朱丹，楊良瑞，應(yīng)佐華

心房顫動(dòng)（房顫，AF）是臨床常見的心律失常之一，其發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)[1]。近年來，隨著對(duì)房顫基礎(chǔ)理論及相關(guān)臨床實(shí)踐研究的不斷深入，觀察到心房電重構(gòu)會(huì)引起有效不應(yīng)期的縮短、延長或不協(xié)調(diào)，而結(jié)構(gòu)的重構(gòu)會(huì)引起電信號(hào)在心房內(nèi)傳導(dǎo)不及時(shí)，繼而引起心房收縮功能障礙[2]。MicroRNA（miRNA）是近年來發(fā)現(xiàn)的一類高度保守的、可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)的非編碼小分子RNA[3]。既往研究發(fā)現(xiàn)，microRNA參與細(xì)胞的增殖、分化及凋亡等多種信號(hào)過程[4]。新近研究表明，心肌細(xì)胞具有特異性的miRNA表達(dá)譜，且miRNA與心肌細(xì)胞的衰老及凋亡的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。miRNA在心肌細(xì)胞的生長發(fā)育以及多種心血管疾病特別是心律失常中發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色[5,6]。在房顫的發(fā)生發(fā)展過程中，對(duì)于相關(guān)miRNA參與心肌細(xì)胞凋亡過程的機(jī)制研究也愈來愈重要。探尋miRNA參與及調(diào)控房顫患者心肌細(xì)胞凋亡的過程以及其作用機(jī)制，將為廣大患者帶來新穎和有效的治療理念及方法。因此，本文就miR-29a對(duì)房顫模型大鼠心房肌細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制進(jìn)行相關(guān)研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 6～8周SPF級(jí)SD大鼠25只，體重200～220 g，由杭州市動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)量合格證號(hào)：SCDK（湘）2019-0027]。采用乙酞膽堿-氯化鈣（ACH-CaCl2）混合液尾靜脈注射法對(duì)20只SD大鼠連續(xù)給藥4周制作房顫動(dòng)物模型（模型組），另5只常規(guī)飼養(yǎng)作為陰性對(duì)照組[7]。停藥后記錄大鼠的心電圖，模型組大鼠出現(xiàn)P波消失，代替為小f波，頻率在350～600 次/min的典型房顫心電圖則表示大鼠房顫造模成功（圖1）。所有大鼠采用尾靜脈空氣栓塞方式處死，取其心臟組織用于實(shí)驗(yàn)室提取和培養(yǎng)原代心房肌細(xì)胞，以供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。MTT試劑盒（上海碧云天生物有限公司）；Annexin-Ⅴ凋亡檢測(cè)試劑盒（美國Sigma公司）；SP600125（美國Sigma公司）；Western Blotting 試劑盒（上海碧云天生物有限公司）；BCA蛋白測(cè)定試劑盒（中國杭州四季青有限公司）；其他試劑均由長沙塞維爾生物公司提供。

1.2 大鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)、分組和轉(zhuǎn)染 采用尾靜脈空氣栓塞方式處死大鼠，在無菌操作臺(tái)上，分別取模型組及陰性對(duì)照組大鼠心臟置于培養(yǎng)皿中，加入適量PBS漂洗，清洗后取大鼠心房部位。剪碎成1～3 mm3的小塊。向培養(yǎng)皿中加入0.1%的Ⅱ型膠原酶和0.1%的胰蛋白酶混合液，37℃恒溫箱中消化25 min。將消化好的懸液置于15 ml離心管中1500 rpm/min低速離心10 min，去上清液獲得原代心房肌細(xì)胞。將獲得的原代心房肌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞分組與處理方法如下：①陰性對(duì)照組：取對(duì)照組大鼠的原代心房肌細(xì)胞不加任何藥物處理；②模型組：模型組大鼠原代心房肌細(xì)胞，不加任何藥物處理；③miR-29a inhibitor組：給予大鼠的原代心房肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染終濃度為50 nmol/L的miR-29a inhibitor，具體轉(zhuǎn)染方法依照轉(zhuǎn)染試劑盒操作說明進(jìn)行；④SP600125組：給予大鼠的原代心房肌細(xì)胞加入20 mmol/L的JNK抑制劑（SP600125）；⑤SP600125+miR-29a inhibitor組：給予大鼠的原代心房肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染50 nmol/L的miR-29a inhibitor，并加入20 mmol/L的SP600125。此外，5組細(xì)胞均置于37℃，5%二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.3 MTT和Annexin-Ⅴ凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 各組細(xì)胞培養(yǎng)后，按照MTT試劑盒和Annexin-Ⅴ凋亡檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)細(xì)胞活力和細(xì)胞的凋亡情況。

