周霞， 黃佳， 瞿祥， 李亞騏， 朱加應(yīng)， 姜海行

(1.貴州省人民醫(yī)院 急診內(nèi)科， 貴州 貴陽(yáng) 550000； 2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科， 廣西 南寧 530000)

慢性肝病是目前全球面臨的重大衛(wèi)生健康問(wèn)題，其病因包括病毒性肝炎、脂肪性肝病及藥物性肝病等[1-2]。在各種病因的作用下，肝細(xì)胞的死亡會(huì)引起肝臟組織的病理改變，最終導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化或肝癌等不良后果[3-4]。肝纖維化是多種慢性肝病所致肝細(xì)胞慢性損傷后持續(xù)發(fā)展的共同病理過(guò)程[5]，肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)的活化是導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生和發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。在肝損傷因素的作用下，HSCs從脂質(zhì)存儲(chǔ)周細(xì)胞分化為表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的肌成纖維細(xì)胞，引起細(xì)胞外基質(zhì)成分的改變，最終導(dǎo)致以Ⅰ型膠原(type Ⅰ collagen，COL1A1)為主的細(xì)胞外基質(zhì)沉積，這是肝纖維化形成的重要環(huán)節(jié)之一[6-7]。外泌體是指包含了復(fù)雜RNA和蛋白質(zhì)的盤狀囊泡[8]，天然存在于血液、唾液、尿液、腦脊液及乳汁等體液中，參與了細(xì)胞間的信息通訊。分化抗原9(cluster of differentiation，CD9)和腫瘤易感基因101(tumor susceptibility gene，TSG101)是外泌體常見(jiàn)的表面標(biāo)志物，可用于外泌體的鑒定[9]。近年來(lái)，較多研究發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞外泌體在肝纖維化過(guò)程中起重要作用、并與HSC的活化有關(guān)[10-11]。目前大部分針對(duì)肝細(xì)胞外泌體的研究均來(lái)自于細(xì)胞系，本研究擬分離培養(yǎng)原代肝細(xì)胞，提取肝細(xì)胞外泌體、并與活化的HSC共培養(yǎng)，觀察HSC活化及纖維化相關(guān)基因的表達(dá)，初步探索正常肝細(xì)胞外泌體對(duì)HSC活化的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑及儀器

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠，7～8周齡，體質(zhì)量約20 g，購(gòu)于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程均符合《中華人民共和國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》及倫理要求。

1.1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 實(shí)驗(yàn)所用主要試劑包括：D-Hanks液，小鼠肝細(xì)胞專用培養(yǎng)基，Ⅳ型膠原酶，青鏈霉素混合液，DMEM/F12培養(yǎng)基，1%磷鎢酸負(fù)染色液，糖原PAS染色液(細(xì)胞專用)；抗細(xì)胞角蛋白18(Anti-cytokeratin 18，Anti-CK18)抗體，Aniti-TSG101抗體，Aniti-CD9抗體，Anti-α-SMA抗體，山羊抗兔二抗488，山羊抗兔HRP二抗；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)試劑盒，exoEasy Maxi Kit試劑盒。實(shí)驗(yàn)儀器主要包括：5810R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，Q6實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，200目篩網(wǎng)，恒溫?fù)u床等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1小鼠原代肝細(xì)胞及HSC的分離培養(yǎng)C57BL/6小鼠麻醉后，采用Selgen兩步膠原酶灌注法[12]分離提取小鼠原代肝細(xì)胞，經(jīng)3次低速離心進(jìn)一步純化、專用培養(yǎng)基5 mL重懸細(xì)胞，吸取細(xì)胞懸液80 μL用于細(xì)胞計(jì)數(shù)和臺(tái)盼藍(lán)染色，其余細(xì)胞懸液接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中；24 h觀察到細(xì)胞貼壁后，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)洗2次，更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每3～5 d更換1次培養(yǎng)基。在原位兩步膠原酶灌流法的基礎(chǔ)上，結(jié)合密度梯度離心分離肝臟原代HSCs，將分離的HSCs重懸于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，24～48 h換液，繼續(xù)培養(yǎng)約1周。

1.2.2小鼠原代肝細(xì)胞糖原染色 提取小鼠原代肝細(xì)胞制作爬片、使用PAS固定液固定15 min，水洗晾干后加入氧化劑室溫氧化18 min，流水沖洗2次，蒸餾水浸洗2次，加入Schiff Reagent后置于室溫陰暗處浸染16 min，亞硫酸鈉滴洗2次，每次2 min。流水沖洗、經(jīng)Mayer蘇木素復(fù)染1 min。水洗晾干后顯微鏡下觀察，采集圖像。

