李世櫻，楊玲英 ，張棟梅，劉 勇

(1.簡(jiǎn)陽市人民醫(yī)院超聲科，四川 簡(jiǎn)陽 641400； 2.昆明醫(yī)科大學(xué)附屬心血管病醫(yī)院，云南 昆明 650000)

心房顫動(dòng)(Atrial fibrillation，AF)是多種因素造成的心房結(jié)構(gòu)的改變，進(jìn)而以快速無序的顫動(dòng)波代替整齊有序的電傳導(dǎo)致使心律失常的一種心血管疾病，簡(jiǎn)稱房顫[1]。研究[2]表明房顫導(dǎo)致的心房電活動(dòng)紊亂，促使患者出現(xiàn)血栓、心力衰竭、心房變性、外周血管栓塞、心動(dòng)過速性心肌病，甚至缺血性腦卒中等嚴(yán)重危及生命的并發(fā)癥。目前房顫的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，現(xiàn)有的治療手段和藥物不能使所有患者受益。因此尋找預(yù)防和控制房顫的手段，開展個(gè)體化的靶向治療，在臨床上具有重大意義。小分子RNA(microRNA，miRNA)是一類具有調(diào)控功能的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA。研究[3]表明,多種miRNA如miR-1、miR-133等因能調(diào)控心臟離子通道、鈣離子結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等相關(guān)基因的表達(dá)與心房顫動(dòng)直接相關(guān)。近來miR-499-5p在心房顫動(dòng)患者的表達(dá)異常引起關(guān)注。崔淯夏等[4]研究表明房顫患者在射頻術(shù)后外周血中miR-499-5p的表達(dá)明顯降低，推斷miR-499-5p可能成為房顫診斷與治療的靶點(diǎn)，但是就miR-499-5p對(duì)房顫影響的機(jī)制報(bào)道較少。L型鈣通道是細(xì)胞進(jìn)行鈣離子交換的主要途徑。研究[5]顯示L型鈣通道的異常直接導(dǎo)致心臟鈣平衡受損，進(jìn)而使心房結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，誘發(fā)心房電重構(gòu)。鈣通道電壓依賴性β1蛋白(Calcium channel voltage-dependent β1protein,CACNβ1)是L型鈣通道蛋白的β亞基。Kumfu等[6]報(bào)道提高CACNβ1的表達(dá)能明顯改善地中海缺血小鼠的心血管障礙，阻止心房有效不應(yīng)期(Atrial effective refractory period，AERP)的縮短，抑制心房結(jié)構(gòu)的重構(gòu)。本研究通過建立心房顫動(dòng)的動(dòng)物模型，從心房電重構(gòu)的角度探討miR-499-5p和 CACNβ1在房顫中的作用，希望為房顫的臨床治療提供一個(gè)新的靶向位點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:60只新西蘭雄性大白兔，體重2.5～3.2 kg，由我院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心從四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心采購，動(dòng)物的使用許可證號(hào)：SYXK(川)2018-185。

1.1.2 主要試劑:rAAV9-miR-499-5p-inhibitors、陰性對(duì)照rAAV9-miR-499-5p-inhibitors-NC由上海吉瑪生物有限公司設(shè)計(jì)完成。異氟烷、多聚甲醛采購自Sigma公司；HE試劑盒、JC-1試劑盒購自聯(lián)科生物技術(shù)公司；蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin-eosinstaining，HE)試劑盒購自南京建成生物技術(shù)公司；兔抗GAPDH、山羊抗兔IgG采購自美國abcam公司；Western blot試劑盒購自德國Rebstock公司。

