姜其慧，王云杰，王存芳，鄧金祥，余炳勝，李幼貞，龐濤

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物：ICR小鼠，雄性，體質(zhì)量25～28 g，購自南京江寧區(qū)青龍山實驗動物繁育中心，每只小鼠使用一次。飼養(yǎng)于中國藥科大學(xué)藥學(xué)動物實驗中心清潔型動物房，動物房保持溫度(22±3)℃,相對濕度(55±3)%，采用12 h晝夜節(jié)律控制，保持食物和水源充足，適應(yīng)環(huán)境3 d進行實驗。(2)儀器：Varioskan Flash全波長酶標儀(美國ThermoFisher)；R500通用型小動物麻醉機(瑞沃德生命科技有限公司)；一次性1 ml注射器(河南省歐冠醫(yī)療器械有限公司)；小型秒表計時器(上海皓元股份有限公司)；(3)藥物：廿一味植物藥是一種廿一味中藥植物復(fù)方功能制劑，由廣東隆賦藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)提供的成藥(批號：190401)，屬于夜用裝。戊巴比妥鈉購于上海信裕生物科技有限公司。異氟烷(深圳瑞沃德生命科技有限公司)；總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)、α-羥基丁酸脫氫酶(α-HBDH)、肌酸激酶(CK)、尿素(UREA)等檢測試劑盒均購自于上?？迫A生物工程股份有限公司。

1.2 實驗方法 將104只ICR小鼠分為3個實驗組：安全性實驗24只，戊巴比妥鈉閾上劑量睡眠實驗40只，戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗40只。每個實驗組按照體質(zhì)量隨機分為4亞組，分別為陰性對照(CN)亞組(生理鹽水)，廿一味植物藥低劑量亞組(0.1 g/kg)、中劑量亞組(1 g/kg)、高劑量亞組(2 g/kg)。灌胃給藥，將廿一味植物藥溶于適量生理鹽水，分別配制成低、中、高劑量，保持小鼠灌胃體積為0.2 ml，陰性對照亞組灌胃給等量生理鹽水，連續(xù)給藥28 d，隨小鼠生長體質(zhì)量變化而調(diào)整給藥。

1.2.1 安全性實驗：每周測定并記錄各亞組小鼠體質(zhì)量。末次給藥后1 h，使用小型動物麻醉機麻醉小鼠，摘取眼球收集血液，靜置2～3 h后，在4 ℃離心機離心收集血清，根據(jù)試劑盒說明書，檢測各臟器毒性指標。其中肝臟毒性指標為ALT、TC、TG，心臟毒性指標為AST、LDH、CK及α-HBDH，腎臟毒性指標為UREA；將小鼠安樂死，取心、肝、脾、肺、腎、腦等各亞組小鼠臟器，稱質(zhì)量，計算并臟器系數(shù)，臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量/體質(zhì)量×100%，同時取各臟器進行脫水固定及HE染色。

1.2.2 戊巴比妥鈉閾上劑量睡眠實驗[5]：末次給藥30 min后，各亞組小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉45 mg/kg(戊巴比妥鈉使用生理鹽水配制，現(xiàn)配現(xiàn)用，所有小鼠100%入睡的最低劑量)，記錄小鼠從給藥后到翻正反射消失的時間，即為睡眠潛伏期；并記錄各亞組小鼠的睡眠時間，觀察廿一味植物藥對戊巴比妥鈉引起的睡眠潛伏期和睡眠時長的影響。

1.2.3 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗[6]：末次給藥30 min后，各亞組小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉30 mg/kg(戊巴比妥鈉使用生理鹽水配制，現(xiàn)配現(xiàn)用)，記錄各亞組小鼠翻正反射消失即入睡的只數(shù)，并計算睡眠發(fā)生率(睡眠發(fā)生率=入睡小鼠只數(shù)/各亞組小鼠總只數(shù)×100%)，比較廿一味植物藥不同劑量對戊巴比妥鈉閾下小鼠入睡發(fā)生率的影響。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Graph Pad Prism 6統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。表格計量數(shù)據(jù)以均值±標準差(Mean±SD)表示，圖計量數(shù)據(jù)以均值±標準誤(Mean±SEM)；多組間比較均采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，采用Bonferroni檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 安全性實驗

2.1.1 廿一味植物藥對小鼠體質(zhì)量的影響：實驗開始前，各亞組小鼠稱質(zhì)量，給藥期間每周稱質(zhì)量。與陰性對照亞組相比，各亞組小鼠在不同時間段體質(zhì)量均無明顯差異(P>0.05)，即廿一味植物藥對各亞組小鼠體質(zhì)量的增長均無影響。見表1。

