王 勛，張雨杭，孫亞寧，李青梅，李 鴿，王 麗，郭軍慶，鄧瑞廣，張改平,

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002； 2.河南百奧生物工程有限公司，河南 鄭州 450002； 3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動物免疫學(xué)重點實驗室，河南 鄭州 450002)

規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌基因組中，參與抵抗外源遺傳物質(zhì)的入侵，主要由CRISPR相關(guān)蛋白(CRISPR-associated protein,Cas)參與完成。依據(jù)Cas蛋白在防御過程中參與的角色，可將CRISPR/Cas系統(tǒng)分為Class 1(由多個Cas蛋白形成的復(fù)合物參與外源核酸的切割)和Class 2(由單一的Cas蛋白切割外源核酸)。由于Class 2 CRISPR/Cas系統(tǒng)較為簡單，被開發(fā)為基因編輯工具，引起人們廣泛關(guān)注和應(yīng)用。其中，CRISPR/Cas9系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于基因功能研究、模式動物構(gòu)建及植物遺傳育種等各個領(lǐng)域[1-5]。隨著分子生物學(xué)、信息學(xué)與遺傳學(xué)的發(fā)展，一種全新的Class 2 CRISPR/Cas13系統(tǒng)于2015年被發(fā)現(xiàn)[6]。研究表明，Cas13是一個由RNA所引導(dǎo)的RNA切割酶，在crRNA的引導(dǎo)下能精確剪切細(xì)菌細(xì)胞中的特定RNA序列[7-8]。然而，Cas13與傳統(tǒng)的Cas9又有所不同。在細(xì)菌體內(nèi)，Cas9通過特異性地降解病毒基因組來防御入侵，而Cas13在特異性地破壞入侵病毒基因組之后仍保持活性，繼續(xù)以一種連帶剪切酶活性(Collateral RNase activity)對感染細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)所有RNA進(jìn)行破壞，迫使感染細(xì)菌各基因在轉(zhuǎn)錄水平的全面下調(diào)，進(jìn)入休眠狀態(tài)，以避免入侵RNA病毒由于隨機(jī)突變造成的免疫逃逸[9]。

利用Cas13的連帶剪切酶活性，一種全新核酸診斷系統(tǒng)于2017年被開發(fā)出來(圖1)，該系統(tǒng)通過加入一種熒光基團(tuán)/猝滅基團(tuán)特殊標(biāo)記的熒光報告底物(Quenched fluorescent RNA reporter)，當(dāng)檢測體系中存在靶標(biāo)核酸時，Cas13a在crRNA的引導(dǎo)下與之匹配并活化，對報告RNA進(jìn)行切割使熒光基團(tuán)與其猝滅基團(tuán)分離，進(jìn)而將靶標(biāo)核酸的存在轉(zhuǎn)變?yōu)闊晒庑盘朳10]。