1.2.3小鼠原代肝細(xì)胞CK-18細(xì)胞化學(xué)染色 提取小鼠原代肝細(xì)胞制作爬片、室溫下經(jīng)4%多聚甲醛固定30 min、PBS洗滌爬片3次，0.5%Triton-X 100室溫處理15 min、PBS洗滌爬片，滴加內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑后室溫下孵育10 min、PBS洗滌爬片3次，滴加封閉用正常山羊血清工作液、室溫封閉15 min。傾去血清，滴加CK-18一抗(abcam，1 ∶200)，37 ℃孵育60 min；PBS洗滌爬片3次后滴加生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG、室溫孵育15 min。PBS洗滌爬片3次，滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液、室溫孵育15 min；PBS洗滌爬片，DAB顯色液室溫孵育8 min、自來(lái)水沖洗、蘇木素染色孵育30 s，分化、沖洗返藍(lán)，水洗晾干后顯微鏡下觀察，采集圖像。

1.2.4小鼠原代HSC鑒定 原代HSC培養(yǎng)1周、接種于6孔板內(nèi)的無(wú)菌蓋玻片上，細(xì)胞貼壁爬片后棄去培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定爬片15 min，PBS浸洗玻片，0.5%Triton-X 100室溫通透20 min，滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min。傾去封閉液，玻片上滴加足夠量的α-SMA一抗(1 ∶250)，4 ℃孵育過(guò)夜。PBS浸洗玻片3次，滴加適量熒光二抗，室溫孵育60 min，滴加DAPI避光孵育5 min。用含熒光淬滅劑的封片液封片，倒置熒光顯微鏡下觀察，采集圖像。

1.2.5小鼠原代肝細(xì)胞外泌體的提取 原代肝細(xì)胞培養(yǎng)24 h貼壁后，PBS洗2次，更換為10%無(wú)外泌體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24～48 h留取原代肝細(xì)胞上清32 mL，經(jīng)0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾，按exoEasy Maxi Kit試劑盒操作步驟提取外泌體。BCA試劑盒定量外泌體蛋白濃度，將樣品-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6小鼠原代肝細(xì)胞外泌體形態(tài) 取外泌體懸液10 μL，銅網(wǎng)蓋在外泌體懸液上沉淀1 min，濾紙吸去浮液。吸取1%磷鎢酸負(fù)染液10 μL，銅網(wǎng)蓋在復(fù)染液上染色1 min，濾紙吸去浮液。常溫干燥數(shù)分鐘、上機(jī)，透射電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài)，采用80 kV成像。

1.2.7小鼠原代肝細(xì)胞外泌體濃度和粒徑 去離子水清洗樣本池后，納米顆粒跟蹤分析儀(Nanoparticle tracking analyzer，NTA)分析經(jīng)聚苯乙烯微球(110 nm)校準(zhǔn)。采用PBS清洗樣本池，將稀釋后的樣本進(jìn)樣檢測(cè)，ZetaView 8.04.02軟件進(jìn)行分析。

1.2.8檢測(cè)小鼠原代肝細(xì)胞外泌體標(biāo)志物 取外泌體蛋白20 μg經(jīng)10%的SDS-PAGE凝膠，120 V恒壓電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)遷移至距離分離膠下緣約0.5 cm時(shí)，停止電泳。200 mA恒流轉(zhuǎn)膜70 min，5%脫脂牛奶室溫封閉2.5 h，加入CD9(abcam，1 ∶1 500)，TSG101(abcam，1 ∶1 000)抗體，置入4 ℃冰箱孵育過(guò)夜。經(jīng)TBST洗膜后加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(CST，1 ∶20 000)，室溫條件搖床孵育60 min，用Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)檢測(cè)熒光信號(hào)并成像。

1.2.9小鼠原代肝細(xì)胞外泌體與HSCs共培養(yǎng) 12孔板中原代HSCs生長(zhǎng)1周后，PBS洗2次，每孔加入無(wú)外泌體血清培養(yǎng)基500 μL，按BCA測(cè)定所得肝細(xì)胞外泌體濃度，以8 mg/L的濃度加入HSCs中共培養(yǎng)。

