房延鳳 馬李杰 劉雁聲 南巖東 蘇 蔚 金發(fā)光 張 濤 張紅軍

肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的腫瘤[1-2]，亞洲人肺腺癌約占肺癌50%[3-4]，且很多肺癌診斷時已屬于晚期，目前其5年生存率仍很低，相關(guān)報道僅約13%[5]。以EGFR酪氨酸酶抑制劑為代表的分子靶向治療顯著延長了晚期非小細胞肺癌患者生存期[6]，而EGFR基因突變檢測為非小細胞肺癌是否可以行靶向治療及靶向治療藥物選擇提供了重要依據(jù)[7]。大量研究表明，EGFR基因突變主要存在于18-21外顯子上[8]，TKI治療最有效的敏感突變?yōu)?9外顯子的缺失突變和21外顯子的L858R點突變，既往研究報道，19外顯子的缺失突變約占EGFR突變的45%，L858R點突變占EGFR突變的40%～45%[9]。本文回顧性分析我科498例非小細胞肺癌患者通過ARMS法檢測其EGFR基因上19、21外顯子的2個突變位點，總結(jié)分析其突變臨床特征，為臨床治療提供參考。

對象與方法

一、研究對象

選取2012年7月至2018年7月空軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院呼吸科確診的非小細胞肺癌498例，腺癌407例，鱗癌82例，腺鱗癌4例，大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌3例，肉瘤樣癌2例。其中男性305例，女性193例，最小年齡32歲，最大年齡82歲，中位年齡61.13歲。

二、設備與方法

1. 主要儀器和試劑: Roche 480Ⅱ熒光定量PCR儀，Invitrogen Qubit 2.0核酸蛋白定量儀，Thermo PICO17臺式高速離心機，水浴鍋等；DNesasy? Blood & Tissue Kit(QIAGEN)，QIAamp? DNA FFPE Tissue Kit(QIAGEN)，QIAamp? Circulating Nucleic Acid Kit(QIAGEN)，EGFR基因突變檢測試劑盒(熒光PCR法)(蘇州為真)等。

2. 核酸純化： ①胸水和新鮮組織：所取樣本必須明確病理及腫瘤細胞含量。胸水50 ml低速離心5 min棄上清，沉底物-20 ℃保存或進入下一步純化；新鮮組織需芝麻粒大小1～2塊。處理好樣本之后，按照DNesasy? Blood & Tissue Kit(QIAGEN)流程純化核酸；②外周血：采集患者化療前或化療后4周外周血8～10 ml(EDTA抗凝)，按照QIAamp? Circulating Nucleic Acid Kit(QIAGEN)流程純化ctDNA；③石蠟組織：取石蠟組織切片3～5 μm厚，5～10片，按照QIAamp? DNA FFPE Tissue Kit(QIAGEN)流程純化核酸。

為保證檢測結(jié)果準確性，純化獲得的DNA，在檢測前需進行含量測定。要求：DNA純度檢測OD260/280比值在1.8～2.0，DNA濃度不低于10 ng/μl。純化好的DNA -20 ℃保存或進入下一步EGFR基因突變檢測。

3. EGFR基因突變檢測： 檢測使用蘇州為真公司EGFR基因突變檢測試劑盒(熒光PCR法)。試劑盒基于實時熒光定量PCR平臺，利用突變特異擴增PRCR和溶解曲線分析結(jié)合技術(shù)檢測基因特定突變。該技術(shù)以偏向擴增技術(shù)(amplification refractory mutation system, ARMS)為主，融合了溶解曲線(Melting Curve)和野生型DNA阻滯序列野生型阻滯探針兩種技術(shù)，熒光PCR檢測體系中所使用指示劑為Evagreen熒光染料。將DNA調(diào)整濃度至5 ng/ml，按照EGFR基因突變檢測試劑盒(熒光PCR法)說明進行試劑混合和上機操作。

4. 結(jié)果判讀： ①陽性質(zhì)控(STD)有擴增曲線且Ct值<40，且峰形正常；②Ct值要求：每個位點的ΔCt值臨界值及樣本內(nèi)控要求見試劑盒使用說明；③陽性樣本：有典型S型擴增曲線，且某個位點的ΔCt值在切值范圍內(nèi)，同時該位點的溶解峰形的Tm值與STD該位點溶解峰形的Tm值的差值絕對值小于或等于1。