1.1.3 主要儀器:Step One Plus熒光定量PCR儀，美國ABI公司產(chǎn)品； Nikon Eclipse Ti-SR熒光顯微鏡，日本尼康公司產(chǎn)品；Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-rad公司產(chǎn)品；TECNAI G2 20電鏡，美國TWIN FEI公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型構(gòu)建和分組處理：將新西蘭大白兔用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成四組(n=15)：假手術(shù)組(sham組)、模型組、miR-499-5p-inhibitors-NC組(對(duì)照組)和miR-499-5p-inhibitors組(實(shí)驗(yàn)組)。模型組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組參照文獻(xiàn)方法[7]，將實(shí)驗(yàn)兔以仰臥位固定在手術(shù)臺(tái)上，常規(guī)備皮，沿第3、4肋間，備皮，開胸，逐層剝離，暴露心臟，采用結(jié)扎左心耳的方法，將動(dòng)物心臟起搏器(起搏電壓5 V，起搏頻次600次/min)以及電生理刺激儀測(cè)試電極(保證電極導(dǎo)線與心房肌接觸良好)固定在左心房上，引出電極，關(guān)胸，縫合傷口。用慶大霉素沖洗起搏器囊袋，并固定在動(dòng)物背部脊柱旁。將起搏器和起搏電極連接固定，測(cè)試電極置于皮下，以測(cè)電生理指標(biāo)。術(shù)后所有動(dòng)物靜脈滴注青霉素抗感染。sham組開胸后只是固定心房電極，不起搏。模型組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組心房持續(xù)起搏3周后(每日對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行心電圖檢測(cè)，以確保起搏器正常工作)，常規(guī)喂養(yǎng)一周。術(shù)前48 h，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組分別以30 mg/kg劑量心臟冠脈注射[8]rAAV9-miR-499-5p-inhibitors-NC和rAAV9-miR-499-5p-inhibitors，另外兩組大白兔心臟冠脈注射等劑量的PBS緩沖液。實(shí)驗(yàn)過程中，sham組無死亡，模型組動(dòng)物術(shù)中因氣胸導(dǎo)致縱膈擺動(dòng)死亡2只，對(duì)照組動(dòng)物在復(fù)查心電圖中，發(fā)現(xiàn)一只因起搏閾值過高未能誘發(fā)房顫，實(shí)驗(yàn)組1只術(shù)中死亡，2只因起搏器電極脫位未能誘發(fā)房顫，因此每組動(dòng)物均以10只納入實(shí)驗(yàn)觀察。

1.2.2 心臟超聲檢査各組大白兔心臟結(jié)構(gòu)和功能的變化：將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以異氟烷腹腔注射麻醉，固定于手術(shù)臺(tái)，心臟彩超檢查心臟功能。記錄左心房最大容積(Left atrial maximal volume,LAVmax)，左心房最小容積(Left atrial minimal volume,LAVmin)，左心房射血分?jǐn)?shù)(Left atrial ejection fraction，LAEF)，左心房?jī)?nèi)徑(Left atrial diameter，LAD)等數(shù)據(jù)[9]。

1.2.3 各組實(shí)驗(yàn)大白兔電生理指標(biāo)AERP和房顫誘發(fā)率的測(cè)定:實(shí)驗(yàn)兔起搏3周后的AERP以S1S2程序遞減刺激法，輸出電壓的一半為起搏閾值通過電生理刺激儀進(jìn)行測(cè)定150 ms基礎(chǔ)周長(zhǎng)時(shí)的AERP150，設(shè)置S1S2間隔遞減掃描(S1S2=10∶1，步長(zhǎng)=10 ms)，重復(fù)測(cè)定3次。以40 ms 周長(zhǎng)Brust刺激心房10 s，以2.5倍閾值起搏，房顫持續(xù)時(shí)間大于1 s為成功誘發(fā)房顫，每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物誘發(fā)4次，間隔時(shí)長(zhǎng)30 s，成功誘發(fā)房顫的動(dòng)物只數(shù)與Brust刺激動(dòng)物總只數(shù)的比值即為房顫誘發(fā)率[10]。

1.2.4 各組大白兔心肌組織病理學(xué)以及超微結(jié)構(gòu)觀察:測(cè)試完畢，處死動(dòng)物，剝離心臟，取出10%心肌組織，常規(guī)固定，室溫下,HE染色，上熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。取出10%心肌組織，制成厚度約為2 mm的切片，TECNAI G2 20電鏡下觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。將余下動(dòng)物的心臟組織轉(zhuǎn)入深冷冰箱中待測(cè)。