1.2.10HSC活化相關(guān)基因mRNA的表達(dá) 肝細(xì)胞外泌體與HSCs共培養(yǎng)24 h，提取細(xì)胞總RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書合成cDNA，采用Q6實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)：95 ℃變性1個(gè)循環(huán)30 s，PCR反應(yīng)：95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，共40 個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)過(guò)程中，在儀器上將自動(dòng)生成每個(gè)目的基因的PCR 融解曲線與擴(kuò)增曲線。檢測(cè)HSCs中α-SMA及COL1A1 mRNA的表達(dá)情況，小鼠α-SMA、COL1A1 及GAPDH(內(nèi)參照)基因的引物序列見(jiàn)表1。α-SMA、COL1A1 mRNA的表達(dá)水平通過(guò)2-ΔΔCt法確定[13]。

表1 小鼠α-SMA、COL1A1的引物序列Tab.1 Primer sequences of mouse α-SMA and COL1A1

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次，反應(yīng)結(jié)果為3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的校正結(jié)果；數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行處理及分析，使用GraphPad 8.0 軟件進(jìn)行繪圖，組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原代肝細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

臺(tái)盼藍(lán)染色顯示，細(xì)胞存活率為(87.80±3.27)%；分離的原代肝細(xì)胞呈圓形或橢圓形、透光度好，胞核清晰，每只小鼠可提取肝細(xì)胞數(shù)量約為2×107個(gè)；分離24～48 h時(shí)肝細(xì)胞完全貼壁，更換培養(yǎng)基為10%無(wú)外泌體血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，鏡下可見(jiàn)肝細(xì)胞胞體大、多邊形或不規(guī)則形，呈單核或雙核，胞漿豐富，細(xì)胞可穩(wěn)定貼壁5～7 d(見(jiàn)圖1A～C)；肝細(xì)胞貼壁培養(yǎng)48 h的糖原染色顯示，肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)見(jiàn)染成紫紅色的糖原顆粒(圖1D)；抗CK-18免疫細(xì)胞化學(xué)染色示，肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)見(jiàn)染成棕黃色的CK-18抗原，呈均勻顆粒狀分布(圖1 E)；光鏡下觀察肝細(xì)胞形態(tài)、糖原染色及免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示，體外培養(yǎng)小鼠原代肝細(xì)胞純度>95%。

注：A為原代小鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)12 h、B為24～28 h、C為5 d(臺(tái)盼藍(lán)染色，×100)，D為肝細(xì)胞糖原染色(200×)，E為肝細(xì)胞CK-18免疫細(xì)胞化學(xué)染色(200×)。圖1 原代小鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定Fig.1 Culture and identification of primary mouse hepatocytes

2.2 小鼠HSC的培養(yǎng)及鑒定

分離的HSCs重懸于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，24～48 h換液，約1周左右細(xì)胞出現(xiàn)明顯增殖，細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)板，光鏡下見(jiàn)HSCs呈典型的肌成纖維樣細(xì)胞形態(tài)，免疫熒光染色顯示α-SMA陽(yáng)性率>90%(圖2)。

注：A為光鏡下HSC呈典型的肌成纖維樣細(xì)胞形態(tài)(100×)，B為HSC細(xì)胞免疫熒光染色(200×)。圖2 小鼠原代肝臟HSCs培養(yǎng)及鑒定Fig.2 Culture and immunofluorescence staining of primary mouse HSCs

2.3 原代肝細(xì)胞外泌體提取及鑒定

提取的小鼠原代肝細(xì)胞貼壁24 h后，更換為10%無(wú)外泌體血清的培養(yǎng)基，24～48 h收集細(xì)胞上清，取原代肝細(xì)胞上清液32 mL提取外泌體。透射電子顯微鏡下觀察，肝細(xì)胞外泌體多為圓形或橢圓形、呈雙層膜樣結(jié)構(gòu)，直徑約100 nm(圖3A)； NTA結(jié)果顯示外泌體樣品平均粒徑<150 nm，直徑<145 nm的外泌體約占94.4%(圖3B)。Western blot可見(jiàn)樣品中有外泌體標(biāo)志物CD9和TSG101的表達(dá)(見(jiàn)圖3C)。

注：A為原代肝細(xì)胞外泌體電鏡圖像，B為原代肝細(xì)胞外泌體NTA檢測(cè)結(jié)果，C為Western blot檢測(cè)原代肝細(xì)胞外泌體及肝細(xì)胞CD9、TSG101的表達(dá)結(jié)果。圖3 原代肝細(xì)胞外泌體鑒定Fig.3 Identification of exosomes from primary hepatocytes

