岳 英，董錦華，肖月梅

(1.西安市胸科醫(yī)院婦兒科，陜西 西安 710100；2.榆林市第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科，陜西 榆林 719000)

非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)作為一種最常見且預后最差的惡性腫瘤之一，嚴重威脅了人類健康[1-2]。盡管早期的手術(shù)、放化療治療等可取得較好的治療效果，但是預后較差，大部分患者易發(fā)生遠端轉(zhuǎn)移，病死率較高[3]。隨著研究的不斷深入，人們逐漸意識到NSCLC的發(fā)展不但和腫瘤細胞自身特性相關(guān)，腫瘤微環(huán)境(Tumor microenvironment，TME)中基質(zhì)成分的變化也發(fā)揮了重要的作用。免疫細胞作為腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，可識別腫瘤相關(guān)抗原，發(fā)揮抗腫瘤效應；但其亦可與腫瘤細胞相互作用，建立免疫耐受，進而促進腫瘤的遷移[4-6]。研究亦發(fā)現(xiàn)，程序性死亡受體-配體1(Programmed death ligand-1,PD-L1)蛋白在許多人類腫瘤組織異常高表達，可起到抑制腫瘤抗原特異的T細胞增殖，促其凋亡的作用，在NSCLC的發(fā)展過程中起到重要作用[7-9]。目前關(guān)于免疫細胞及在NSCLC腫瘤局部的表達及其與臨床病理關(guān)系的研究較少，基于此，本研究檢測了NSCLC患者腫瘤免疫微環(huán)境中T細胞、巨噬細胞比率和PD-L1的表達，并深入探討其與腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月至2018年12月收治于本院腫瘤科的85例NSCLC患者為研究對象，其中男49例，女36例，平均年齡(62.50±7.78)歲。按照病理分類(WHO標準)包括腺癌56例，鱗癌29例；患者中I期40例，Ⅱ期16例，Ⅲ期20例，Ⅳ期9例；EGFR基因突變型35例，野生型50例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者29例，無轉(zhuǎn)移者56例。病例納入標準：①符合病理學診斷標準；②初次診斷并接受肺癌根治手術(shù)治療；③術(shù)前未接受過放化療、靶向治療；④患者年齡在40～75歲之間；⑤患者知情同意且經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。排除標準：①患有其他惡性腫瘤患者；②患有自身免疫性疾病及嚴重感染性疾病；③心臟病、糖尿病、肝腎功能不全者等；④抑郁、狂躁、精神分裂等精神系統(tǒng)疾病患者；⑤臨床信息缺失、不全者；⑥使用免疫抑制劑或增強劑患者。

1.2 研究方法

1.2.1 記錄研究對象年齡、性別、病理分類、臨床分期等一般指標。

1.2.2 樣本的選?。菏占中g(shù)切除的新鮮肺癌臨床組織，根據(jù)組織與癌灶的位置關(guān)系，分為對照組織、癌交界組織(癌旁組織)和癌灶組織。其中對照組織是指遠離癌組織5 cm以上的非癌組織部分；癌交界組織是指肉眼可見癌組織和正常組織交界部分；癌灶組織是指癌中心區(qū)到癌邊緣部分剔除掉壞死組織的部分。上述組織均是在臨床醫(yī)生指導下手術(shù)獲取的。

1.2.3 流式檢測：單細胞懸液的制備：將上述新鮮組織用預冷的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)充分沖洗，剪成米粒大小顆粒后，移入2 ml Ⅳ型膠原酶(0.1%濃度，Sigma)的1640培養(yǎng)基消化液中，37 ℃恒溫箱消化處理60 min，以含有10 ml 15%小牛血清的1640培養(yǎng)基終止消化；研磨處理并過濾篩選后(70 μm濾網(wǎng))，將濾液離心洗滌2次(1800 r/min×5 min)；細胞經(jīng)PBS懸重再次去除細胞團塊后獲得組織浸潤的單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度至1×108/ml用于后續(xù)檢測。

將細胞置于1640 完全培養(yǎng)基(0.1% PMA+ 0.1% Iono Mycin)中37 ℃刺激培養(yǎng)60 min后加入Brefeldin A(1∶1000)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止刺激。PBS充分洗滌離心后將1×108個細胞轉(zhuǎn)移至96孔板中，分別加入anti-CD3，anti-CD4流式抗體，混勻后4 ℃反應25 min，加入紅細胞裂解液100 ml，37 ℃下溶血10 min；PBS洗滌后以單標管建立多重流式檢測補償方案；依據(jù)該補償方案，將混合抗體加入單細胞懸浮液中，混勻后4 ℃下反應25 min，加入紅細胞裂解液100 ml，37 ℃下溶血10 min,PBS洗滌1次后，破膜打孔，加入對應標記的IgG同型對照胞內(nèi)抗體，繼續(xù)于4 ℃反應20 min；充分洗滌后，進行流式檢測。