1.4 Western blotting 各組細(xì)胞培養(yǎng)后，采用預(yù)冷的PBS溶液清洗3次，采用Western blot試劑盒對(duì)原代培養(yǎng)心房肌細(xì)胞進(jìn)行蛋白定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 沉默miR-29a對(duì)房顫大鼠心房肌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞活力的影響 將miR-29a inhibitor轉(zhuǎn)染房顫大鼠心房肌細(xì)胞中作用48 h后，通過Annexin-Ⅴ/PI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，研究發(fā)現(xiàn)，與陰性對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞凋亡明顯上升；與模型組相比，miR-29a inhibitor組細(xì)胞凋亡明顯下降（圖2A）。采用MTT方法檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，模型組的細(xì)胞活力明顯下降，與模型組相比，miR-29a inhibitor組細(xì)胞活力明顯提高（圖2B）。檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與陰性對(duì)照組相比，模型組的Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著下降，Bax蛋白的表達(dá)顯著上升（P＜0.05，圖3A），與模型組相比，miR-29a inhibitor組Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著升高，Bax蛋白的表達(dá)顯著下降（P＜0.05，圖3B）。

圖1 正常大鼠及房顫大鼠心電圖（A為正常大鼠心電圖，B為房顫模型組大鼠心電圖）

圖2 miR-29a inhibitor對(duì)房顫大鼠心房肌細(xì)胞凋亡的影響

圖3 miR-29a inhibitor對(duì)房顫大鼠心房肌細(xì)胞凋亡蛋白的影響

2.2 抑制JNK信號(hào)對(duì)房顫大鼠心房肌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞活力的影響 將SP600125J（NK抑制劑）轉(zhuǎn)染房顫大鼠心房肌細(xì)胞中作用48 h后，通過Annexin-Ⅴ/PI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)通過轉(zhuǎn)染SP600125抑制JNK后，與陰性對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞凋亡明顯上升；與模型組相比，SP600125組細(xì)胞凋亡明顯下降（圖4A）。采用MTT方法檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞活力明顯下降；與模型組相比，SP600125組細(xì)胞活力顯著上升（圖4B）。檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與陰性對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞的Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著下降（P＜0.05，圖5A），Bax蛋白的表達(dá)顯著升高（P＜0.05，圖5B）；與模型組相比，SP600125組細(xì)胞的Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著升高（P＜0.05，圖5A），而Bax蛋白的表達(dá)顯著下降（P＜0.05，圖5B）。

圖4 SP600125對(duì)房顫大鼠心房肌細(xì)胞凋亡的影響

圖5 SP600125對(duì)房顫大鼠心房肌細(xì)胞凋亡蛋白的影響

2.3 房顫大鼠心房肌細(xì)胞凋亡機(jī)制 與陰性對(duì)照組相比，模型組p-JNK表達(dá)顯著上升（圖6）；與模型組相比，miR-29a inhibitor組、SP600125組和SP600125+miR-29a inhibitor 組的心房肌細(xì)胞p-JNK蛋白的表達(dá)均明顯下降（圖6）。以上結(jié)果表明miR-29a可能通過抑制JNK信號(hào)通路進(jìn)而抑制房顫大鼠心房肌細(xì)胞的凋亡。

圖6 房顫大鼠心房肌細(xì)胞p-JNK表達(dá)