圖1 Cas13a核酸診斷系統(tǒng)原理Fig.1 Schematic of nucleic acid detection by Cas13a

自Cas13的這種連帶剪切酶活性被首次證實，一系列具有這種特性的Cas家族蛋白被相繼發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于核酸檢測：(1)SMARGON等[11]在2016年鑒定出14個具有類似Cas13a連帶剪切酶活性的Cas13b家族蛋白；(2)CRISPR-Cas12a檢測系統(tǒng)不但能夠?qū)θ巳轭^瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)在單分子水平進(jìn)行快速專一檢測，且能夠?qū)PV16、HPV18進(jìn)行鑒別檢測[12]；(3)在不可培養(yǎng)古生菌基因組中鑒定出的Class 2 Cas家族新成員Cas14，也被證實是RNA引導(dǎo)的DNase且具有連帶剪切特性，并被應(yīng)用于對人唾液樣品中HERC2基因的單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms，SNP)分析[13]。此外，利用不同具有連帶剪切酶活性的Cas蛋白對切割底物序列的偏好性，結(jié)合不用熒光基團(tuán)的標(biāo)記策略，GOOTENBERG等[13]綜合PsmCas13b(FAM-rUrUrUrUrUrU-Q)、LwaCas13a(TEX-rArU-Q)、CcaCas13b(Cy5-rUrA-Q)、AsCas12a(HEX-TTATT-Q)的蛋白特性，實現(xiàn)了對包括登革熱病毒、寨卡病毒在內(nèi)的4種靶標(biāo)進(jìn)行了多聯(lián)檢測。同時，將SHERLOCK/DETECTR系統(tǒng)與側(cè)流層析技術(shù)(Lateral flow assay,LFA)進(jìn)行了結(jié)合，實現(xiàn)了非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)EGFR L858R點突變及外顯子19核酸缺失突變的活體可視化鑒別檢測[14]，寨卡病毒、登革熱病毒、西尼羅河熱病毒和黃熱病毒的四聯(lián)鑒別檢測[15]，登革熱4種血清型的四聯(lián)核酸鑒別檢測，2015—2016年美國流感流行毒株的SNP分析[16]。快速診斷和監(jiān)測預(yù)警是疫病防控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而基于LwaCas13a重組蛋白連帶剪切酶活性建立的檢測方法具有敏感、特異、快速、簡便的特點，對于疫病的精準(zhǔn)診斷意義重大。為此，對LwaCas13a重組蛋白進(jìn)行原核表達(dá)及鎳柱親和層析純化，以期建立LwaCas13a連帶剪切酶活性的檢測方法，為CRISPR/Cas13a新型診斷技術(shù)在重大動物疫病中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞與試劑

LwaCas13a表達(dá)載體pET His6-TwinStrep-SUMO-LwaCas13a購自淼靈質(zhì)粒共享平臺(https://www.miaolingbio.com)，質(zhì)粒編號pC013，載體圖譜信息公布于https:// benchling.com/s/seq-66Cf Lwu7sL MQM bcXe7Ih。質(zhì)粒提取試劑盒購自康為世紀(jì)公司(CW2105S)，Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購自TOLOBIO公司(#CC96109)，Taq酶購自Takara公司，DL2000 DNA Marker購自Transgene公司，蛋白質(zhì) Marker購自Solarbio公司，鎳填料購自GE Healthcare公司，HRP-conjugated anti-6×His 抗體購自Protech公司，RNA轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司，RNA純化試劑盒購自Thermo公司，RNA酶抑制劑(RNase inhibitor)購自NEB公司，熒光報告底物購自Thermo公司。

1.2 LwaCas13a重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

1.2.1 質(zhì)粒的提取 將pET His6-TwinStrep-SUMO-LwaCas13a甘油菌劃線至含有1 mg/L氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板培養(yǎng)后，挑取單菌落至含有1 mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中活化擴(kuò)大培養(yǎng)，按質(zhì)粒提取試劑盒說明書進(jìn)行質(zhì)粒提取，Nanodrop測定質(zhì)粒質(zhì)量濃度，-80 ℃保存。

1.2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 將提取的LwaCas13a質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞Rosetta(DE3)，完成轉(zhuǎn)化后，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有1 mg/L氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板培養(yǎng)。挑取上述平板中單克隆菌落至含有1 mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)后，進(jìn)行測序驗證；將測序完全正確的單克隆培養(yǎng)保存在含15%甘油的凍存管中。

