王金多，李瀾瀟，徐慶陽

(天津科技大學 生物工程學院，天津 300450)

L-賴氨酸作為人和動物的八大必需氨基酸之一[1]，在醫(yī)療、畜牧業(yè)及食品工業(yè)得到了廣泛的應用。在醫(yī)療方面，用于治療由病毒引起的皰疹，有提高機體抵抗病毒的能力，L-賴氨酸和谷氨酸的復合鹽可用于腦部組織的保護[2]，并且對減少骨密度降低和鈣流失有效果。L-賴氨酸最主要的應用范圍是畜牧業(yè)，作為飼料添加劑，有助于提高禽畜的抗病性和生長速率，需求量巨大[3-5]。近些年來，各大企業(yè)爭相開展L-賴氨酸的生產(chǎn)。在食品工業(yè)中，L-賴氨酸作為營養(yǎng)補充劑，廣泛應用于谷物制品中，亦可作為調(diào)味品添加到食品中。由于L-賴氨酸的主要生產(chǎn)方式是發(fā)酵，如何有效地提高產(chǎn)量、提高葡萄糖-氨基酸轉(zhuǎn)化率、降低設備損耗、優(yōu)化分離提純工藝成為降低成本的關鍵[6]。

L-賴氨酸的發(fā)酵優(yōu)化方法有溶氧、在線控制pH和優(yōu)化培養(yǎng)基配比等，上述方法對提高L-賴氨酸的產(chǎn)量、減少副產(chǎn)物的積累和提高糖酸轉(zhuǎn)化率等有很好的作用[7-8]。為解決菌體生長后期菌體活力明顯減弱、產(chǎn)酸能力下降等問題，實驗通過全營養(yǎng)流加工藝，探究最適全營養(yǎng)流加濃度和最適流加時間[9-12]，達到長時間維持菌體穩(wěn)定期和高產(chǎn)酸速率[13]、防止早衰的目的[14]。實驗通過設置5個流加梯度，采用低速全程流加全營養(yǎng)的方法，并對比生物量、單位生長速率、L-賴氨酸產(chǎn)量和單位產(chǎn)酸速率等參數(shù)，確定最適宜的全營養(yǎng)流加濃度。根據(jù)已確定的最佳全營養(yǎng)流加濃度，采用流速為25 mL/h恒速分時流加全營養(yǎng)的方法，分析在菌體生長的不同階段流加全營養(yǎng)對發(fā)酵生物量、生長速率、L-賴氨酸產(chǎn)量、單位產(chǎn)酸速率等的影響，最終應用于實際生產(chǎn)中，提高L-賴氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率，降低后處理成本，在提高企業(yè)經(jīng)濟效益的基礎上實現(xiàn)綠色生產(chǎn)[15]。

1 材料與方法

1.1 菌種

谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)LS260：由天津科技大學代謝工程實驗室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

種子罐培養(yǎng)基：葡萄糖80 g/L，豆餅水解液15 mL/L，玉米漿干粉20 g/L，(NH4)2SO4·7H2O 6 g/L，KH2PO41.7 g/L，MgSO40.6 g/L，VB11.5 mg/L，VB51.5 mg/L，VB121.5 mg/L，VH2 mg/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖60 g/L，豆餅水解液20 mL/L，玉米漿干粉25 g/L，(NH4)2SO4·7H2O 5 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO41 g/L，VB11 mg/L，VB51 mg/L，VB121 mg/L，VH1.5 mg/L。

全營養(yǎng)培養(yǎng)基：一定濃度的發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.3 主要儀器

主要儀器設備見表1。

表1 儀器設備

1.4 培養(yǎng)方法

斜面培養(yǎng)：一代試管斜面活化2根，恒溫箱32 ℃培養(yǎng)24 h，二代茄形瓶斜面活化2支，恒溫箱32 ℃培養(yǎng)18 h。

種子罐培養(yǎng)：接種量2支茄形瓶，發(fā)酵體積2 L，培養(yǎng)溫度34 ℃，pH 7.0～7.2，溶氧45%以上，轉(zhuǎn)速與溶氧聯(lián)動，種子培養(yǎng)12～15 h。

