孟江玲，何 德，李翠新

(西南林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,云南 昆明 650224)

蛹蟲草[Cordycepsmilitaris(L.)]又稱北蟲草、北冬蟲夏草、蛹草菌等，隸屬蟲草菌科(Cordycipitaceae)、蟲草屬(Cordyceps)[1]。蟲草的主要食藥用成分包含核苷類、多糖類、糖醇和甾醇類、蛋白質(zhì)及氨基酸和多肽類、無機(jī)元素類及其他物質(zhì)[2]。蟲草多糖是蛹蟲草體內(nèi)含量最豐富、最重要的生物活性物質(zhì)之一，具有提高人體免疫能力、改善呼吸系統(tǒng)、促進(jìn)腎上腺素分泌、抑制腫瘤生長(zhǎng)等功效[3]；蟲草多糖也是綜合評(píng)價(jià)蛹蟲草品質(zhì)的指標(biāo)之一[4]。

銅(Cu)是人體的必需微量元素[5-12]，在體內(nèi)不能合成,必須由外界攝入[13]。人體每日攝入量過高或過低都對(duì)健康有害，引發(fā)各種疾病，如免疫功能下降、糖尿病、腫瘤、骨質(zhì)疏松、肝硬化以及癌癥等[14-16]。食用菌能夠富集重金屬離子，且富集能力超過綠色植物[17-22]。目前，已有學(xué)者研究了金屬銅離子對(duì)蛹蟲草菌絲抗氧化酶活性和Cu2+耐受度的影響[22]，并沒有考慮蛹蟲草富集銅離子后對(duì)其子實(shí)體生長(zhǎng)及食用富銅蛹蟲草后對(duì)人體健康的影響。鑒于此，將銅離子添加到培養(yǎng)基中后檢測(cè)蛹蟲草子實(shí)體中的銅離子含量，將其與人體代謝耐受的最低值和最高值作比較，評(píng)估培養(yǎng)基中銅離子添加量對(duì)蛹蟲草自身及人體健康的影響，為蛹蟲草開發(fā)利用提供研究基礎(chǔ)，同時(shí)為人們直接和間接利用蛹蟲草提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)材料來自西南林業(yè)大學(xué)食用菌栽培與利用實(shí)訓(xùn)基地和大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)食用菌資源保護(hù)與開發(fā)利用推廣中心。

試劑：標(biāo)準(zhǔn)銅溶液1.0×10-4mol/L、蒽酮試劑[23]、KBrO3溶液0.03 mol/L、羅丹明B溶液2.5×10-4mol/L、抗壞血酸溶液0.01 mol/L、H2SO4溶液0.20 mol/L、標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0.1 mg/mL。

1.2 培養(yǎng)基制備

PD液體培養(yǎng)基：土豆200 g、葡萄糖15 g、淀粉5 g、蛋白胨5 g、酵母膏3 g、硫酸鎂1 g、磷酸二氫鉀1 g，蒸餾水定容到1 L，自然pH值[22-24]。

PDA固體培養(yǎng)基：在PD液體培養(yǎng)基配方基礎(chǔ)上添加10 g/L的瓊脂。

PD液體加銅離子培養(yǎng)基：在PD液體培養(yǎng)基配方基礎(chǔ)上，按照0、1.6、3.2、6.4、12.8、19.2、25.6、32.0 mg/L質(zhì)量濃度梯度添加銅離子溶液[25-26]。

大米加銅離子培養(yǎng)基：大米30 g、營(yíng)養(yǎng)液55 mL(葡萄糖9.1 g、蛋白胨3.6 g、酵母膏3.6 g、硫酸鎂1 g、磷酸二氫鉀1 g、水1 L)，并按照上述質(zhì)量濃度梯度添加銅離子溶液。

1.3 菌絲體培養(yǎng)和出草試驗(yàn)

通過PDA固體培養(yǎng)基斜面活化菌種后，轉(zhuǎn)至PD液體加銅離子培養(yǎng)基，于25 ℃、150 r/min的恒溫?fù)u床培養(yǎng)8 d。

菌種通過PDA固體培養(yǎng)基斜面活化后，挑取0.5 cm2菌塊1～2塊至PD液體培養(yǎng)基，于25 ℃、150 r/min的恒溫?fù)u床培養(yǎng)，制得種子液。將種子液接種到大米加銅離子培養(yǎng)基中，每個(gè)處理組3瓶，重復(fù)3次，進(jìn)行出草試驗(yàn)[26-28]。

