王 麗，馮麗麗，張雨杭，孫亞寧,4，楊繼飛，趙 東，王瑞寧，李學(xué)伍，郭軍慶，張改平,

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)部動物免疫學(xué)重點實驗室/河南省動物免疫學(xué)重點實驗室，河南 鄭州 450002；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟與信息研究所，河南 鄭州 450002； 3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；4.河南百奧生物工程有限公司，河南 鄭州 450002； 5.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院 動物醫(yī)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046)

豬瘟(Classical swine fever，CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的高度接觸性傳染病，流行于世界許多國家，對全球范圍內(nèi)的養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失[1-3]。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將此病列為A類傳染病[4]，我國也在2012年將其列為優(yōu)先防治和重點防范的Ⅰ類動物疫病。作為CSF高發(fā)國家，我國主要采取接種兔化豬瘟弱毒疫苗的方式來防控CSF，隨著該疫苗的長期廣泛使用，CSF大規(guī)模流行得到有效控制，典型的CSF病例較少出現(xiàn)，但持續(xù)性感染、混合感染和隱性帶毒等現(xiàn)象多有出現(xiàn)，免疫失敗時有發(fā)生[5]，給CSF防控工作帶來很大挑戰(zhàn)。血清學(xué)診斷技術(shù)可實現(xiàn)對CSFV抗體水平監(jiān)測，針對性制定合理免疫程序，達到提高疫苗免疫效果的目的，是CSF防控不可缺少的環(huán)節(jié)，對于防控和凈化CSF具有重要的意義。

CSFV的結(jié)構(gòu)蛋白由衣殼蛋白(C)和囊膜糖蛋白(Erns、E1和E2)構(gòu)成[6]。其中的E2蛋白是CSFV結(jié)構(gòu)蛋白中最重要的免疫功能蛋白，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生的特異性中和抗體可抵抗病毒的感染，在保護性免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是研發(fā)血清學(xué)抗體檢測方法的首選靶蛋白[7-8]。Erns蛋白是CSFV的次要免疫相關(guān)抗原，機體感染CSFV后也可產(chǎn)生針對Erns的中和抗體，誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體同樣可以抵抗CSFV強毒的攻擊。因此，在診斷方法研制方面，Erns蛋白也具有很大的應(yīng)用前景[9-10]。目前，Erns蛋白和E2蛋白已在多種表達系統(tǒng)中成功表達，如大腸桿菌[11]、昆蟲細胞[12-13]、酵母[14]和植物[15]等。其中，利用大腸桿菌生產(chǎn)重組蛋白，具有產(chǎn)量高、成本低和生產(chǎn)周期短等優(yōu)點，被廣泛用于多種工業(yè)產(chǎn)品的生產(chǎn)中[16]。國外研究結(jié)果表明，應(yīng)用Erns和E2融合表達蛋白作為包被抗原較單獨的Erns蛋白或E2蛋白ELISA方法可增加血清學(xué)診斷的敏感性，更適合免疫后的早期監(jiān)測及大規(guī)模CSFV疫苗普免抗體水平的普查[17]。國內(nèi)外現(xiàn)已開發(fā)出多種適用于規(guī)?；B(yǎng)豬場的CSFV抗體監(jiān)測商品化試劑盒，這些試劑盒的靶標蛋白多為單獨的E2蛋白或Erns蛋白，而將E2蛋白和Erns蛋白同時作為靶標抗原建立的抗體檢測方法鮮有報道。為此，將以柔性氨基酸接頭GSGS串聯(lián)的Erns蛋白和E2蛋白主要抗原區(qū)在大腸桿菌中進行表達，對表達產(chǎn)物進行純化復(fù)性及活性鑒定，并在此基礎(chǔ)上建立基于Erns/E2主要抗原區(qū)串聯(lián)表達蛋白為檢測抗原的間接ELISA檢測方法(Erns/E2-ELISA)，通過對臨床樣本的檢測對該方法的特異性、敏感性及與進口抗體檢測試劑盒的符合率進行評價，開展CSFV抗體消長規(guī)律研究，旨在為CSFV血清學(xué)診斷試劑盒的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒及血清E.coliRosetta TM2(DE3)、原核表達載體pET-32a均購自寶生物工程(大連)有限公司；CSFV陽性血清國家參考品(編號Z99)、CSFV陰性血清國家參考品(編號Z100)購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；兔抗CSFV高免血清、CSFV陽性血清、CSFV陰性血清、豬繁殖障礙呼吸綜合癥病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)陽性血清、豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)陽性血清、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)陽性血清、口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,FMDV)陽性血清均為河南省動物免疫學(xué)重點實驗室制備保存。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ及質(zhì)粒提取試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；HRP-羊抗兔二抗、HRP-羊抗豬二抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；IPTG、氨芐青霉素(Amp)購自索萊寶科技有限公司；Ni-NTA親和層析填料(Ni2+柱)購自Novagen公司；BAC蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒購自Thermo公司；脫脂奶粉購自美國Amresco公司；酶標板購自無錫國盛生物工程有限公司；CSFV C株兔化弱毒活疫苗(傳代細胞源)購自廣東永順生物制藥股份有限公司；IDEXX CSFV抗體檢測試劑盒購自北京愛德士元亨生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 供試動物與免疫 選取4頭30日齡CSFV抗體陰性的健康仔豬，按照疫苗使用說明接種，用CSFV C株兔化弱毒活疫苗免疫，頸部肌肉深部注射，免疫前采血(0 d)，隨后分別在免疫后7、14、21、28、35、42、56 d采集非抗凝血各1份，靜置凝集析出血清，分裝后-20 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 基因合成及原核表達質(zhì)粒pET-32a-Erns/E2的構(gòu)建 根據(jù)CSFV兔化弱毒C株全基因組序列(GenBank: Z46258.1)設(shè)計核酸序列并使用大腸桿菌偏好性密碼子對其優(yōu)化，在序列兩端分別加上酶切位點EcoRⅠ和HindⅢ，含有目的基因的重組質(zhì)粒由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。設(shè)計1對特異性引物F:CGCGAATTCCGGCTAGCCTGCAAGGAAG(EcoRⅠ)，R:CGCAAGCTTCGGAAACATTGAAATTACATG(HindⅢ)用于目的基因的擴增。合成的CSFVErns/E2基因片段經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切后亞克隆至原核表達載體pET-32a中，經(jīng)菌液PCR、雙酶切鑒定送樣測序，測序結(jié)果用DNAStar軟件進行分析。將測序正確的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coilRosetta TM2(DE3)感受態(tài)細胞，用于重組蛋白表達。