三、統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)用SPSS19.0軟件包處理，計數(shù)資料用例數(shù)(n)和構(gòu)成比(%)表示，組間比較應用卡方檢驗或Fisher確切概率法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、入選患者E19-Del、L858R總體突變情況

498例非小細胞肺癌中E19-Del、L858R共突變108例，突變率21.687%，其中男性共突變49例，突變率為16.066%；女性共突變59例，突變率30.570%。

二、E19-Del突變情況與臨床特征

498例非小細胞肺癌中E19-Del突變63例(12.651%)，其中小于50歲突變率21.127%，大于等于50歲而小于70歲突變率10.458%，大于等于70歲突變率13.223%，三組比較有統(tǒng)計學差異。腺癌E19-Del突變率15.233%，其他類型突變率1.099%，兩組比較有統(tǒng)計學差異。Ⅳ期患者E19-Del突變率14.653%，Ⅲ期患者E19-Del突變率6.329%，Ⅰ期和Ⅱ期患者E19-Del突變率3.333%，三組比較有統(tǒng)計學差異，Ⅳ期和Ⅲ期突變率比較亦有統(tǒng)計學差異。E19-Del突變特征還表現(xiàn)在：均是未并發(fā)其它腫瘤，女性突變率高于男性，合并骨轉(zhuǎn)移、腦轉(zhuǎn)移的突變率高于無轉(zhuǎn)移的，胸膜、淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組突變率高于有轉(zhuǎn)移組，無糖尿病、高血壓組突變率高于合并糖尿病、高血壓，左肺腫瘤突變率略高于右肺腫瘤，但均無統(tǒng)計學差異，見表1。

三、E19-Del突變與吸煙量相關(guān)性比較

不吸煙組E19-Del突變率14.286%，吸煙每天大于20支突變率5.333%，兩者比較有統(tǒng)計學差異；吸煙每天小于或等于20支突變率13.415%，與不吸煙、吸煙每天大于20支三組比較無統(tǒng)計學差異；不吸煙組與吸煙每天小于或等于20支突變率比較無統(tǒng)計學差異；吸煙每天小于或等于20支者與吸煙每天大于20支者突變率比較無統(tǒng)計學差異，見表2。

表2 E19-Del突變與吸煙量分層特征

表1 E19-Del突變率與臨床分層特征

四、L858R突變情況與臨床特征

498例非小細胞肺癌中L858R突變45例，突變率9.036%，其女性突變率15.026%，男性突變率5.246%，兩者比較有統(tǒng)計學差異。不吸煙組L858R突變率12.355%，吸煙每天小于或等于20支突變率5.488%，吸煙每天大于20支突變率5.333%，三組比較有統(tǒng)計學差異。腺癌L858R突變率10.565%，其它類型其突變率2.198%，兩組比較有統(tǒng)計學差異。未發(fā)生胸膜轉(zhuǎn)移組L858R突變率7.051%，發(fā)生胸膜轉(zhuǎn)移突變率12.366%，兩組比較有統(tǒng)計學差異。L858R突變特征還表現(xiàn)在：年齡分層越大突變率越高，大于等于70歲其突變率最高，分期中突變率由高到低依次是Ⅱ期、Ⅳ期、Ⅰ期、Ⅲ期，并發(fā)其它腫瘤組突變率高于未并發(fā)其它腫瘤，合并骨轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的突變率高于無轉(zhuǎn)移組，頭顱未轉(zhuǎn)移的突變率高于有轉(zhuǎn)移組，無糖尿病、高血壓者突變率高于合并糖尿病、高血壓組，右肺腫瘤突變率高于左肺腫瘤，但均無統(tǒng)計學差異，見表3。