1.2.3 LwaCas13a重組蛋白的表達(dá)與條件優(yōu)化 將凍存的表達(dá)菌按1∶100比例接種于含有1 mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基活化培養(yǎng)；將活化培養(yǎng)的菌液按1∶100比例接種于含有1 mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為0.6，加入終濃度為1 mmol/L 的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并對誘導(dǎo)溫度(16、20、24、37 ℃)和時間(3、6、9、12、15、18、21、24 h)進(jìn)行優(yōu)化。收集菌液，在4 ℃條件下6 000 r/min離心10 min，棄上清，收集菌體；用Lysis Buffer(20 mmol/L Tris-HCl，pH值 8.0，500 mmol/L NaCl，1 mmol/L DTT)重懸菌體并超聲破碎菌體至菌液澄清透亮。將破碎后的菌體在4 ℃條件下13 000 r/min離心90 s，分離裂解菌體上清和沉淀。以8% SDS-PAGE電泳分析誘導(dǎo)表達(dá)菌體及其裂解上清和沉淀，并以HRP-conjugated anti-6×His抗體作為一抗進(jìn)行Western blot檢測。

1.3 LwaCas13a表達(dá)蛋白的純化

通過鎳親和層析純化LwaCas13a表達(dá)蛋白。將菌體裂解上清上樣鎳親和層析柱，用5個柱體積Lysis Buffer充分洗滌柱體，以洗去雜蛋白質(zhì)，分別用4倍柱體積的20 mmol/L咪唑洗脫液(20 mmol/L Tris-HCl， pH值8.0，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑)、100 mmol/L咪唑洗脫液(20 mmol/L Tris-HCl， pH值8.0，500 mmol/L NaCl，100 mmol/L咪唑)、500 mmol/L咪唑洗脫液(20 mmol/L Tris-HCl， pH值8.0，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑)對蛋白質(zhì)進(jìn)行洗脫。洗脫液采用SDS-PAGE檢測，并以HRP-conjugated anti-6×His抗體作為一抗進(jìn)行Western blot分析。

1.4 酶活性檢測反應(yīng)體系的建立

根據(jù)GOOTENBERG等[17]設(shè)計的探針crRNA 及靶標(biāo)Target RNA(表1)，對LwaCas13a的連帶剪切酶活性檢查方法進(jìn)行優(yōu)化。

由上海生工生物工程有限公司合成1對分別帶有T7啟動子序列的正向DNA oligo及其反向互補(bǔ)DNA oligo，并將DNA oligo經(jīng)95 ℃變性后通過溫度梯度降溫(1 ℃/90 s)，得到帶有T7啟動子序列的雙鏈DNA轉(zhuǎn)錄模板。

表1 crRNA與Target RNA序列Tab.1 Sequences of crRNA and Target RNA

按照RNA轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。20 μL的反應(yīng)體系：2×轉(zhuǎn)錄Buffer 10 μL，DNA轉(zhuǎn)錄模板1 μg，T7轉(zhuǎn)錄酶Mix 2 μL，DEPC水補(bǔ)至20 μL。轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系在37 ℃水浴孵育1 h后，加入RNA轉(zhuǎn)錄試劑盒中的RQ-1 DNase 1 μL，繼續(xù)在37 ℃水浴孵育30 min消解轉(zhuǎn)錄DNA模板。向RNA純化試劑盒純化柱中加入650 μL DEPC水，室溫靜置15 min；將純化柱放于水平轉(zhuǎn)子的離心機(jī)中，750×g離心2 min；棄濾液，將轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物立即加于純化柱中，750×g離心2 min；收集濾液即純化RNA，Nanodrop測定質(zhì)量濃度后-80 ℃保存。

1.5 LwaCas13a酶活性檢測

LwaCas13a酶活性檢測反應(yīng)體系： 在50 μL Reaction Buffer(20 mmol/L HEPES， 60 mmol/L NaCl， 6 mmol/L MgCl2，pH值6.8)體系中，LwaCas13a重組蛋白 54 nmol/L，探針crRNA 30 nmol/L，Target RNA 300 nmol/L，RNA酶抑制劑 (40 000 U/mL)2 μL，熒光報告底物125 nmol/L。除試驗組外，分別以缺失體系中各個組分作為陰性對照，以RNase A作為陽性對照。在37 ℃、Ex/Em=490/520 nm熒光讀值條件下對LwaCas13a RNase活性進(jìn)行動力學(xué)測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 LwaCas13a重組蛋白可溶性表達(dá)條件的優(yōu)化