1.2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達及可溶性分析 將重組菌株Rosetta TM2(pET-32a-Erns/E2)和對照菌株Rosetta TM2(pET-32a)表達菌體按1∶100比例分別接種于含50 mg/L Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min 過夜培養(yǎng)活化，將活化菌體按1∶100比例接種于含Amp抗性的LB培養(yǎng)液中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時，加入0.5 mmol/L的IPTG，37 ℃、220 r/min振蕩誘導(dǎo)，分別于1、2、4、6 h 收獲菌體，并將菌體進行超聲破碎，確定菌體是否為可溶性表達。

1.2.3 重組蛋白的純化及Western blot鑒定 收集發(fā)酵菌體，超聲破碎后12 000 r/min離心20 min得到包涵體，利用包涵體洗滌液(pH值8.0的20 mmol/L Tris-HCl，0.5 mmol/L EDTA，2 % Triton X-100)反復(fù)洗滌包涵體3次。然后加入變性液(8 mol/L尿素，0.1 mol/L NaH2PO4，10 mmol/L Tris-HCl，pH值8.0)，于4 ℃攪拌10 h溶解包涵體。4 ℃條件下12 000 r/min離心30 min，棄除沉淀，可溶上清經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，利用鎳柱進行純化，純化方法參照試劑盒說明書。利用SDS-PAGE、Western blot檢測重組蛋白純度。將純化的蛋白質(zhì)樣品轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯(PVDF)，轉(zhuǎn)膜時間為10 min，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將其置于封閉液(含5%脫脂奶粉的PBST)中，37 ℃封閉2 h，分別加入以封閉液1∶200稀釋的兔抗CSFV陽性血清，37 ℃溫育1 h，用PBST洗滌4次，加入1∶1 000 HRP標記的羊抗兔二抗，37 ℃溫育1 h，用PBST洗滌4次，AEC顯色后觀察結(jié)果。

1.2.4 包涵體的復(fù)性 將純化的變性包涵體蛋白分4批加入復(fù)性液[0.1 mmol/L Tris-HCl， pH值8.0，0.4 mol/L-鹽酸精氨酸，2 mmol/L EDTA，5 mmol/L還原型谷光苷肽(GSH)，0.5 mmol/L氧化型谷胱甘肽(GSSH)，0.1 mmol/L NaN3] 中，每次間隔12 h，使復(fù)性時間達到60 h，至尿素終濃度為0.5 mol/L。將復(fù)性液在4 ℃條件下8 000 r/min離心20 min，取上清，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后用超濾器濃縮，于pH值8.0的10 mmol/L Tris-HCl中4 ℃透析6次，每6 h換液一次，透析后的蛋白質(zhì)溶液在8 000 r/min 4 ℃條件下離心10 min，去沉淀留上清，以BCA法測定重組蛋白含量，過濾除菌后小量分裝凍存于-20 ℃。