1.4 蛹蟲草生長(zhǎng)及產(chǎn)量測(cè)定

菌絲液體培養(yǎng)8 d，濾去液體培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)皿中在45 ℃的鼓風(fēng)恒溫干燥箱中烘50 h，記錄恒質(zhì)量值即可。

子實(shí)體采摘時(shí)稱質(zhì)量，將其置于45 ℃鼓風(fēng)恒溫干燥箱中烘干水分(4～5 d)，記錄恒質(zhì)量。

1.5 菌絲體、子實(shí)體中多糖和銅離子含量測(cè)定

利用蒽酮比色法[23]和羅丹明法[29]分別測(cè)定菌絲和子實(shí)體中多糖及銅離子含量。

1.6 人體每日食用富銅蛹蟲草量的計(jì)算

中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)建議的人體銅攝入量是2.0～8.0 mg/d[30]。安全起見，本研究取最小值2.0 mg/d作為最適銅攝入量，計(jì)算需要攝入的蛹蟲草干品的量。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛹蟲草生長(zhǎng)及產(chǎn)量

從圖1可以看出，蛹蟲草菌絲體在沒有添加銅離子的培養(yǎng)基里，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，厚薄均勻。加入銅離子后，蛹蟲草菌絲體的菌落中間部位菌絲較為密集，微微泛黃；邊緣菌絲稀疏，白色。表明蛹蟲草菌絲體生長(zhǎng)會(huì)受到銅離子的影響。菌絲體干質(zhì)量和生長(zhǎng)速度等在不同銅離子添加量時(shí)存在顯著性差異(表1)。

1：0 mg/L；2：1.6 mg/L；3：3.2 mg/L；4：6.4 mg/L；5：12.8 mg/L；6：19.2 mg/L；7：25.6 mg/L；8：32.0 mg/L

在培養(yǎng)基中添加銅離子后，蛹蟲草子實(shí)體發(fā)生退化，出現(xiàn)分叉、矮小、叢簇等形態(tài)的變化(圖2)。蛹蟲草子實(shí)體的高度和直徑隨著銅離子添加量的增加而減小(表2)，說明培養(yǎng)基中加入銅離子使子實(shí)體形態(tài)發(fā)生退行性變化，而且最小銅離子添加量1.6 mg/L已經(jīng)影響了蛹蟲草子實(shí)體的生長(zhǎng)，導(dǎo)致蛹蟲草的退化。由表3可知，添加銅離子的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的蛹蟲草子實(shí)體鮮質(zhì)量與干質(zhì)量均小于空白組。說明本研究中最小銅離子添加量1.6 mg/L時(shí)已經(jīng)開始影響蛹蟲草子實(shí)體生長(zhǎng)。

表1 不同銅離子添加量對(duì)蛹蟲草菌絲體干質(zhì)量、銅離子含量及多糖含量的影響

a.0 mg/L; b.1.6 mg/L; c.3.2 mg/L; d.25.6 mg/L圖2 不同銅離子添加量下蛹蟲草子實(shí)體形態(tài)特征

表3 不同銅離子添加量對(duì)蛹蟲草子實(shí)體質(zhì)量、銅離子含量及多糖含量的影響

續(xù)表3 不同銅離子添加量對(duì)蛹蟲草子實(shí)體質(zhì)量、銅離子含量及多糖含量的影響

2.2 菌絲體、子實(shí)體中多糖和銅離子含量

利用蒽酮比色法測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液質(zhì)量濃度與吸光值關(guān)系(圖3)，獲得線性回歸方程：A=32.671B-0.002 5(R2=0.999 1)，A表示吸光值，B表示葡萄糖質(zhì)量濃度。

圖3 葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of glucose solution

采用羅丹明法測(cè)定銅離子質(zhì)量濃度與吸光值關(guān)系(圖4)，獲得線性回歸方程：Y=0.269 9X+0.000 3(R2=0.999 8)，Y表示吸光值，X表示銅離子質(zhì)量濃度。

圖4 銅離子溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)表1可以得出，蛹蟲草菌絲體多糖含量隨著銅離子添加量增加而增加；菌絲體銅離子富集率先增加后減少，在銅離子添加量3.2 mg/L下達(dá)到最大值54.41%，從銅離子添加量19.2 mg/L開始不富集銅離子，說明在培養(yǎng)基中添加少量且適量的銅離子有助于提高菌絲體銅離子富集率。

