柴云雷， 王 鵬， 張 晟， 劉麗美， 郭 麗

（綏化學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，黑龍江綏化152061）

梨皮含有豐富的礦物質(zhì)、維生素、脂肪和蛋白質(zhì)等，營養(yǎng)價值較高。 梨皮具有清心潤肺、降火生津等功效，常用于治療暑熱煩渴、咳嗽、吐血等癥狀。 梨核含有多種維生素，尤其是維生素B 含量較多，此外梨核中還含有蛋白質(zhì)、糖類、阿拉伯膠和木質(zhì)纖維等營養(yǎng)物質(zhì)。 梨核的保健作用更優(yōu)于梨肉，具有清熱去火、潤腸通便、保護肝臟、降低膽固醇、預(yù)防心臟病和防癌抗癌等功效（陳倩穎等，2021；張想等，2021；關(guān)玉婷等，2021）。

菌體蛋白又稱單細胞蛋白（SCP）或微生物蛋白，主要是指酵母菌、細菌、放線菌、藻類等單細胞微生物利用工農(nóng)業(yè)廢氣、廢水、農(nóng)副產(chǎn)品下腳料、有機垃圾等為營養(yǎng)基質(zhì)， 在人工控制條件下培養(yǎng)得到的菌體蛋白質(zhì)。菌體蛋白中蛋白質(zhì)含量豐富，高達40% ~ 80%，且氨基酸種類齊全，因此常作為蛋白飼料的主要來源。 目前， 我國的蛋白飼料基本都是采用微生物發(fā)酵所得（王宇靈等，2019；趙彩艷等，2019； 劉雪蓮等，2009；Brahim，2005；Margareth，2001）。果渣中營養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，卻常被當(dāng)做廢棄物丟掉，這不僅造成資源浪費，還會污染環(huán)境。因此為實現(xiàn)廢物的再利用，可將其作為菌體蛋白飼料的生產(chǎn)原料（潘雄等，2021；田志梅等，2019；胡聰?shù)龋?017）。為進一步開發(fā)菌體蛋白飼料的生產(chǎn)原料提供理論依據(jù)，本研究以梨廢渣（包括梨皮和梨核）為原料，釀酒酵母為菌種進行發(fā)酵試驗研究， 采用響應(yīng)面設(shè)計法對發(fā)酵工藝條件進行優(yōu)化，以期獲得較高菌體蛋白含量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 梨：市售，梨皮切絲、梨核切塊后，65 ℃烘干24 h，粉碎過40 目篩，干燥保存?zhèn)溆?；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：中國普通微生物菌種保藏管理中心； 酵母膏胨葡萄糖瓊脂（YPD）的液體培養(yǎng)基：青島高科園海博生物技術(shù)有限公司； 尿素： 天津市致遠化學(xué)試劑有限公司；硫酸銅：天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備 101-2HSB 電熱鼓風(fēng)干燥箱：北京科偉永興儀器有限公司；RHP-400 型高速多功能粉碎機： 浙江永康市榮昊工貿(mào)有限公司；ZWY-100H 恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；XFH-30L 高壓蒸汽滅菌鍋： 浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；Kjeltec2300 全自動凱氏定氮儀：丹麥FOSS。

1.3 試驗方法

1.3.1 發(fā)酵種子液的制備 YPD 液體培養(yǎng)基的制備：稱取培養(yǎng)基樣品50 g，加熱溶解于1000 mL蒸餾水中，121 ℃高壓滅菌15 min，備用。

在無菌操作環(huán)境下，從釀酒酵母菌斜面上挑取一環(huán)，接種于YPD 液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h， 采用血細胞計數(shù)法測定細胞數(shù)，將細胞濃度調(diào)整為1×108cfu/mL （劉倩男，2016；劉壯壯，2014）。

1.3.2 梨廢渣固態(tài)發(fā)酵 稱取10 g 梨廢渣，20 mL蒸餾水于錐形瓶中， 并按試驗設(shè)計加入一定量的尿素， 攪拌至分散均勻，121 ℃高壓滅菌30 min后，備用。

取一定量的發(fā)酵種子液接種于梨廢渣固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)一定時間， 培養(yǎng)過程中適當(dāng)攪拌，待發(fā)酵結(jié)束后將樣品在45 ℃下鼓風(fēng)烘干，粉碎后測定其粗蛋白質(zhì)含量（寇慧等，2021；Dey，2016；Leite，2016）。