1.2.5 JC-1染色法檢測(cè)各組大白兔的心肌細(xì)胞線粒體膜電位的變化:從冰箱中分別取出各組動(dòng)物10%的心肌組織，均漿，裂解，按線粒體提取試劑盒要求提取線粒體，JC-1工作液染色后，封片，鏡檢,Image-Pro Plus 6.0軟件分析圖像，以紅色熒光與綠色熒光的比值來評(píng)定各組大白兔心臟組織線粒體膜電位變化。

1.2.6 qRT-PCR檢測(cè)miR-499-5p和靶向鈣通道電壓依賴性β1蛋白(CACNβ1)的mRNA的表達(dá):從冰箱中取出各組動(dòng)物10%的心肌組織，采用常規(guī)方法提取心臟標(biāo)本中組織細(xì)胞的總RNA，PCR儀測(cè)定目標(biāo)序列的表達(dá)量。目的基因[11]miR-499-5p(上游引物為5’- GACAACATACTGCTAACCGACTC-3’，下游引物為5’- TCACTCTTCACCTGCTCCACTG-3’)，CACNβ1的mRNA(上游引物為 5’- TCTACGCAGTGCTTCTTTGCC-3’，下游引物為 5’- AAGGGGGATCTTCAGCTTTAGTA-3’)。

1.2.7 Western blot檢測(cè)各組大白兔心肌組織中CACNβ1蛋白的表達(dá):從冰箱中取出各組動(dòng)物10%的心肌組織，按照常規(guī)提取目標(biāo)蛋白，裂解勻漿器后離心，測(cè)定濃度。電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，加入一抗(均為1∶1000)，4 ℃孵育，過夜。次日，洗滌，加入二抗稀釋液(均為1∶10000)，顯色，以GAPDH作為內(nèi)參來表達(dá)目的蛋白的相對(duì)表達(dá)。

1.2.8 熒光素酶報(bào)告基因分析:以miR-499-5p mimic和mimic control轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞(HEK293)細(xì)胞，待細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，洗滌細(xì)胞，用含有目的蛋白CACNβ1的3’-非翻譯區(qū)(3’-untranslated region，UTR)或突變重組(pGL3-CACNβ1-MUT)載體以及Renilla標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)照pGL3再次轉(zhuǎn)染，通過熒光素酶檢測(cè)試劑盒(Dual-Glo luciferase assay system)檢測(cè)在48 h后測(cè)量細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，對(duì)應(yīng)熒光素酶活性數(shù)值為求出螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶數(shù)據(jù)比值的平均數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行，作圖工具采用Graphpad 5.01軟件，兩兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的心電圖監(jiān)測(cè)結(jié)果以及電生理參數(shù)比較 各組大白兔心電圖監(jiān)測(cè)如圖1所示，與sham組相比，模型組的AERP150明顯降低(P<0.05)，與模型組相比，抑制miR-499-5p的表達(dá)后，實(shí)驗(yàn)組的AERP150明顯升高(P<0.05)。模型組與對(duì)照組相比，差異不具有統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05)。

sham組大白兔為竇性心律，經(jīng)burst刺激未能誘發(fā)心房房顫，模型組以及對(duì)照組大白兔經(jīng)burst刺激后成功誘發(fā)房顫(持續(xù)時(shí)間不短于30 min)房顫誘發(fā)率明顯升高(P<0.05)，與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組的房顫誘發(fā)率明顯下降(P<0.05)。模型組與對(duì)照組相比，差異不具有統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05)。

A:sham組；B:模型組；C:對(duì)照組；D:實(shí)驗(yàn)組。與sham組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05