1.2.4 PD-L1的表達:將切取的組織標本置于10%福爾馬林溶液中固定24 h，石蠟包埋。梯度乙醇浸泡、石蠟包埋、平面視網(wǎng)膜切片后，60 ℃烘烤25 min。脫蠟水化、蒸餾水浸泡后，蘇木素染色2 min水洗。隨后用鹽酸(0.5%濃度)、酒精浸泡10 s，0.5%伊紅溶液染色2 min。二甲苯溶液將其透明化后，中性樹膠封片晾干。

PD-L1表達判讀標準如下：肺部腫瘤組織細胞膜或細胞質(zhì)出現(xiàn)棕色或黃色顆粒為PD-L1染色陽性，其中腫瘤細胞中著色細胞占細胞總數(shù)小于1%記為0分，1%～10%記為1分，10%～50%記為2分，50%～100%計為3分；腫瘤細胞無染色記為0分，淡黃色記為1分，棕黃色記為2分，棕褐色計為3分。兩者相乘得分為PD-L1免疫組化結(jié)果：0分記陰性(-)，1～3分記弱陽性(+-)，4～6分記陽性(+)，7～9分記為強陽性(++)。陰陽性定義如下：0分為陰性、1分為弱陽性、2分為陽性、3分為強陽性。

2 結(jié) 果

2.1 患者一般臨床資料 85例NSCLC患者中男49例，女36例；年齡≥60歲57例，<60歲28例；病理類型：腺癌56例，鱗癌29例；EGFR基因突變的有35例，未突變的有50例；臨床分期：Ⅰ期40例，Ⅱ期16例，Ⅲ期20例，Ⅳ期9例；未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有56例，發(fā)生轉(zhuǎn)移的有29例；腫瘤分化：低分化22例，中分化54例，高分化9例。

2.2 NCSLC患者組織中CD4+T細胞和CD8+T細胞比率比較 NCSLC患者對照組織、癌旁組織與癌灶組織中CD4+T細胞和CD8+T細胞比率比較見表1。由表1可知，與對照組織相比，癌旁組織和癌灶組織的CD4+T細胞和CD8+T細胞比率均顯著高于對照組織，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。NCSLC患者腫瘤組織中CD4+T細胞和CD8+T細胞比率較癌旁組織顯著提高(P<0.05)。結(jié)果表明腫瘤組織中T淋巴細胞數(shù)量顯著增加，這可能導致免疫細胞比例失衡，不能準確識別和清除癌細胞，致使機體出現(xiàn)免疫功能障礙。

表1 NCSLC患者組織中CD4+T細胞和CD8+T細胞比率比較(%)

2.3 NCSLC患者腫瘤組織中CD4+T細胞和CD8+T細胞比率與臨床參數(shù)的關(guān)系 NCSLC患者腫瘤組織中CD4+T細胞和CD8+T細胞比率與臨床參數(shù)的關(guān)系見表2。由表2可知，NCSLC患者腫瘤組織中CD4+T細胞和CD8+T細胞比率與患者性別、年齡、病理類型以及腫瘤是否伴隨EGFR基因突變及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)，差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，與患者的腫瘤病理分析情況聯(lián)系緊密，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 NCSLC患者腫瘤組織中CD4+T細胞和CD8+T細胞比率與臨床參數(shù)的關(guān)系(%)

2.4 NCSLC患者組織中巨噬細胞比率比較 NCSLC患者對照組織、癌旁組織與癌灶組織中巨噬細胞比率比較見表3。由表3可知，與對照組織相比，癌旁組織和癌灶組織的巨噬細胞比率顯著低于對照組織，巨噬細胞M2型比率顯著高于對照組織，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。NCSLC患者腫瘤組織中巨噬細胞比率較癌旁組織進一步降低，巨噬細胞M2型比率較癌旁組織進一步升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)果表明腫瘤組織中與促炎癥因子釋放及激活免疫應答相關(guān)的M1型巨噬細胞比率降低，而與抗炎癥因子釋放及抑制免疫應答相關(guān)的M2型巨噬細胞比率升高，提示隨著腫瘤過程的進展，M2型巨噬細胞逐漸向腫瘤外擴散，誘導腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移。

