhǔn)曲線y=56.237X?0.139，R2=0.99914，4-HP的標(biāo)準(zhǔn)曲線y=44.398X?0.101,R2=0.99412，具有極好的線性關(guān)系。

高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)條件[30]：采用C18反相層析柱（Agilent XDB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇80%:水20%（V/V），流速0.8 mL/min；進(jìn)樣體積為20 μL；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

1.2.7 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

1.2.7.1 有機(jī)氮源的選擇 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)[31?32]選擇玉米漿為有機(jī)氮源，HPD的產(chǎn)量作為指標(biāo)，設(shè)置1、5、10、15、20、25 g/L的濃度梯度，其他條件都保持不變，篩選出最優(yōu)的玉米漿濃度。

1.2.7.2 無(wú)機(jī)氮源的選擇 在最優(yōu)的玉米漿濃度條件下添加無(wú)機(jī)氮源硝酸鈉，并設(shè)置0、2、4、6、8、10 g/L的濃度梯度，篩選出最適宜的硝酸鈉濃度，每組實(shí)驗(yàn)做三組平行。

1.2.7.3 碳源的選擇 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇葡萄糖為碳源，HPD的產(chǎn)量作為指標(biāo)，設(shè)置1、3、6、9、12、15 g/L的濃度梯度，篩選出最適宜的葡萄糖濃度，其他條件都保持不變，每組實(shí)驗(yàn)做三組平行。

1.2.7.4 磷酸鹽的選擇 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇磷酸氫二鉀為磷酸源，HPD的產(chǎn)量作為指標(biāo)，設(shè)置它的濃度梯度為1、2、3、4、5、6 g/L，篩選最適宜的磷酸鹽濃度，其他條件都保持不變，每組實(shí)驗(yàn)做三組平行。

1.2.7.5 響應(yīng)面設(shè)計(jì) 根據(jù)前面單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選擇玉米漿、磷酸氫二鉀、硝酸鈉和葡萄糖的濃度作為考察因素，HPD的產(chǎn)量作為指標(biāo)，利用Design-Expert 8.0.6.1軟件設(shè)計(jì)出4因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)因素和編碼水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)的因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factor levels for response surface experiments

1.3 數(shù)據(jù)整理

本實(shí)驗(yàn)中每個(gè)樣品做三組平行，使用Design-Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的設(shè)計(jì)以及數(shù)據(jù)分析，并預(yù)測(cè)出最優(yōu)結(jié)果，使用Origin 2018軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及作圖并進(jìn)行顯著性分析，標(biāo)有相同小寫(xiě)字母者表示組間差異不顯著（P＞0.05），反之表示組間差異顯著（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的驗(yàn)證與重組菌株篩選

使用pMV306的專用引物p306-F（ggcggagcctatggaaaaac）/p306-R（gcgttcgccctgtcgttcac）對(duì)pMV306-Psmyc-KstD進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖2所示，1,4條帶為空載即空白對(duì)照，2,5條帶為陽(yáng)性對(duì)照，3，6為構(gòu)建質(zhì)粒，結(jié)果送測(cè)驗(yàn)證正確。

圖2 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的電泳圖Fig.2 Electrophoretic images of PCR products

2.2 過(guò)表達(dá)菌株和原始菌株的生長(zhǎng)狀況

KstD過(guò)表達(dá)菌株為Mycobacterium neoaurumDSM 1381Z（DSM 1381Z）與初始菌DSM 1381的生長(zhǎng)情況如圖3所示，可以看出轉(zhuǎn)入3-甾酮-Δ1脫氫酶的DSM 1381Z菌株和初始菌株DSM 1381的生長(zhǎng)狀況大致相同，0～16 h緩慢生長(zhǎng)期，16～40 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，40～55 h穩(wěn)定生長(zhǎng)期之后進(jìn)入衰退期，兩株菌株生長(zhǎng)情況大致相同，說(shuō)明過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pMV306-Psmyc-KstD的轉(zhuǎn)入不會(huì)對(duì)過(guò)表達(dá)菌株DSM 1381Z的生長(zhǎng)產(chǎn)生負(fù)面影響。

圖3 DSM 1381Z和DSM1381的生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curve of DSM 1381Z and DSM 1381

2.3 過(guò)表達(dá)菌株植物甾醇轉(zhuǎn)化

過(guò)表達(dá)菌株DSM1381Z和初始菌株DSM 1381對(duì)植物甾醇的轉(zhuǎn)化結(jié)果如圖4所示，橫坐標(biāo)代表時(shí)間,縱坐標(biāo)代表產(chǎn)量，DSM 1381Z菌株發(fā)酵液中比DSM 1381菌株HPD產(chǎn)量提高了約50%，說(shuō)明過(guò)表達(dá)菌株構(gòu)建成功。

圖4 1381和1381Z對(duì)植物甾醇的生物轉(zhuǎn)化Fig.4 Bioconversion of phytosterols by 1381 and 1381Z