發(fā)酵罐培養(yǎng)：接種量600 mL，發(fā)酵體積3 L,培養(yǎng)溫度34 ℃，pH 7.0～7.2，溶氧30%以上，轉(zhuǎn)速與溶氧聯(lián)動，發(fā)酵時間36 h。

1.5 實驗方法

1.5.1 梯度濃度低速全程流加全營養(yǎng)策略

分別配制發(fā)酵培養(yǎng)基濃度100%、75%、50%、25%的流加料，從發(fā)酵起始開始流加，全程以20 mL/h低速流加，至發(fā)酵36 h結(jié)束。

1.5.2 恒速分時流加全營養(yǎng)策略

根據(jù)1.5.1確定的最適全營養(yǎng)濃度，在發(fā)酵過程和菌體生長的不同狀態(tài)，分別選擇5，10，15，20 h恒速流加全營養(yǎng)，流加速度為20 mL/h。

1.6 檢測方法

1.6.1 pH值測定

采用梅特勒-托利多pH在線檢測，精密pH試紙輔助檢測。

1.6.2 菌體生物量測定

菌體生物量采用OD600吸光度法測定，發(fā)酵液用容量瓶稀釋特定倍數(shù)后，用可見光分光光度計測定吸光度，吸光度×稀釋倍數(shù)得到實際OD值，可以直接表示菌體生物量。

1.6.3 L-賴氨酸含量測定

發(fā)酵液中L-賴氨酸及副產(chǎn)物含量采用高效液相色譜法測定，采用Agilent C18色譜柱(15 mm×4.6 mm，3.5 μm)，衍生劑為2,4-二硝基氟苯，柱前衍生，流動相為50%的乙腈、4.1 g/L的醋酸鈉溶液，柱溫33 ℃，流速1 mL/min，檢測波長360 nm。

1.7 數(shù)據(jù)處理

糖酸轉(zhuǎn)化率SA計算公式為：

式中：ρ為L-賴氨酸質(zhì)量濃度，g/L；V為發(fā)酵液總體積，L；m為總耗糖量，g。

所有實驗數(shù)據(jù)取3次實驗的平均值。單因素方差分析之后采用Dunnett-t檢驗來確定數(shù)據(jù)差異的顯著性。

2 結(jié)果與討論

2.1 梯度濃度低速全程全營養(yǎng)流加策略

目前，在L-賴氨酸的發(fā)酵過程中，一般采用補料分批發(fā)酵，一次性投入底物培養(yǎng)基，過程中流加葡萄糖等碳源維持發(fā)酵。隨著發(fā)酵的進行，菌體細胞不斷翻倍，用以支持菌體生長的營養(yǎng)物質(zhì)濃度逐漸降低，導致發(fā)酵中后期常出現(xiàn)菌體活力下降。而在合適的發(fā)酵階段向培養(yǎng)體系中流加合適濃度的全營養(yǎng)則能有效解決上述問題，達到提高菌體活力，延緩菌體衰退，延長穩(wěn)定期及產(chǎn)酸高峰期的效果。

值得注意的是，過高的營養(yǎng)濃度可能也會使菌體生長受到抑制。因此，為了確定合適的全營養(yǎng)培養(yǎng)基濃度，本實驗設置100%、75%、50%、25%、0% 5個流加培養(yǎng)基濃度梯度，以0%為對照組，進行發(fā)酵優(yōu)化對比實驗[16]，探究不同全營養(yǎng)培養(yǎng)基濃度對L-賴氨酸發(fā)酵產(chǎn)酸的影響。過程中每隔2 h取樣，檢測生物量及L-賴氨酸產(chǎn)量，并計算菌體生長速率及糖酸轉(zhuǎn)化率，結(jié)果見圖1～圖4。

圖1 不同濃度恒速全程全營養(yǎng)流加對生物量的影響

圖2 不同濃度恒速全程全營養(yǎng)流加對生長速率的影響

圖3 不同濃度恒速全程全營養(yǎng)流加對產(chǎn)量的影響

圖4 不同濃度恒速全程全營養(yǎng)流加對產(chǎn)酸速率的影響

由圖1可知，流加濃度為0%，在發(fā)酵進行至20 h時，菌體生物量開始下降，菌體量從20 h開始明顯下降，菌體衰亡相對流加全營養(yǎng)組提前；流加濃度為50%時，最大菌體量為123.9，較對照組提高了33.8%，且流加全營養(yǎng)的4組的最終OD值都比對照組高。