1.2.5 Erns/E2-ELISA檢測方法的建立 在96孔板中采用方陣滴定法確定最佳抗原包被質(zhì)量濃度(0.5、1.5、2.5、3.5、4.5 mg/L)，CSFV陰性血清和陽性血清稀釋倍數(shù)(1∶50、1∶100、1∶200、1∶400)，封閉液(5%脫脂奶粉、1%BSA 和1%明膠)封閉1 h，HRP-羊抗豬二抗稀釋倍數(shù)(1∶500、1∶1 000、1∶2 500、1∶5 000)，孵育時間(30、60、90 min)，以TMB顯色劑顯色20 min，測定OD450確定最佳反應(yīng)條件。

采用優(yōu)化后的Erns/E2-ELISA方法檢測40份CSFV陰性的豬血清樣品，每份樣品重復(fù)3孔，取其平均值，計算總樣本OD450的平均值(X)和標準方差(SD)，根據(jù)統(tǒng)計學(xué)原理，算出臨界值X+3SD。當OD450≥X+3SD時，判為陽性；OD450

1.2.6 特異性試驗 利用上述建立的Erns/E2-ELISA方法分別對PRRSV、PRV、PCV2、FMDV陽性血清各5份進行檢測，同時設(shè)置CSFV陰性血清、陽性血清為對照。根據(jù)上述已確定的陰陽性臨界值判定檢測結(jié)果，驗證所建立的Erns/E2-ELISA方法的特異性。

1.2.7 敏感性試驗 分別將CSFV陽性血清國家參考品和CSFV陰性血清國家參考品進行1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600、1∶51 200 倍比稀釋，利用建立的Erns/E2-ELISA方法檢測，確定檢測出CSFV陽性血清國家參考品的最高稀釋度，以確定其敏感性。

1.2.8 重復(fù)性試驗 取3份已知的CSFV陽性血清和3份CSFV陰性血清，每份血清樣品重復(fù)3孔，采用同一批次包被的酶標板，利用建立的Erns/E2-ELISA方法進行批內(nèi)重復(fù)性試驗；采用不同批次包被的酶標板，檢測上述6份血清樣品，每份樣品重復(fù)3孔，進行批間重復(fù)性試驗。分別計算變異系數(shù)，驗證建立的Erns/E2-ELISA檢測方法的重復(fù)性。

1.2.9 臨床樣品檢測 采用本研究建立的Erns/E2-ELISA方法與IDEXX CSFV抗體檢測試劑盒對121份臨床隨機采取的血清樣品進行檢測，分析檢測結(jié)果，計算建立的檢測方法與IDEXX CSFV抗體試劑盒檢測結(jié)果的符合率。

1.2.10 CSFV抗體消長規(guī)律測定 選取30日齡的CSFV抗體陰性的健康仔豬4只，注射CSFV兔化弱毒活疫苗1 mL(1頭份/mL)，分別于30日齡(首免前0 d)，首免后7、14、21、28、35、42、49、56 d采血分離血清。利用建立的Erns/E2-ELISA方法檢測抗體變化規(guī)律，同時用IDEXX CSFV抗體檢測試劑盒進行平行對比試驗，按其使用說明書進行操作和判斷。

2 結(jié)果與分析

2.1 Erns/E2原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

將合成的Erns/E2融合基因克隆至pET-32a載體，構(gòu)建原核表達質(zhì)粒，將pET-32a-Erns/E2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Rosetta TM2(DE3)，并挑取單克隆提取質(zhì)粒進行酶切及PCR鑒定，電泳結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒酶切后得到預(yù)期的696 bp的目的片段和5 900 bp的載體片段，PCR擴增產(chǎn)物符合預(yù)期大小(圖1)，初步鑒定為陽性克隆。將陽性克隆送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，結(jié)果表明序列正確。