在16、20、24、37 ℃條件過夜誘導(dǎo)10 h，并對誘導(dǎo)菌體破碎后的上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE檢測。結(jié)果表明(圖2)，與未誘導(dǎo)對照組相比，在4個誘導(dǎo)溫度的破碎上清中均出現(xiàn)了1條與目的蛋白預(yù)期大小(143.4 ku)一致的條帶。同時，隨溫度的增加，破碎后沉淀中該條帶的含量逐步增加，表明過高的溫度不利于該蛋白質(zhì)的可溶性表達(dá)。因此，選擇16 ℃作為最適培養(yǎng)溫度。

M：蛋白質(zhì) Marker；1：未誘導(dǎo)菌體；2：誘導(dǎo)上清(16 ℃)；3：誘導(dǎo)沉淀(16 ℃)；4：誘導(dǎo)上清(20 ℃)；5：誘導(dǎo)沉淀 (20 ℃)；6：誘導(dǎo)上清(24 ℃)；7：誘導(dǎo)沉淀(24 ℃)；8：誘導(dǎo)上清(37 ℃)；9：誘導(dǎo)沉淀(37 ℃)

在16 ℃培養(yǎng)溫度下，在誘導(dǎo)后3、6、9、12、15、18、21、24 h，對菌體的破碎上清進(jìn)行SDS-PAGE檢測，結(jié)果表明(圖3)，誘導(dǎo)后培養(yǎng)3～15 h，隨培養(yǎng)時間的增多，該蛋白質(zhì)含量逐漸增高；誘導(dǎo)后培養(yǎng)15～24 h，該蛋白質(zhì)含量逐漸降低，可能是由于過長的培養(yǎng)時間而導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解。

如圖3所示，在16 ℃條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)15 h時，上清樣品SDS-PAGE結(jié)果中LwaCas13a重組蛋白對應(yīng)條帶最為明顯，即在16 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)15 h時，蛋白質(zhì)表達(dá)量最大。

經(jīng)16 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)15 h后，超聲裂解LwaCas13a誘導(dǎo)表達(dá)菌體，離心分離裂解菌體上清和沉淀，分別進(jìn)行SDS-PAGE檢測和Western blot分析(圖4)。SDS-PAGE結(jié)果顯示，在誘導(dǎo)后的菌體中存在1條目的條帶；該條帶同時存在于誘導(dǎo)后菌體破碎的上清液中(圖4A)。Western blot結(jié)果顯示，LwaCas13a重組蛋白能夠與HRP-conjugated anti-6×His 抗體特異性結(jié)合(圖4B)?？梢姡?jīng)過16 ℃誘導(dǎo)15 h， LwaCas13a重組蛋白實現(xiàn)了可溶性原核表達(dá)。

M：蛋白質(zhì) Marker；1：誘導(dǎo)前菌體；2：誘導(dǎo)后菌體；3：超聲破碎上清；4：超聲破碎沉淀

2.2 LwaCas13a重組蛋白的純化

超聲裂解LwaCas13a誘導(dǎo)表達(dá)菌體，離心分離裂解菌體上清進(jìn)行蛋白質(zhì)純化。對上樣后的純化柱進(jìn)行洗脫，并對洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE分析(圖5)，發(fā)現(xiàn)菌體上清中存在目的條帶，流穿液中不存在目的條帶，證明LwaCas13a重組蛋白能較好地吸附純化柱；在20 mmol/L咪唑洗脫液條件下，雜蛋白質(zhì)被大量洗脫；在100 mmol/L咪唑洗脫液條件下，LwaCas13a重組蛋白被洗脫下來，得到純度較高的LwaCas13a重組蛋白，起到了富集純化的作用；在500 mmol/L咪唑洗脫液條件下，沒有蛋白質(zhì)洗脫，證明LwaCas13a重組蛋白在100 mmol/L咪唑洗脫液條件下已經(jīng)完全洗脫。