由圖2可知，流加濃度為75%、50%、25%時都能有效地延緩菌體活力下降，并且在發(fā)酵前期能提高菌體的生長速率，流加濃度為50%時，6～8 h達到最大生長速率24.8%，較對照組提高了18.09%。

由圖3可知，流加濃度為75%、50%、25%時，L-賴氨酸產(chǎn)量相較對照組分別提高了21.6%、40.7%、15.6%，并且在全營養(yǎng)流加濃度為50%時，產(chǎn)量達到235 g/L，產(chǎn)量最高；全營養(yǎng)流加濃度為100%時，因流加全營養(yǎng)導致菌體營養(yǎng)中毒，發(fā)酵液中營養(yǎng)成分過剩，導致胞內(nèi)代謝流紊亂，產(chǎn)酸量低于對照組。

由圖4可知，流加濃度為75%、50%、25%時，L-賴氨酸產(chǎn)酸速率較對照組明顯提高，產(chǎn)酸速率分別提高了16.9%、30.8%、13.1%，但流加濃度100%相比對照組，產(chǎn)酸速率有所降低。

綜合上述實驗結(jié)果可知，通過在發(fā)酵過程中低速全程流加全營養(yǎng)策略，在適宜的流加濃度下，能有效提高菌體生物量，菌體在對數(shù)期生長速率有所提高，在發(fā)酵后期菌體衰退放緩，延長了菌體穩(wěn)定期和高速產(chǎn)酸期，解決了發(fā)酵后期由于營養(yǎng)不足引起的菌體活力不足的問題，使得產(chǎn)量較使用全營養(yǎng)流加策略前大幅提升。但發(fā)酵前期培養(yǎng)基底料營養(yǎng)十分充足，在這段時間流加全營養(yǎng)培養(yǎng)基有可能影響菌體生長，增加發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵液營養(yǎng)剩余，造成浪費、提取困難、產(chǎn)品質(zhì)量下降等問題[17]。

2.2 恒速分時流加策略

為了進一步優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)過程，提高產(chǎn)酸量和糖酸轉(zhuǎn)化率，并解決發(fā)酵前期因流加料導致培養(yǎng)基營養(yǎng)過剩、發(fā)酵后期菌體活力下降、產(chǎn)酸動力不足等問題，本實驗在1.5.1實驗方法的基礎上，結(jié)合2.1得出的實驗結(jié)果，進一步改進流加策略。流加料采用濃度為50%的發(fā)酵底物培養(yǎng)基，并對全營養(yǎng)流加的最佳開始時間進行探究。分別在發(fā)酵5，10，15，20 h開始流加全營養(yǎng)，直至發(fā)酵結(jié)束，分析在菌體生長的不同階段流加全營養(yǎng)對發(fā)酵生物量、生長速率、L-賴氨酸產(chǎn)量和單位產(chǎn)酸速率[18]等的影響，結(jié)果見圖5～圖8。

圖5 發(fā)酵不同時間流加全營養(yǎng)培養(yǎng)基對菌體生物量的影響

圖6 發(fā)酵不同時間流加全營養(yǎng)培養(yǎng)基對菌體生長速率的影響

圖7 發(fā)酵不同時間流加全營養(yǎng)培養(yǎng)基對產(chǎn)量的影響

圖8 發(fā)酵不同時間流加全營養(yǎng)培養(yǎng)基對產(chǎn)酸速率的影響

由圖5可知，對照組和5 h開始流加的組別菌體在22～25 h開始出現(xiàn)菌體衰亡。在發(fā)酵的10，15，20 h開始流加流加料，菌體生長速度均有提高；菌體生物量穩(wěn)定期延長，最終生物量分別較未流加流加料的對照組提高23.1%、16.1%、10.0%。