M1.λ-EcoT14 Marker；1.pET-32a-Erns/E2 EcoRⅠ和HindⅢ 酶

2.2 Erns/E2蛋白誘導(dǎo)表達及可溶性分析

將重組菌株Rosetta TM2(pET-32a-Erns/E2)和對照菌株Rosetta TM2(pET-32a)表達菌體在37 ℃用0.5 mmol/L的IPTG分別誘導(dǎo)1、2、4、6 h，收集菌體進行SDS-PAGE電泳，經(jīng)考馬斯亮藍染色后，可觀察到在分子質(zhì)量約43 ku處有明顯的蛋白質(zhì)表達條帶，與預(yù)計的目的蛋白分子質(zhì)量接近，且誘導(dǎo)后6 h表達量達到最大(圖2)?？扇苄苑治鼋Y(jié)果表明，表達的蛋白質(zhì)主要以包涵體形式存在。

M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1.未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET-32a；2.IPTG誘導(dǎo)的pET-32a；3.IPTG未誘導(dǎo)的pET-32a-Erns/E2；4—7.pET-32a-Erns/E2 IPTG誘導(dǎo)1、2、4、6 h；8.IPTG誘導(dǎo)pET-32a-Erns/E2 6 h超聲上清；9.IPTG誘導(dǎo)pET-32a-Erns/E2 6 h超聲沉淀

2.3 Erns/E2蛋白的純化和Western blot鑒定

將洗滌后包涵體蛋白用8 mol/L尿素溶解，經(jīng)鎳離子親和層析進一步純化，純化后的Erns/E2蛋白進行SDS-PAGE電泳鑒定，在約43 ku附近顯現(xiàn)單一條帶，與預(yù)期大小相符(圖3)，純度約為90%。用CSFV陽性血清對純化的重組蛋白進行Western blot鑒定，在相應(yīng)位置處有陽性反應(yīng)條帶(圖3)，表明表達的Erns/E2蛋白能夠與CSFV陽性血清特異性結(jié)合。

M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1.Ni2+純化的Erns/E2蛋白;

2.4 Erns/E2蛋白的復(fù)性效率

經(jīng)測定和計算，終質(zhì)量濃度為0.300 g/L的變性純化蛋白復(fù)性后，得到終質(zhì)量濃度為0.135 g/L的復(fù)性蛋白，復(fù)性效率大于40%。

2.5 Erns/E2-ELISA檢測方法的建立

采用方陣滴定法確定 ELISA最佳反應(yīng)條件，結(jié)果顯示，Erns/E2蛋白最佳包被濃度為2.5 mg/L，血清最適稀釋倍數(shù)為1∶200，此時的P/N值最大。封閉條件以含5%脫脂奶粉的PBST 37 ℃封閉1 h效果最佳；HRP-羊抗豬二抗最佳稀釋度為1∶1 000，最佳反應(yīng)條件為37 ℃孵育1 h，TMB顯色20 min。利用建立的Erns/E2-ELISA 法對40份CSFV陰性豬血清進行檢測，計算陰性血清OD450平均值X為0.228，標準方差SD為0.034，陰陽性臨界值X+3SD=0.33。當待測樣品OD450≥0.33時，判為陽性；OD450<0.33時，判為陰性。

2.5.1 特異性試驗結(jié)果 利用建立的Erns/E2-ELISA方法對CSFV陽性血清、CSFV陰性血清及PRRSV、PRV、PCV2、FMDV陽性血清進行檢測，結(jié)果顯示，只有CSFV陽性血清檢測結(jié)果為陽性，其余均為陰性(圖4)。表明建立的Erns/E2-ELISA法具有良好的特異性。

PS:陽性血清；NS:陰性血清

2.5.2 敏感性試驗結(jié)果 將CSFV陽性血清國家參考品倍比稀釋后，利用建立的Erns/E2-ELISA方法進行檢測，結(jié)果顯示，當陽性血清稀釋到1∶12 800時仍為陽性，稀釋到1∶25 600后檢測為陰性(圖5)。可見，建立的檢測方法敏感性為1∶12 800，敏感性較好。

PS:陽性血清；NS:陰性血清

2.5.3 重復(fù)性試驗結(jié)果 選取6份不同血清分別進行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗，結(jié)果顯示，批內(nèi)最大變異系數(shù)為4.22%，批間最大變異系數(shù)為5.67%，變異范圍均小于10%，表明本試驗建立的Erns/E2間接ELISA法具有較好的重復(fù)性。

2.5.4 符合率試驗結(jié)果 分別用建立的Erns/E2-ELISA方法和IDEXX CSFV 抗體檢測試劑盒檢測121份臨床血清樣品，結(jié)果見表1。由表1可知，Erns/E2-ELISA檢測方法的抗體陽性率為66.12%(80/121)，IDEXX CSFV 抗體檢測試劑盒的陽性率為62.81%(76/121)。與IDEXX CSFV 抗體檢測試劑盒相比，Erns/E2-ELISA方法的敏感性為92.11%(70/76)，特異性為77.78%(35/45)，符合率為86.78%(105/121)。