2.2 心臟彩超檢測(cè)各組大白兔的心功能變化 心臟彩超結(jié)果如圖2所示，與sham組相比，模型組左心房的LAD，LAVmax，LAVmin明顯升高(P<0.05)，與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物的LAD、LAVmax、LAVmin明顯降低(P<0.05)。模型組與對(duì)照組相比，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 實(shí)驗(yàn)大白兔的心臟損傷病理以及心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)觀察 HE染色結(jié)果如圖3所示，sham組心肌纖維呈帶狀分布，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，胞核性狀規(guī)則的定位于肌纖維中央，間質(zhì)無水腫情況，細(xì)胞連接緊密；模型組、對(duì)照組動(dòng)物心肌纖維排列紊亂，心肌橫紋消失，核質(zhì)界限不清，核膜破裂，間質(zhì)水腫明顯；與模型組心肌纖維的排列相比，實(shí)驗(yàn)組明顯規(guī)整，肌纖維變性較輕，間質(zhì)水腫明顯緩解。超微結(jié)構(gòu)結(jié)果如圖4所示：sham組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，性狀規(guī)整，核膜完整，胞核性狀規(guī)整，胞質(zhì)內(nèi)線粒體以及肌漿網(wǎng)數(shù)量豐富，線粒體嵴結(jié)構(gòu)清晰可辨，無腫脹，無異常；與sham組相比，模型組、對(duì)照組動(dòng)物心肌纖維溶解明顯，胞核明顯擴(kuò)張，變形明顯，線粒體出現(xiàn)空泡樣變性，嵴結(jié)構(gòu)不規(guī)則，或融合、或缺失、或重疊嚴(yán)重，胞膜凹陷明顯；實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物的心肌線粒體損傷明顯緩解，嵴結(jié)構(gòu)損傷程度較模型組明顯減輕，心肌纖維排列較為規(guī)則，病變程度明顯得到緩解。

A:sham組；B:模型組；C:對(duì)照組；D:實(shí)驗(yàn)組。與sham組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05

A:sham組；B:模型組；C:對(duì)照組；D:實(shí)驗(yàn)組

2.4 JC-1染色法檢測(cè)各組大白兔的心肌細(xì)胞線粒體膜電位的變化 各組大白兔心肌線粒體膜電位的檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，與sham組相比，模型組動(dòng)物心肌細(xì)胞紅色熒光與綠色熒光的比值明顯降低，說明線粒體膜電位明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組大白兔心肌細(xì)胞紅色熒光與綠色熒光的比值明顯升高，說明線粒體膜電位明顯升高(P<0.05)。模型組與對(duì)照組相比，差異不具有統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05)。

2.5 各組大白兔心肌中miR-499-5p和CACNβ1的mRNA和蛋白的表達(dá)情況 各組大白兔心肌中的miR-499-5p和CACNβ1的mRNA和蛋白的表達(dá)結(jié)果如圖6所示，與正常組相比，模型組miR-499-5p的表達(dá)明顯升高，CACNβ1的mRNA和蛋白的表達(dá)明顯降低(P<0.05)；和模型組相比，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組miR-499-5p的表達(dá)明顯降低，CACNβ1的mRNA和蛋白的表達(dá)明顯升高(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組比較，蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.6 熒光素酶報(bào)告基因分析結(jié)果 miR-499-5p和CACNβ1的蛋白和mRNA的變化趨勢(shì)具有明顯的關(guān)聯(lián)性，通過生物信息網(wǎng)站(www.microrna.org)上查詢miR-499-5p和CACNβ1存在特異性結(jié)合位點(diǎn)。采用雙熒光素酶報(bào)告基因分析來觀察兩者的關(guān)系結(jié)果如圖7示，轉(zhuǎn)染miR-499-5p后，野生型CACNβ1的熒光素酶活性被抑制(P<0.05)，突變型CACNβ1的熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)，說明 miR-499-5p能靶向調(diào)控CACNβ1的表達(dá)。

A:sham組；B:模型組；C:對(duì)照組；D:實(shí)驗(yàn)組。與sham組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05

A:sham組；B:模型組；C:對(duì)照組；D:實(shí)驗(yàn)組。與sham組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05

圖7 miR-499-5p靶向調(diào)控CACNβ1的表達(dá)

3 討 論

目前隨著人口老齡化的進(jìn)程，發(fā)病率以及致殘率逐年升高的房顫，成為威脅公眾健康的重要疾病。隨著將導(dǎo)管射頻消融術(shù)的出現(xiàn)，房顫的治療技術(shù)有了較為明顯的提高，但是其費(fèi)用昂貴、操作要求嚴(yán)格以及設(shè)備的限制，難以使所有的患者獲益[12]。房顫的分子生物學(xué)機(jī)制，闡明其發(fā)展歷程，尋求房顫治療的新方案，改善患者的心臟功能，仍是臨床醫(yī)師面臨的重大挑戰(zhàn)。