由圖6可知，10 h開始流加時，菌體生長速率下降放緩，最終生長速率平穩(wěn)。

由圖7可知，發(fā)酵5，10，15，20 h開始流加全營養(yǎng)，最后L-賴氨酸產(chǎn)量分別為218，255，220，181.5 g/L，相較于對照組167 g/L有明顯提高，分別提高了30.5%、52.7%、31.7%、8.7%。由實驗結(jié)果可知，5 h流加不能解除營養(yǎng)過剩導致的菌體中毒，導致菌體內(nèi)部代謝流紊亂，影響菌體產(chǎn)酸活力。發(fā)酵20 h流加，菌體已經(jīng)開始衰退，流加全營養(yǎng)無明顯效果。

由圖8可知，5，10，15 h的L-賴氨酸最高產(chǎn)酸速率分別為23%、42.2%、7.3%，相較于對照組明顯提高；20 h開始流加，已經(jīng)在發(fā)酵的后期，產(chǎn)酸高峰已經(jīng)結(jié)束，產(chǎn)酸速率相較于對照組無明顯變化。

綜合上述實驗結(jié)果可知，在發(fā)酵前期流加全營養(yǎng)，對菌體生物量、產(chǎn)酸能力、菌體活力有一定幫助，但效果不明顯；在菌體達到穩(wěn)定期，發(fā)酵剛開始進入高速產(chǎn)酸期時開始流加全營養(yǎng)，能夠長時間維持菌體活力和產(chǎn)酸能力[19]，延長高速產(chǎn)酸期，延緩菌體衰亡，有效地解決了發(fā)酵前期底物抑制和發(fā)酵后期菌體過早衰亡的問題；發(fā)酵后期流加全營養(yǎng)，此時菌體已經(jīng)開始衰亡，流加全營養(yǎng)可以恢復部分菌體活力，但效果不明顯，意義不大[20-21]。

2.3 全營養(yǎng)流加對糖酸轉(zhuǎn)化率的影響

由表2可知，在發(fā)酵時間同為36 h的條件下，優(yōu)化后的平均補糖速率比優(yōu)化前高40.06%，補糖量高出397 g，糖酸轉(zhuǎn)化率提高9%，產(chǎn)酸量提高52.7%。

表2 全營養(yǎng)流加對糖酸轉(zhuǎn)化率的影響

3 結(jié)論

在谷氨酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸的過程中，L-賴氨酸的產(chǎn)量及糖酸轉(zhuǎn)化率是評估菌株性狀和發(fā)酵產(chǎn)酸能力的核心指標。為解決發(fā)酵后期菌體活力不足、高速產(chǎn)酸期時間較短等問題，通過探究梯度濃度低速全程全營養(yǎng)流加策略，增強了發(fā)酵前期菌體的生長能力，提高了菌體生物量，延長了菌體生長穩(wěn)定期。全營養(yǎng)流加料為發(fā)酵培養(yǎng)基濃度50%時，L-賴氨酸產(chǎn)量大幅提高，達到235 g/L，比對照組提高了40.7%。為探究在不同發(fā)酵階段采用全營養(yǎng)流加策略對發(fā)酵產(chǎn)酸和糖酸轉(zhuǎn)化率等的影響，根據(jù)1.5.2的實驗方法，采用恒速分時流加策略，最終生物量為144，較優(yōu)化前提高了23.1%，L-賴氨酸產(chǎn)量為255 g/L，較優(yōu)化前提高了64.5%，糖酸轉(zhuǎn)化率為70.3%，較優(yōu)化前提高了9%。最終發(fā)現(xiàn)通過在發(fā)酵10 h時流加發(fā)酵培養(yǎng)基底物濃度50%的流加料效果最優(yōu)。采用全營養(yǎng)流加策略能有效地提高產(chǎn)量，一定程度上提高了糖酸轉(zhuǎn)化率。在工業(yè)生產(chǎn)中，在高速產(chǎn)酸期初始階段，可以采用流加發(fā)酵培養(yǎng)基濃度50%的全營養(yǎng)流加策略，能夠有效提高產(chǎn)量，提高糖酸轉(zhuǎn)化率，降低原料成本。