表3 NCSLC患者腫瘤組織中巨噬細胞比率比較(%)

2.5 NCSLC患者腫瘤組織中巨噬細胞比率與臨床參數(shù)的關(guān)系 NCSLC患者腫瘤組織中巨噬細胞和M2型巨噬細胞比率與臨床參數(shù)的關(guān)系見表4。由表4可知，NCSLC患者腫瘤組織中巨噬細胞核M2型巨噬細胞比率與患者性別、年齡、病理類型、病理分期以及腫瘤是否伴隨EGFR基因突變及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)，差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。

表4 NCSLC患者腫瘤組織中巨噬細胞比率與臨床參數(shù)的關(guān)系(%)

2.6 PD-L1在不同NSCLC組織中的表達情況 見表5。與對照組相比，PD-L1在 NSCLC 患者癌旁組織和癌灶組織中陽性表達率均明顯高于對照組織，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；腫瘤組織中PD-L1陽性和強陽性表達較癌旁組織均顯著提高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明PD-L1可在一定條件下作為非小細胞肺癌檢測的分子標記物。

表5 PD-L1在不同NSCLC組織中的表達情況(例)

3 討 論

肺癌的發(fā)展不僅與肺癌細胞自身特性相關(guān)，亦與腫瘤細胞所處的免疫微環(huán)境密切相關(guān)[10-11]。T淋巴細胞在肺癌免疫微環(huán)境中發(fā)揮著殺傷癌細胞及免疫監(jiān)視的作用，具有識別T細胞受體、分泌多種細胞因子調(diào)節(jié)免疫應答的重要功能，在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。研究證實，腫瘤相關(guān)巨噬細胞及PD-L1蛋白的表達亦與NSCLC的進展息息相關(guān)[12-14]。

目前，關(guān)于免疫細胞及在NSCLC腫瘤局部的表達及其與臨床病理關(guān)系的研究較少[15-16]?；诖?，本研究選取了85例NSCLC患者為研究對象，采用流式細胞術(shù)檢測患者對照組織、癌旁組織和癌灶組織中CD4+T細胞、CD8+T細胞、巨噬細胞、M2型巨噬細胞比率，并探討其與臨床病理特征的關(guān)系。流式細胞檢測結(jié)果表明，NCSLC 患者癌旁組織和癌灶組織中CD4+T細胞、CD8+T細胞比率、M2型巨噬細胞比率均顯著高于對照組織(P<0.05)，巨噬細胞比率顯著低于對照組織；與癌旁組織相比，NCSLC 患者腫瘤組織中CD4+T細胞、CD8+T細胞比率、M2型巨噬細胞比率進一步升高，巨噬細胞比率進一步降低，差異具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。說明隨著肺癌進程的進展，腫瘤組織中T淋巴細胞數(shù)量和與抗炎癥因子釋放及抑制免疫應答相關(guān)的M2型巨噬細胞比率顯著增加，而與促炎癥因子釋放及激活免疫應答相關(guān)的M1型巨噬細胞比率降低，這將導致免疫細胞比例失衡，致使機體出現(xiàn)免疫功能障礙；且隨著腫瘤過程的進展，M2型巨噬細胞逐漸向腫瘤外擴散，誘導腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移[17-19]。T細胞、巨噬細胞與臨床病理特征的關(guān)系研究表明，NCSLC患者腫瘤組織中CD4+T細胞、CD8+T細胞比率、吞噬細胞及M2型吞噬細胞比率與患者性別、年齡、病理類型以及腫瘤是否伴隨EGFR基因突變及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)(P>0.05)；CD4+T細胞、CD8+T細胞比率與患者的腫瘤病理分期情況聯(lián)系緊密，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。免疫組化結(jié)果表明，腫瘤組織中PD-L1陽性和強陽性表達較癌旁組織均顯著提高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示PD-L1可作為NCSLC有效診斷的分子標記物。

綜上所述，本研究結(jié)果提示在NSCLC中CD4+T細胞、CD8+T細胞、M2型巨噬細胞比率較高，巨噬細胞比率較低，說明其共同參與機體抗腫瘤免疫應答，促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，對于NSCLC的生長和轉(zhuǎn)移具有重要意義；此外，PD-L1蛋白在NSCLC腫瘤組織中高表達，可將其作為NSCL患者診斷的分子標記物。即NSCLC 患者免疫微環(huán)境中多種免疫細胞參與腫瘤的生長，并促進腫瘤的轉(zhuǎn)移。