1.3.3 粗蛋白質(zhì)含量的測定 凱氏定氮法： 準(zhǔn)確稱取1 g 烘干粉碎后的樣品，置于消化管內(nèi)，加入CuSO40.4 g、K2SO46 g、濃H2SO420 mL 后，將消化管置于紅外線消化爐中，調(diào)節(jié)溫度400 ℃，至消化液完全澄清并呈綠色。消化結(jié)束后，用蒸餾水將消化液轉(zhuǎn)入100 mL 容量瓶并定容， 然后用移液管量取10 mL 稀釋后的消化液至干凈的消化管中， 放入凱氏定氮儀上進行蒸餾和吸收。 硼酸吸收后的樣液用0.1 mol/L 的HCl 標(biāo)準(zhǔn)溶液進行滴定，當(dāng)樣液顏色由藍色變?yōu)槲⒓t色時，即為滴定終點，記錄HCl 消耗的體積。 同時做一試劑空白試驗（除不加樣品外，從消化開始操作完全相同），記錄空白試驗消耗HCl 標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。

式中：V1為試液消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V2為試劑空白消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V3為吸取消化液的體積，mL；c為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度，mol/L；0.0140 為1.0 mL 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液相當(dāng)于氮的質(zhì)量，g；6.25 為氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)。 菌體蛋白含量的計算：

菌體蛋白含量/%=X×X1；

式中：X為發(fā)酵后梨廢渣培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)含量，%；X1為發(fā)酵前梨廢渣培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)含量，%。

1.3.4 單因素試驗設(shè)計（孫東立等，2021；懷寶東等，2020；黃裴，2017）。

1.3.4.1 尿素添加量對菌體蛋白含量的影響 梨廢渣培養(yǎng)基中尿素添加量分別為5%、6%、7%、8%、9%，釀酒酵母接種量為5%（V/m），28 ℃恒溫發(fā)酵3 d，攪拌3 次，發(fā)酵結(jié)束后測定粗蛋白質(zhì)含量。

1.3.4.2 接種量對菌體蛋白含量的影響 梨廢渣培養(yǎng)基中尿素添加量為7%， 釀酒酵母的接種量分別為1%、3%、5%、7%、9%，28 ℃恒溫發(fā)酵3 d，攪拌次數(shù)為3 次，發(fā)酵結(jié)束后測定粗蛋白質(zhì)含量。1.3.4.3 攪拌次數(shù)對菌體蛋白含量的影響 梨廢渣培養(yǎng)基中尿素添加量為7%， 釀酒酵母接種量為5%，28 ℃恒溫發(fā)酵3 d，攪拌次數(shù)分別為1、2、3、4、5 次，發(fā)酵結(jié)束后測定粗蛋白質(zhì)含量。

1.3.4.4 發(fā)酵時間對菌體蛋白含量的影響 梨廢渣培養(yǎng)基中尿素添加量為7%， 釀酒酵母接種量為5%，28 ℃恒溫發(fā)酵時間分別為1、2、3、4、5 d，攪拌次數(shù)為3 次，發(fā)酵結(jié)束后測定粗蛋白質(zhì)含量。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以菌體蛋白含量為響應(yīng)值，對影響菌體蛋白含量的尿素添加量、接種量、攪拌次數(shù)和發(fā)酵時間4 個因素的3 個水平進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗， 確定最佳發(fā)酵工藝條件，因素水平編碼見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平及編碼

1.4 數(shù)據(jù)處理 采用響應(yīng)面分析軟件Design-Expert 12.0 的Box-Behnken 中心組和原理進行試驗設(shè)計和數(shù)據(jù)分析。 采用OriginPro 8.5.1 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，每次試驗重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”形式。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 尿素添加量對菌體蛋白含量的影響 氮源在酵母菌的生長中是不可或缺的， 試驗中采用尿素這一常用氮源。由圖1 可知，隨著尿素添加量的增加，菌體蛋白含量逐漸增加。原因可能是適量的氮源供給有利于微生物的生長繁殖， 也有利于微生物在細胞內(nèi)合成氨基酸和堿基， 進而合成蛋白質(zhì)。 當(dāng)尿素添加量為8%時，菌體蛋白含量最高為5.49%。 當(dāng)繼續(xù)增大尿素添加量時，菌體蛋白含量呈下降趨勢， 原因可能是發(fā)酵后期可利用碳源逐漸減少，造成碳氮比不合理，使微生物的生長受到抑制， 也可能是未被利用的尿素水解釋放出NH4+，使得發(fā)酵環(huán)境的pH 改變，菌體生長受到影響，從而使菌體蛋白含量下降。故選擇尿素添加量為8%為宜。