最新的研究顯示[13]心房重構(gòu)主要是由病理損傷或者負(fù)荷改變導(dǎo)致的心臟大小、形狀、組織以及功能等隨之改變，是心房修復(fù)、繼發(fā)以及代償性疾病的生理病理進(jìn)程。研究表明心房重構(gòu)是心房顫動(dòng)的基礎(chǔ)病理改變。越來越多的實(shí)驗(yàn)證實(shí)[14]了miRNA直接參與心房重構(gòu)的病理學(xué)進(jìn)程。Lan等[15]研究表明作為內(nèi)源性的調(diào)控基因，miR-101通過調(diào)控心肌細(xì)胞的離子通道蛋白的合成，干預(yù)跨膜離子流，影響心肌細(xì)胞的觸發(fā)活性，進(jìn)而影響心房的電重構(gòu)；Yun等[16]研究證實(shí)miR-34a能影響膠原纖維的積聚，調(diào)控膠原蛋白的表達(dá)，影響心房的結(jié)構(gòu)重構(gòu)。miR-499-5p與心血管疾病的關(guān)系引起廣泛關(guān)注。Xin等[17]研究表明作為肌球蛋白Myh7b基因家族中成員，miR-499-5p在急性心肌梗死患者的外周血中高表達(dá)，過表達(dá)的miR-499-5p影響鈉離子通道蛋白的表達(dá)，誘發(fā)了心房電重構(gòu)。Silva等[18]研究報(bào)道在心肌缺血再灌注損傷大白兔模型中抑制miR-499-5p的表達(dá)，能增強(qiáng)心肌細(xì)胞中線粒體膜的穩(wěn)定性，改善動(dòng)物在損傷中的心臟重構(gòu)。本研究中冠脈注射rAAV9-miR-499-5p-inhibitors后，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物的AERP150明顯升高，房顫誘發(fā)率明顯下降，動(dòng)物的心房電重構(gòu)明顯受限。病理學(xué)以及超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物的心肌損傷以及線粒體損傷明顯緩解，線粒體膜電位有所恢復(fù)，證實(shí)抑制miR-499-5p的表達(dá)后，慢性房顫實(shí)驗(yàn)兔的心房重構(gòu)有所改善。

L型鈣通道是控制鈣離子進(jìn)出心肌細(xì)胞的電壓依賴性的通道。該通道與心肌細(xì)胞的物質(zhì)與能量代謝中的生理活動(dòng)密切相關(guān)[19]。王增夏等[20]報(bào)道作為L(zhǎng)型鈣通道的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)成分，CACNβ1能夠調(diào)控心肌細(xì)胞的L-鈣電流，直接影響房顫進(jìn)程。高杰等[21]通過表達(dá)譜芯片技術(shù)以及miRNA芯片分析顯示與健康成人相比，CACNβ1基因在永久性房顫患者的左房組織中的表達(dá)明顯降低。Ling等[22]研究證明CACNβ1和miR-499在對(duì)慢性房顫的中具有潛在的臨床診斷價(jià)值。本研究從生物信息網(wǎng)站獲知miR-499-5p和CACNβ1之間存在特異性結(jié)合位點(diǎn)，雙熒光素酶報(bào)告基因分析結(jié)果顯示miR-499-5p能靶向調(diào)控CACNβ1的表達(dá)，并且抑制miR-499-5p的表達(dá)后實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物心肌中CACNβ1的表達(dá)明顯升高。

綜上所述，miR-499-5p在慢性心房顫動(dòng)動(dòng)物模型動(dòng)物中表達(dá)升高，抑制其表達(dá)能明顯改善動(dòng)物的心臟功能，抑制其心房重構(gòu)，這可能與靶向調(diào)控CACNβ1的表達(dá)有關(guān)。但是如何將miR-499-5p的靶向作用應(yīng)用到房顫的臨床治療中還需更深入的研究。