2.4 原代肝細(xì)胞外泌體對(duì)HSC活化的影響

將原代肝細(xì)胞外泌體與HSCs共培養(yǎng)24 h后，提取HSCs 總mRNA，檢測(cè)原代肝細(xì)胞外泌體對(duì)HSCs活化的影響。qRT-PCR結(jié)果顯示，與空白組比較，肝細(xì)胞外泌體組HSCs中α-SMA、COL1A1 mRNA的表達(dá)明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。提示原代肝細(xì)胞外泌體可通過(guò)抑制HSCs的活化，降低COL1A1的合成，從而抑制肝纖維化。

注：(1)與空白組比較，P<0.05。圖4 肝細(xì)胞外泌體對(duì)HSC 中α-SMA、COL1A1 mRNA表達(dá)的影響Fig.4 Effect of hepatocyte exosomes on expression of HSC α-SMA and COL1A1 mRNA

3 討論

肝細(xì)胞是肝臟最主要的實(shí)質(zhì)細(xì)胞，參與了許多生理過(guò)程，肝細(xì)胞的分離對(duì)于肝病的研究具有重要意義，新鮮分離的原代肝細(xì)胞已成為生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的重要工具[14]。Berry等[15]首次報(bào)道了兩步膠原酶灌注技術(shù)成功分離原代大鼠肝細(xì)胞。在膠原酶灌注技術(shù)的基礎(chǔ)上，較多研究在肝細(xì)胞分離過(guò)程中使用Percoll進(jìn)行離心以純化肝細(xì)胞，Horner等[16]研究顯示，Percoll純化可導(dǎo)致大量的細(xì)胞損失，建議如果初始存活率高，可以省略這一步。本研究在原位兩步灌流法的基礎(chǔ)上，多次低速離心純化肝細(xì)胞，成功分離獲得原代肝細(xì)胞，且細(xì)胞存活率及純度較高。將原位兩步膠原酶灌流技術(shù)與密度梯度離心法結(jié)合，亦成功分離肝臟原代HSCs，可用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

外泌體是特指直徑在30～150 nm，包含了復(fù)雜RNA和蛋白質(zhì)的盤狀囊泡，是細(xì)胞活化或凋亡后釋放的細(xì)胞外囊泡，它的組成取決于其細(xì)胞來(lái)源及相關(guān)刺激因素[17-18]。肝臟細(xì)胞來(lái)源的外泌體攜帶細(xì)胞特異性蛋白和微小RNA(microRNA，miRNA)，為肝臟疾病提供診斷學(xué)生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)和治療靶點(diǎn)[19-20]。不同病因作用下可改變肝細(xì)胞外泌體內(nèi)含物的組成，調(diào)節(jié)肝纖維化的進(jìn)程[21-22]。此外，肝細(xì)胞外泌體能容易地通過(guò)肝竇內(nèi)皮，刺激各種非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，在信號(hào)傳遞中發(fā)揮重要作用，參與肝臟疾病的發(fā)病機(jī)制[23-24]。因此對(duì)肝細(xì)胞外泌體的研究能進(jìn)一步闡明慢性肝病、肝纖維化的發(fā)病機(jī)制。為更準(zhǔn)確了解肝細(xì)胞外泌體對(duì)HSCs的影響，本研究進(jìn)一步提取原代正常肝細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)，原代肝細(xì)胞在無(wú)外泌體血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好。exoEasy Maxi Kit試劑盒采用膜親和離心柱法從血漿、血清、細(xì)胞上清或其他生物液體中提取外泌體，取原代肝細(xì)胞上清液32 mL，通過(guò)膜親和離心柱法可順利提取原代肝細(xì)胞外泌體，并通過(guò)透射電鏡、NTA、Western blot三方面成功鑒定了原代肝細(xì)胞外泌體。Li等[25]將HepG2細(xì)胞系來(lái)源的外泌體(8 mg/L)與小鼠HSCs共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞系來(lái)源的外泌體可抑制HSCs中α-SMA及COL1A1的表達(dá)。所以，本研究將提取的原代正常小鼠肝細(xì)胞外泌體以8 mg/L的劑量與HSCs共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，原代正常肝細(xì)胞外泌體與HSCs共培養(yǎng)后，HSCs活化的標(biāo)志α-SMAmRNA明顯降低，COL1A1 mRNA的表達(dá)亦明顯降低，提示原代正常肝細(xì)胞外泌體可抑制HSCs活化及纖維化相關(guān)基因的表達(dá)。

綜上所述，本研究成功分離了原代小鼠肝細(xì)胞并獲得原代正常肝細(xì)胞外泌體，明確了正常肝細(xì)胞外泌體能抑制HSC的活化，為進(jìn)一步探索不同病因下肝細(xì)胞外泌體內(nèi)含物的變化，肝細(xì)胞外泌體在肝纖維化過(guò)程中的作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。