3 討論

目前，臨床上對(duì)于房顫患者的治療方法還是以藥物轉(zhuǎn)復(fù)、射頻消融術(shù)等方法為主，或者另外以控制心室率及抗凝藥物以及左心耳封堵預(yù)防血栓栓塞為主[8]。房顫經(jīng)射頻消融術(shù)最主要的并發(fā)癥仍然是術(shù)后復(fù)發(fā)房顫，然而保守治療除了一方面需要長期口服抗凝藥物，另一方面是需患者有極高的依從性[9-11]。盡管目前抗凝治療的方法能有效預(yù)防房顫后腦卒中的發(fā)生，但我國房顫患者的抗凝藥物使用率仍然不理想[12]。最近研究表明，以microRNA為治療靶點(diǎn)的治療方式可成為治療房顫的新策略[13]。大量研究表明miR-29a在成熟組織中表達(dá)，尤其是心臟、腎臟和肺組織中表達(dá)明顯[14]。

MicroRNAs（miRNAs）是一種短序列的非編碼RNA，可以特異性與靶向mRNA結(jié)合，通過降解或者抑制蛋白質(zhì)的翻譯來發(fā)揮調(diào)控的功能。在哺乳動(dòng)物中，這些小的非編碼RNAs參與了生物體的生長、發(fā)育、衰老及死亡的調(diào)控[15]。因此，miRNAs肯定也參與了房顫患者心房肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展過程，且已被大量研究所證實(shí)[16,17]。近年來，miRNA調(diào)控機(jī)體細(xì)胞生理以及參與各種疾病的機(jī)制得到快速的發(fā)展。如miR-375在T2DM中通過調(diào)節(jié)胰島素的分泌發(fā)揮重要的作用[16]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)房顫患者心肌細(xì)胞中包括miR-29a在內(nèi)的miRNAs的表達(dá)水平降低，且與心肌細(xì)胞凋亡的程度呈負(fù)相關(guān)[17]。研究證實(shí)過表達(dá)miR-29a對(duì)大鼠心肌細(xì)胞的凋亡有抑制作用，但對(duì)于miR-29a在房顫模型大鼠的心房肌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，未見有詳細(xì)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)房顫模型大鼠的心房肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-29a inhibitor后，進(jìn)行細(xì)胞活力的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活力顯著上升，且抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)量也明顯上升（P＜0.05），相反Bax凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（P＜0.05）。結(jié)果說明抑制miR-29a的表達(dá)可拮抗房顫模型大鼠的心房肌細(xì)胞細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展。

早期大量研究報(bào)道，JNK信號(hào)通路可被多種細(xì)胞因子（如TNF-α、IL-6、EGF等）、應(yīng)激（如紫外線、電離輻射、氧化應(yīng)激等）以及某些G蛋白偶聯(lián)受體激活，參與機(jī)體組織細(xì)胞的凋亡與壞死。當(dāng) JNK被不同的刺激因子激活后，其轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，激活其下游作用底物-核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子（c-Jun），并磷酸化形成有活性的p-JNK，而這些被磷酸化后有活性的p-JNK進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和分化。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)房顫模型大鼠的心房肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染SP600125（JNK抑制劑）后，JNK信號(hào)被抑制，通過檢測(cè)細(xì)胞活力，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活力明顯增高，且抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)量上升明顯（P＜0.05），凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（P＜0.05）。結(jié)果說明，拮抗JNK信號(hào)的表達(dá)對(duì)房顫模型大鼠的心房肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展具有一定的抑制作用。進(jìn)一步說明JNK信號(hào)通路參與了miR-29a對(duì)房顫模型大鼠的心房肌細(xì)胞凋亡過程的調(diào)控，即抑制JNK信號(hào)通路可對(duì)房顫模型大鼠心房肌細(xì)胞的凋亡起抑制作用。

綜上所述，阻斷miR-29a具有抑制房顫模型大鼠心房肌細(xì)胞凋亡的作用，其作用機(jī)制可能通過JNK信號(hào)通路來抑制房顫大鼠模型的心房肌細(xì)胞的凋亡。