根據(jù)表3可知，不同處理蛹蟲草子實(shí)體多糖含量存在顯著性差異，子實(shí)體多糖含量隨著銅離子添加量增多而增加，在32.0 mg/L的銅離子添加量時(shí)子實(shí)體多糖含量最多，說明添加銅離子可促進(jìn)蛹蟲草子實(shí)體合成多糖。蛹蟲草子實(shí)體銅離子富集率呈現(xiàn)M形趨勢(shì)，即先增后減又增再減趨勢(shì)，在質(zhì)量濃度3.2 mg/L和25.6 mg/L下分別出現(xiàn)高峰，在12.8 mg/L的質(zhì)量濃度下甚至還低于空白對(duì)照的情況。其中，蛹蟲草銅離子添加量為3.2 mg/L時(shí)，子實(shí)體的銅離子富集率為191.01%。

2.3 蛹蟲草子實(shí)體銅離子含量與人體每日攝入銅離子的限定值對(duì)比

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，最適宜的銅離子添加量為1.6～3.2 mg/L,但最小銅離子添加量1.6 mg/L已造成子實(shí)體發(fā)生退化等情況。因此，僅在1.6 mg/L銅離子添加量的情況下探討額外添加銅離子的子實(shí)體滿足人體攝入銅離子的情況。該添加量下，子實(shí)體含銅離子(0.068±0.003)mg/g，約是空白組的2倍。在此情況下，只需每天食用29 g干蛹蟲草或116 g鮮蛹蟲草(根據(jù)鮮質(zhì)量/干質(zhì)量比約為4進(jìn)行換算)就能補(bǔ)足人體所需銅離子量，但是不宜超過117 g干蛹蟲草或468 g鮮蛹蟲草。

3 結(jié)論與討論

銅是真菌生長(zhǎng)必需的金屬元素，是生物體內(nèi)許多酶的金屬輔基，但是銅過量會(huì)對(duì)真菌產(chǎn)生毒害作用。本研究表明，1.6 mg/L的銅離子添加量已經(jīng)對(duì)蛹蟲草菌絲體造成一定損害，出現(xiàn)生長(zhǎng)不均勻等情況。而何卓晶等[22]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Cu2+超過300 mg/L時(shí)，會(huì)嚴(yán)重影響菌絲體的生長(zhǎng)，菌絲體產(chǎn)量明顯低于空白對(duì)照組，該質(zhì)量濃度高于本研究得出的影響菌絲體的最小銅離子添加量1.6 mg/L。但總體結(jié)果都表明，高濃度的Cu2+抑制菌絲體的生長(zhǎng)。因此，本研究所用菌種需在1.6 mg/L以下的銅離子添加量下研究其生理生化情況，找到適宜的銅離子添加量。

市面上蛹蟲草子實(shí)體大多以鮮菌或者干菌等方式出售，其形態(tài)應(yīng)是直立生長(zhǎng)、無畸形。而本研究銅離子最小添加量1.6 mg/L已經(jīng)造成蛹蟲草子實(shí)體退化，出現(xiàn)分叉、矮小、叢簇等形態(tài)的變化。因此，選擇1.6 mg/L銅離子添加量為試驗(yàn)中子實(shí)體最佳生長(zhǎng)質(zhì)量濃度。

蛹蟲草子實(shí)體銅離子富集率呈現(xiàn)M形曲線，而在其他真菌銅離子富集的研究中如香菇[31]、平菇[32]等，銅離子富集率均隨著銅離子濃度增加而增加，未見到富集率低于空白對(duì)照的現(xiàn)象，其原因待進(jìn)一步研究。

盧嬌嬌[18]研究發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)基中銅離子添加量增加(500～1 000 mg/kg)，平菇子實(shí)體銅離子含量也增加，最大銅離子含量為0.022 59 mg/g，需食用88 g才能滿足人體所需銅離子量。自然情況下草菇中銅離子含量最高為0.057 81 mg/g，其次是雙孢菇(0.054 4 mg/g)[33]，均小于本研究銅離子添加量1.6 mg/L下的蛹蟲草銅離子含量(0.068 mg/g)。因此，本研究的富銅離子蛹蟲草更適合作為人們補(bǔ)充銅離子的食藥菌。雖然在該質(zhì)量濃度下子實(shí)體多糖含量、銅離子含量都比空白對(duì)照增加不少，銅離子富集率較高，但是其形態(tài)有部分退化現(xiàn)象。因此，仍然需要改進(jìn)銅離子添加的濃度梯度，探索較低濃度銅離子對(duì)子實(shí)體生長(zhǎng)的影響，致力于找到既能促進(jìn)子實(shí)體生長(zhǎng)，又能增加銅離子含量的濃度。