圖1 尿素添加量對菌體蛋白含量的影響

2.1.2 接種量對菌體蛋白含量的影響 適當(dāng)?shù)慕臃N量有利于菌體的生長， 培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的合理利用及產(chǎn)物的生成。 由圖2 可知，菌體蛋白含量隨接種量的增大呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)菌體接種量為5%時， 菌體蛋白含量最大，為5.03%。 分析原因可能是接種量較低時，發(fā)酵底物充足，但利用營養(yǎng)物質(zhì)的微生物數(shù)量有限，使發(fā)酵底物得不到充分有效地利用， 因而菌體蛋白含量較低。 另外接種量較小，發(fā)酵菌種不能成為優(yōu)勢菌種，還會導(dǎo)致雜菌的生長繁殖，也會對發(fā)酵不利；接種量較大時，營養(yǎng)物質(zhì)消耗迅速，使微生物生長過于旺盛， 釋放大量的代謝熱導(dǎo)致周圍環(huán)境溫度升高，使菌體失活甚至死亡，同時代謝廢物也會大量積累， 這都不利于微生物的生長及蛋白的積累，導(dǎo)致菌體蛋白含量下降。故選擇接種量為5%為宜。

圖2 接種量對菌體蛋白含量的影響

2.1.3 攪拌次數(shù)對菌體蛋白含量的影響 攪拌次數(shù)的多少會影響錐形瓶中氧氣的多少， 即影響到培養(yǎng)基中溶氧的大小。由圖3 可知，菌體蛋白含量隨攪拌次數(shù)的增大呈先上升后下降的趨勢。 當(dāng)攪拌次數(shù)為3， 產(chǎn)生的菌體蛋白含量最大，為5.42%。 分析原因可能是攪拌次數(shù)的增大會提高發(fā)酵過程的溶氧量。 釀酒酵母為兼性厭氧菌，但厭氧菌在有氧氣的條件下會生長更好， 因為在厭氧條件下，所產(chǎn)生的乙醇不能進一步代謝，而在好氧條件下，一旦糖已全被耗盡，酵母菌就重新利用它們所產(chǎn)生的的乙醇并把它氧化成二氧化碳和水。 即好氧條件下利用一定量的糖比厭氧條件下獲得更高的酵母菌量。但若攪拌次數(shù)過多，會對菌體細胞產(chǎn)生損傷，不利于菌體生長繁殖。因此選擇最適的攪拌次數(shù)為3 次。

圖3 攪拌次數(shù)對菌體蛋白含量的影響

2.1.4 發(fā)酵時間對菌體蛋白含量的影響 發(fā)酵時間是影響菌體蛋白含量的重要因素， 發(fā)酵時間過短， 使培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)得不到有效充分的利用， 菌體生物量累積不足， 達不到理想的發(fā)酵目的；而發(fā)酵時間過長，營養(yǎng)物質(zhì)會被大量消耗，造成營養(yǎng)不足，引起微生物的內(nèi)源消耗，從而導(dǎo)致菌體自溶死亡，降低發(fā)酵產(chǎn)量，還容易滋生雜菌。 另外，發(fā)酵周期過長還會增加設(shè)備等運行維護成本。由圖4 可知，隨發(fā)酵時間的延長，菌體蛋白含量呈先增長后下降的趨勢。當(dāng)發(fā)酵時間為3 d 時，菌體蛋白含量最大，為5.30%，且此時培養(yǎng)基無不良氣味及孢子的產(chǎn)生，所以發(fā)酵時間選擇3 d 為宜。

圖4 發(fā)酵時間對菌體蛋白含量的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果 以尿素添加量、接種量、攪拌次數(shù)、發(fā)酵時間為自變量，菌體蛋白含量為響應(yīng)值， 進行梨廢渣發(fā)酵菌體蛋白響應(yīng)面方案設(shè)計， 試驗結(jié)果見表2。 將所得數(shù)據(jù)采用Design Expert 12.0 軟件進行多元擬合回歸分析，得到二次回歸方程：Y=5.65+0.2408A+0.2242B+0.1317C+0.1217D+0.16AB+0.0425AC+0.035AD-0.1325BC-0.06BD-0.195CD-0.4674A2-0.3349B2-0.3812C2-0.2162D2，相關(guān)系數(shù)R2=0.9668，說明有96.68%的數(shù)據(jù)可用此模型來進行表示，模型擬合度較好。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