討 論

據(jù)報道在北美和西歐約10%的病例存在EGFR突變，但其中30%～50%病例屬于東亞血統(tǒng)[10]。不同種族中EGFR表達率不一樣[11]，既往研究證實，在亞裔、非吸煙、女性腺癌患者更常見[12]，即 E19-Del和L858R更常見不吸煙者，本文中E19-Del、L858R突變率均是非吸煙組高于吸煙組，吸煙量越大突變率越低，E19-Del突變率在不吸煙組與吸煙每天大于20支組有統(tǒng)計學差異，L858R突變率在不吸煙組、吸煙每天小于等于20支組、吸煙每天大于20支組三組間有統(tǒng)計學差異。EGFR突變在肺鱗狀細胞癌中極少，鱗癌中偶然檢測到被一些人認定為對腺鱗癌或低分化的病例誤診[13]。本文中E19-Del、L858R突變率腺癌高于其它類型腫瘤，L858R在并發(fā)胸膜轉(zhuǎn)移組突變率高于無胸膜轉(zhuǎn)移組，可能與胸膜轉(zhuǎn)移主要發(fā)生于腺癌患者，以上均有統(tǒng)計學差異，結(jié)論與既往研究相符，表明EGFR-TKI治療更適宜這種特征的患者。其次，E19-Del、L858R突變率雖均是女性高于男性，L858R突變率性別差異有統(tǒng)計學意義，但E19-Del突變率性別差異無統(tǒng)計學意義，分析可能與入選病例男女性別數(shù)有關(guān)，后續(xù)進一步用大樣本驗證。

表3 L858R突變率與臨床分層特征

國外有研究表明，腫瘤分期也會影響突變率。Sloan Kettering組得出在多個治療后復發(fā)、轉(zhuǎn)移的大型隊列中，EGFR突變率為27%[14]，本文結(jié)果中E19-Del分期突變率由高到低依次是Ⅳ期、Ⅰ期、Ⅲ期、Ⅱ期，且Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期及Ⅲ期、Ⅳ期的相互比較為分期越晚突變率越高，且有統(tǒng)計學差異。L858R分期突變率由高到低依次是Ⅱ期、Ⅳ期、Ⅰ期、Ⅲ期，無統(tǒng)計學差異，這點和既往研究結(jié)論以及E19-Del分期突變率不同，考慮一方面入選病例大部分是臨床分期，部分和術(shù)后分期存在一定差異。

本文結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，并發(fā)骨轉(zhuǎn)移組E19-Del、L858R突變率高于無骨轉(zhuǎn)移組；腦轉(zhuǎn)移組E19-Del突變率高于無轉(zhuǎn)移組，L858R相反；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組L858R突變率高于無轉(zhuǎn)移組，E19-Del相反。E19-Del、L858R突變率在未并發(fā)糖尿病、高血壓的NSCLC組高于合并糖尿病、高血壓組。未并發(fā)其它腫瘤組E19-Del突變率高于并發(fā)其它腫瘤組，L858R相反。發(fā)生于左肺的非小細胞肺癌E19-Del突變率高于右肺，L858R相反。由此可見，E19-Del、L858R突變率與未合并糖尿病、高血壓、并發(fā)骨轉(zhuǎn)移正相關(guān)，E19-Del、L858R在腫瘤發(fā)生部位、并發(fā)其它腫瘤和是否并發(fā)腦、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時突變率與臨床特征相反。其次，E19-Del突變率在年齡小于50歲組最高，且小于50歲、大于等于50歲而小于70歲、大于等于70歲三組突變率有統(tǒng)計學差異；L858R年齡分層越大突變率越高，綜上，E19-Del突變易發(fā)生于年輕患者，L858R突變易發(fā)生于年老患者。

研究顯示，外顯子E19-Del和L858R基本都是早期參與腫瘤克隆事件，而且當這些突變被靶向時，通常在多個癌癥部位觀察到反應[15]。但在攜帶E19-Del突變的NSCLC病例中療效優(yōu)于L858R突變的患者[16]，因此E19-Del、L858R突變的臨床特征和療效之間存在相關(guān)性。此外，既往研究證明如果患者只有E19-Del或L858R突變，可從第一代EGFR-TKI藥物中獲益[17]。一旦患者有雙重突變E19-Del和T790M或E19-Del和L858R，他們將不會受益于第一代EGFR-TKI藥物，可能會受益于第三代EGFR-TKI藥物[18]。

總之，NSCLC患者EGFR常見突變基因突變臨床特征差異與民族、遺傳學背景、環(huán)境因素、檢測方法等多種因素相關(guān)，本文結(jié)果通過498例以陜西省及周邊地區(qū)為著的NSCLC患者E19-Del、L858R突變臨床特征研究，分析突變臨床特點，有助于進一步思考、探索、優(yōu)化本地區(qū)NSCLC個體化治療。