1：菌體上清；2：流穿液；3：洗滌液；4：20 mmol/L咪唑洗脫液；5:100 mmol/L咪唑洗脫液；6:500 mmol/L咪唑洗脫液；

2.3 LwaCas13a連帶剪切酶活性測定方法的鑒定

根據(jù)LwaCas13a重組蛋白特性，在LwaCas13a酶活性檢測反應(yīng)體系中，LwaCas13a重組蛋白在crRNA的引導(dǎo)下與Target RNA匹配并活化，使熒光報告底物熒光基團(tuán)與其猝滅基團(tuán)分離，從而產(chǎn)生熒光信號。由圖6可知，通過對試驗組以及不同組分缺失對照組的分析發(fā)現(xiàn)，LwaCas13a酶活性檢測反應(yīng)體系中任一組分的缺失，都無法檢測出明顯酶活。

通過對陽性對照組與含RNA酶抑制劑組分析證明，RNA酶抑制劑對RNA酶有抑制作用，但對LwaCas13a重組蛋白沒有抑制作用，同時，RNA酶抑制劑的加入，可以保護(hù)Reaction Buffer體系中各RNA組分的完整。

在LwaCas13a酶活性檢測反應(yīng)體系中，對Target RNA濃度從1 mmol/L到15.6 nmol/L進(jìn)行梯度稀釋，并控制其他組分不變，LwaCas13a檢測Target RNA敏感性為31.2 nmol/L(圖7)。

圖6 LwaCas13a 重組蛋白酶活性的動力學(xué)測定Fig.6 Kinetics of LwaCas13a RNase activity

圖7 LwaCas13a 重組蛋白檢測RNA靶標(biāo)敏感性Fig.7 Detection limit of LwaCas13a in detecting RNA target

3 結(jié)論與討論

LwaCas13a作為CRISPR/Cas家族成員，具有良好的核酸識別特異性，可識別2個以上堿基突變的差異，非常適用于具有鑒別診斷需求的實際應(yīng)用。如豬瘟強(qiáng)毒株與兔化弱毒疫苗株的感染與免疫鑒別診斷、細(xì)菌的16S DNA或真菌的18S DNA菌種鑒定以及病毒的基因分型鑒定等。由于該方法對臨床樣本檢測敏感性較低，可進(jìn)一步結(jié)合核酸擴(kuò)增技術(shù)提高檢測的敏感性[18-21]。由于LwaCas13a連帶剪切酶活性檢測方法是在37 ℃等溫條件下進(jìn)行，對溫控儀器要求較低，與傳統(tǒng)的PCR擴(kuò)增技術(shù)相比，更適合與近年來快速發(fā)展的等溫擴(kuò)增技術(shù)相結(jié)合(重組酶聚合酶等溫擴(kuò)增或環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)等)，實現(xiàn)核酸診斷的便捷檢測[22-24]。此外，本研究結(jié)合膠體金試紙技術(shù)，可以將結(jié)果由熒光檢測變成可視化檢測，進(jìn)一步脫離對大型儀器設(shè)備的依賴，具有臨床檢查的潛力。

本研究對LwaCas13a重組蛋白進(jìn)行了原核可溶性表達(dá)，并通過鎳柱親和層析法對其進(jìn)行了純化，建立了LwaCas13a連帶剪切酶活性的檢測方法，為CRISPR/Cas13a新型診斷技術(shù)在重大動物疫病中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

通過對CRISPR/Cas13a新型核酸診斷技術(shù)方法的建立，利用Cas家族蛋白對核酸識別的高度特異性以及LwaCas13a特有的連帶剪切酶活性，在我國重大動物疫病鑒別及多聯(lián)診斷方面具有重要的應(yīng)用前景。