表1 Erns/E2-ELISA與IDEXX CSFV 抗體檢測試劑盒檢測結(jié)果的對比Tab.1 Comparison of Erns/E2-ELISA and IDEXX CSFV Ab test kit

2.6 CSFV抗體消長規(guī)律

利用Erns/E2-ELISA方法檢測CSFV疫苗免疫的血清樣品，并與IDEXX CSFV抗體檢測試劑盒檢測結(jié)果進行平行比較，檢測結(jié)果(圖6、圖7)表明，Erns/E2-ELISA方法最早可于接種后7 d檢測到CSFV抗體，21 d后均為陽性；IDEXX CSFV抗體檢測試劑盒最早于14 d檢測到CSFV抗體，28 d后均為陽性。2種方法在接種后35～42 d抗體達到最高水平，49～56 d開始趨于穩(wěn)定。

圖6 Erns/E2-ELISA檢測接種后CSFV抗體消長規(guī)律Fig.6 The dynamics of the antibody of CSFV evaluated by Erns/E2-ELISA after inoculation

圖7 IDEXX CSFV抗體檢測試劑盒檢測接種后CSFV抗體消長規(guī)律Fig.7 The dynamics of the antibody of CSFV evaluated by IDEXX CSFV Ab test kit after inoculation

3 結(jié)論與討論

通過CSFV抗體水平的監(jiān)測來制定合理、有效的免疫程序是提高群體免疫水平的保證，也是評價CSFV疫苗免疫效果的重要技術(shù)手段[17-19]。ELISA方法具有簡便、特異、靈敏及結(jié)果可靠等優(yōu)點，是目前國際上承認的唯一適合大規(guī)模應(yīng)用的CSFV抗體檢測方法。國外研究結(jié)果表明，被CSFV感染的豬血清在分別用Erns、E2蛋白的ELISA檢測結(jié)果中存在區(qū)別，一些在ErnsELISA或Erns多肽ELISA呈陽性反應(yīng)的血清在E2或E2多肽ELISA中卻呈陰性，反之亦然[20]。進一步的研究結(jié)果表明，同時含有Erns、E2免疫原區(qū)域的嵌合抗原與單獨的Erns或E2相比，提高了血清學(xué)診斷的敏感性，可最早在感染CSFV 7 d后在豬血清中檢測到CSFV抗體，對CSFV的早期診斷具有明顯的優(yōu)勢[21]。鑒于國內(nèi)目前已建立的CSFV抗體ELISA檢測方法多為采用單獨的E2或Erns蛋白作為包被抗原[22-24]的研究現(xiàn)狀，本研究在借鑒前人研究結(jié)果的基礎(chǔ)上利用原核表達系統(tǒng)高效表達了Erns串聯(lián)E2蛋白主要抗原區(qū)嵌合蛋白，Western blot鑒定結(jié)果表明，表達的目的蛋白可被CSFV多抗血清識別，說明融合后的Erns/E2蛋白仍具有生物學(xué)活性。將表達的包涵體蛋白經(jīng)純化和稀釋復(fù)性后建立了間接ELISA檢測CSFV抗體方法，利用該方法檢測CSFV陽性血清國家參考品，敏感性可高達1∶12 800，說明包涵體蛋白經(jīng)過復(fù)性后獲得了較高的CSFV抗體結(jié)合活性。對臨床121份血清樣品的檢測結(jié)果表明，建立的Erns/E2-ELISA檢測方法的抗體陽性檢出率為66.12%，高于IDEXX試劑盒的62.81%。與 IDEXX CSFV抗體檢測試劑盒相比，Erns/E2-ELISA符合率為86.78%，敏感性為92.11%，特異性為77.78%。利用上述2種方法同時評價CSFV C株疫苗免疫的4只30日齡仔豬抗體消長規(guī)律，Erns/E2 ELISA和IDEXX CSFV抗體檢測試劑盒分別于免疫后7 d和14 d開始檢出陽性，在免疫后35～42 d抗體水平達到高峰，49～56 d抗體趨于穩(wěn)定。檢測結(jié)果表明，二者的抗體變化規(guī)律一致性較好，Erns/E2-ELISA方法能夠和IDEXX CSFV抗體檢測試劑盒同時或提前監(jiān)測到抗體轉(zhuǎn)陽的時間點，敏感性更高，說明建立的檢測方法可以用于評價CSFV兔化弱毒疫苗免疫后血清抗體，從而為臨床CSFV疫苗免疫程序的制定提供參考。