2.4 單因素實(shí)驗(yàn)篩選

2.4.1 有機(jī)氮源的選擇 氮源是微生物生長(zhǎng)需求量非常大的元素，適當(dāng)?shù)牡此綄?duì)微生物生物量的積累以及甾醇轉(zhuǎn)化有著非常重要的影響。預(yù)實(shí)驗(yàn)中多種有機(jī)氮源的存在下，DSM 1381Z都可以生成HPD，在幾種有機(jī)氮源中以玉米漿時(shí)HPD濃度最高，可能是因?yàn)橛衩诐{中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有利于植物甾醇轉(zhuǎn)化，后續(xù)實(shí)驗(yàn)在對(duì)它的濃度進(jìn)行優(yōu)化。

如圖5所示，隨著玉米漿濃度不斷增加，產(chǎn)物HPD的產(chǎn)量也逐漸增加，當(dāng)玉米漿濃度達(dá)到10 g/L時(shí)，HPD的產(chǎn)量最高3.2 g/L；但隨著濃度繼續(xù)增加，HPD積累量逐漸降低，可能是因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)過(guò)剩導(dǎo)致轉(zhuǎn)化甾醇不充分，接下來(lái)選擇10 g/L的玉米漿繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖5 玉米漿濃度的影響Fig.5 Effect of corn steep liquor concentration

2.4.2 無(wú)機(jī)氮源的選擇 預(yù)實(shí)驗(yàn)中幾種無(wú)機(jī)氮源中以硝酸鈉時(shí)HPD濃度最高，微生物轉(zhuǎn)化植物甾醇中既要有機(jī)氮源又要無(wú)機(jī)氮源，在玉米漿10 g/L濃度時(shí)，篩選出硝酸鈉濃度對(duì)產(chǎn)物的影響。

由圖6可以看到在硝酸鈉2 g/L時(shí)，HPD產(chǎn)量最高3.4 g/L，隨著硝酸鈉濃度逐漸增加，HPD產(chǎn)量降低，可能是因?yàn)樯倭康南跛岣x子可以促進(jìn)代謝，從而提高產(chǎn)量，而高濃度時(shí)可能會(huì)影響微生物生長(zhǎng)從而抑制微生物的代謝，因此玉米漿作為主要有機(jī)氮源時(shí)，再加入一些無(wú)機(jī)氮源硝酸鈉會(huì)促進(jìn)植物甾醇轉(zhuǎn)化，接下來(lái)選擇玉米漿10 g/L和硝酸鈉2 g/L作為合適的氮源濃度繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖6 硝酸鈉濃度的影響Fig.6 Effect of sodium nitrate concentration

2.4.3 碳源的選擇 碳源作為培養(yǎng)基必不可少的基本成分，可以為微生物的生長(zhǎng)及代謝提供必要的能量，選擇適宜的碳源有助于促進(jìn)某些酶的合成，增強(qiáng)微生物的某些生物活性[33]，預(yù)實(shí)驗(yàn)中DSM 1381Z可以利用不同的碳源，當(dāng)葡萄糖為碳源時(shí)，HPD的產(chǎn)量最高，可能因?yàn)槠咸烟鞘菃翁?，DSM1381Z相對(duì)更容易利用，故選用葡萄糖作為DSM 1381Z發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳源，然后再對(duì)其濃度進(jìn)行優(yōu)化。

如圖7所示，隨著葡萄糖濃度的增加HPD積累量先增加后減少，當(dāng)濃度為6 g/L時(shí)，產(chǎn)物濃度達(dá)到最大3.3 g/L，后續(xù)選擇6 g/L的葡萄糖作為碳源繼續(xù)研究。

圖7 葡萄糖濃度的影響Fig.7 Effect of glucose concentration

2.4.4 磷酸鹽的選擇 磷作為核酸、蛋白質(zhì)的主要成分，可以改變菌體的能荷狀態(tài)，還是培養(yǎng)基中重要的緩沖鹽，對(duì)維持發(fā)酵培養(yǎng)基中pH穩(wěn)定有重要作用[34]。預(yù)實(shí)驗(yàn)中選擇磷酸氫二鉀作為最適合磷酸鹽，對(duì)其濃度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如下圖8，當(dāng)磷酸氫二鉀濃度為2 g/L的發(fā)酵液中HPD的積累量最大。

圖8 磷酸氫二鉀濃度的影響Fig.8 Effect of phosphate source concentration

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

2.5.1 模型的建立和顯著性分析 使用軟件Design-Expert 8.0.6.1對(duì)表2進(jìn)行分析，方差的分析結(jié)果如表3所示。對(duì)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到DSM 1381Z轉(zhuǎn)化植物甾醇產(chǎn)HPD濃度（Y）對(duì)玉米漿（A）、磷酸氫二鉀（B）、硝酸鈉（C）、葡萄糖（D）的多項(xiàng)回歸方程:

表2 響應(yīng)面分析結(jié)果Table 2 Results of response surface analysis

Y=3.56?0.43A?0.024B?0.096C?1.908E?003D+0.21AB+0.10AC?0.16AD+0.014BC?0.039BD+0.34CD?1.20A2?1.09B2?0.51C2?0.62D2

由表3可知，本試驗(yàn)的回歸模型極顯著（P＜0.001），失擬項(xiàng)P=0.0515＞0.05不是很顯著，說(shuō)明模型較正確，擬合度較高，復(fù)決定系數(shù)R2=0.9883,表明預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值具有較好的相關(guān)性；調(diào)整性決定系數(shù)說(shuō)明方程模型的可信度較高，能夠較好地描述試驗(yàn)結(jié)果。由表3可知，對(duì)HPD產(chǎn)量影響最大的因素依次是A、C、B、D,CD的交互作用極顯著（P＜0.001），此外，AB、AD也有顯著性影響，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對(duì)HPD產(chǎn)量的影響極顯著（P＜0.001）。

表3 HPD產(chǎn)量多項(xiàng)式回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance（ANOVA）of HPD yield polynomial regression model

2.5.2 響應(yīng)面優(yōu)化與分析 根據(jù)回歸模型做出響應(yīng)面圖，考察各個(gè)因素之間的交互作用[35]對(duì)HPD產(chǎn)量的影響，交互作用的大小可由等高線的形狀來(lái)反映，兩因素的交互作用越顯著形狀越橢圓，若呈圓形則相反，并且響應(yīng)面曲線較陡也能說(shuō)明兩因素交互作用顯著，結(jié)果如圖9所示。

圖9 因素間交互作用的響應(yīng)面分析Fig.9 Response surface analysis of the interaction of different factors

通過(guò)Design-Expert 8.0.6.1軟件對(duì)響應(yīng)面結(jié)果分析計(jì)算，得到Mycobacterium neoaurumDSM 1381Z轉(zhuǎn)化植物甾醇產(chǎn)HPD的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方：玉米漿9.08 g/L、硝酸鈉1.82 g/L、葡萄糖5.98 g/L、磷酸氫二鉀1.97 g/L，此條件下HPD的產(chǎn)量預(yù)測(cè)值可達(dá)3.61 g/L。

2.5.3 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果驗(yàn)證 考慮到實(shí)際操作情況，將響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果校正為玉米漿9 g/L、硝酸鈉1.8 g/L、葡萄萄糖6 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證（3組平行實(shí)驗(yàn)），發(fā)酵120 h后得到實(shí)際HPD的積累量最大值為（3.73±0.12） g/L，與軟件預(yù)測(cè)值3.61 g/L的誤差約為3.22%，說(shuō)明上述方程和實(shí)際的擬合度較好，很好的驗(yàn)證了模型，與原始菌株DSM 1381相比，HPD產(chǎn)量提高了約2.7倍，為提高甾體藥物中間體的生產(chǎn)提供了一定的工業(yè)基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在出發(fā)菌株Mycobacterium neoaurumDSM 1381中過(guò)表達(dá)高活性的3-甾酮-Δ1-脫氫酶基因KstD獲得一株直接轉(zhuǎn)化植物甾醇高產(chǎn)HPD的菌株Mycobacterium neoaurumDSM 1381Z。為了進(jìn)一步提高其產(chǎn)量，通過(guò)單因素篩選出Mycobacterium neoaurumDSM 1381Z發(fā)酵培養(yǎng)基成分；然后利用響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，得到最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基玉米漿9 g/L、葡萄糖6 g/L、硝酸鈉1.8 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L。此條件下HPD預(yù)測(cè)產(chǎn)3.61 g/L，對(duì)優(yōu)化后的培養(yǎng)基進(jìn)行驗(yàn)證得到實(shí)際結(jié)果為（3.73±0.12） g/L，與理論預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明模型比較合適。通過(guò)培養(yǎng)基響應(yīng)面優(yōu)化，比初始菌DSM 1381的HPD產(chǎn)量提高了約2.7倍，產(chǎn)量由原來(lái)的71%提高到92%左右，具有一定的工業(yè)化應(yīng)用價(jià)值。

目前利用微生物直接轉(zhuǎn)化植物甾醇生產(chǎn)HPD的研究較少[36],本研究通過(guò)在DSM 1381體內(nèi)過(guò)表達(dá)3-甾酮-Δ1脫氫酶，進(jìn)一步獲得更多的HPD，發(fā)酵過(guò)程中植物甾醇幾乎都被微生物所利用，但是還有少量雜質(zhì)，因此下一步工作應(yīng)通過(guò)代謝工程等手段進(jìn)一步改造菌種，減少雜質(zhì)生成，提高HPD的純度和產(chǎn)量。