根據(jù)表3 回歸模型方差分析可知，模型的P＜0.0001，為極顯著，說明該方程能夠準(zhǔn)確反映菌體蛋白含量與各因素之間的關(guān)系。 失擬項的P＞0.05， 為不顯著， 說明模型與試驗的擬合程度良好，差異值較小。 根據(jù)F 值和P值大小可知，各因素對菌體蛋白含量的影響順序依次為A＞B＞C＞D，即尿素添加量＞接種量＞攪拌次數(shù)＞發(fā)酵時間。

2.2.2 雙因素交互分析 由表3 方差分析可知，尿素添加量和接種量以及攪拌次數(shù)和發(fā)酵時間的交互作用達到極顯著水平（P＜0.01），說明其交互作用對菌體蛋白含量影響極顯著。 接種量和攪拌次數(shù)的交互作用對菌體蛋白含量影響顯著 （P＜0.05）。 為更直觀形象的說明因素間的交互作用對響應(yīng)值的影響，利用Design-Expert 12.0 軟件做交互項的響應(yīng)面圖和等高線圖，如圖5 所示。

表3 回歸模型方差分析

響應(yīng)面圖越陡峭、弧度越大，說明該因素對響應(yīng)值的影響越明顯，反之亦然。 從圖5 可知，尿素添加量和接種量的曲線相對于攪拌次數(shù)和發(fā)酵時間的曲線較陡， 說明尿素添加量和接種量對菌體蛋白含量影響顯著。 接種量曲線比攪拌次數(shù)的曲線陡峭，且沿著接種量變化，等高線相對密集，說明接種量的影響比攪拌次數(shù)的影響大。 等高線圖可以依據(jù)其圖形的形狀來判斷其交互影響的程度，圖形為橢圓則說明交互現(xiàn)象明顯，反之亦然。從圖5 可知，三組圖形均呈扁平橢圓狀，說明它們對菌體蛋白含量的影響均顯著。 其中攪拌次數(shù)和發(fā)酵時間的交互作用最強， 其次是尿素添加量和接種量以及接種量和攪拌次數(shù)， 這些都與回歸方程的方差分析結(jié)果一致。

圖5 不同影響因素交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖

2.2.3 最佳發(fā)酵工藝條件的確定 通過軟件進一步分析得出菌體蛋白的最佳發(fā)酵條件為：尿素添加量8.426%，接種量6.025%，攪拌次數(shù)3.021 次，發(fā)酵時間3.356 d，此時菌體蛋白含量為5.64%。 考慮到實際情況，將最終的發(fā)酵工藝條件修正為：尿素添加量8.4%，接種量6%，攪拌次數(shù)3 次，發(fā)酵時間3.35d，并在此條件下進行試驗驗證，重復(fù)試驗3 次取平均值，得到實際的菌體蛋白含量為5.62%。 該實際值與預(yù)測值相近，相對誤差僅為0.35%，說明由Box-Behnken 試驗設(shè)計所得的菌體蛋白的最佳發(fā)酵工藝條件準(zhǔn)確可靠，具有可行性。

3 結(jié)論

本研究以梨廢渣為原料，釀酒酵母為菌種生產(chǎn)菌體蛋白，通過采用響應(yīng)面分析法對發(fā)酵工藝進行優(yōu)化。 在單因素試驗基礎(chǔ)上，以菌體蛋白含量為響應(yīng)值，對尿素添加量、接種量、攪拌次數(shù)和發(fā)酵時間4 個因素進行Box-Behnken 試驗設(shè)計及優(yōu)化。研究表明， 各因素對菌體蛋白含量的影響均極顯著，影響順序依次為尿素添加量＞接種量＞攪拌次數(shù)＞發(fā)酵時間。 通過雙因素交互分析，得出尿素添加量和接種量以及攪拌次數(shù)和發(fā)酵時間的交互作用達到極顯著水平，對菌體蛋白含量影響極顯著。 優(yōu)化得出的最佳發(fā)酵條件為： 尿素添加量8.4%， 接種量6%，攪拌次數(shù)3 次，發(fā)酵時間3.35 d，在此條件下產(chǎn)生的菌體蛋白含量為5.62%。 該研究為進一步開發(fā)菌體蛋白飼料生產(chǎn)原料提供理論基礎(chǔ)。