表1 各亞組小鼠28 d體質(zhì)量變化比較

2.1.2 廿一味植物藥對小鼠臟器系數(shù)的影響：隨著ICR小鼠生長周齡的變化，小鼠的臟器質(zhì)量和體質(zhì)量逐漸增加，但各亞組小鼠的臟器系數(shù)(臟器系數(shù)=臟器重量/體質(zhì)量×100%)并無明顯差異(P>0.05)。見圖1。

圖1 各亞組小鼠的臟器系數(shù)比較 (n=6)

2.1.3 廿一味植物藥對小鼠臟器毒性的影響：與陰性對照亞組相比，各濃度的廿一味植物藥對肝臟毒性指標ALT、TC、TG，心臟毒性指標AST、LDH、CK、α-HBDH及腎臟的毒性指標UREA均未產(chǎn)生明顯影響(P>0.05)。見圖2。

圖2 各亞組小鼠的臟器毒性指標比較 (n=6)

2.1.4 HE染色結(jié)果：HE染色觀察不同劑量廿一味植物藥對小鼠臟器的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與陰性對照亞組相比，不同劑量給藥組心臟心肌細胞結(jié)構(gòu)完整，心肌纖維排列緊密，細胞核質(zhì)緊密，心肌毛細血管無擴張充血現(xiàn)象；肝臟染色結(jié)果正常，細胞細胞核居中且大而圓，可以看到明顯核仁，肝小葉形態(tài)完整，無明顯變化。脾臟濾泡數(shù)量豐富，形態(tài)飽滿，脾竇形態(tài)完整，竇內(nèi)無壞死細胞和炎性細胞浸潤。肺部組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡完整，支氣管黏膜上皮及肺泡無變形，無炎性細胞滲出及聚集。腎臟切片在顯微鏡下可見結(jié)構(gòu)形態(tài)正常，腎小球形態(tài)正常，球后毛細血管無擴張充血現(xiàn)象。腦部組織神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，無明顯形態(tài)變化，且無大量炎性細胞浸潤。見圖3。

圖3 各亞組小鼠各臟器的HE染色切片(×40)比較

2.2 廿一味植物藥改善小鼠睡眠質(zhì)量的作用分析

2.2.1 戊巴比妥鈉閾上劑量睡眠實驗：在使用戊巴比妥鈉閾上劑量條件下，與陰性對照亞組相比，廿一味植物藥高、中、低各劑量均可明顯縮短小鼠進入睡眠的潛伏期(P<0.001)，且高、中、低各劑量可明顯延長各亞組小鼠的睡眠時間(P<0.001)，說明廿一味植物藥在改善睡眠方面與戊巴比妥鈉具有協(xié)同作用。見圖4。

注：與陰性對照亞組比較，aP<0.001

2.2.2 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗：在使用戊巴比妥鈉閾下劑量條件下，與陰性對照亞組相比，廿一味植物藥高、中劑量可明顯增加小鼠入睡的數(shù)目，明顯升高小鼠睡眠發(fā)生率(P<0.05)。見表2。

表2 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗

3 討 論

廿一味植物藥夜用裝主要由21味植物藥材組合而成，與本課題之前研究的廿一味植物藥日用裝在藥材組成上略有不同。其中有15味藥材組成相同，主要包括薤白、茯苓、葛根、木耳、山楂、肉桂、梔子、枸杞子、黃精、沙棘、金針菇、桂圓、白芷、甘草、烏藥葉。在這些相同成分中，葛根具有悠久的藥食兩用歷史，對神經(jīng)有明顯的保護作用[10]；梔子的主要成分梔子黃色素具有清心除煩、治療心腎不交的功效，可治療虛煩不眠、驚悸多夢，具有改善睡眠的作用[11]。肉桂屬樟科常綠喬木植物，中華本草中記載[12]，肉桂具有增加冠狀動脈及腦血流量的作用，通過改善腦血流量起到神經(jīng)保護作用，改善睡眠，且肉桂揮發(fā)油中桂皮醛具有鎮(zhèn)靜作用。桂圓、枸杞子性甘干無毒，是養(yǎng)腦益智上品[13]。這些相同藥材是廿一味植物藥實現(xiàn)保健品功能的基礎(chǔ)。

廿一味植物藥夜用裝與日用裝中有6味藥材組成不同。夜用裝中含有酸棗仁、百合、蓮子、黃花菜、橘皮、白果，而日用裝中含有桃仁、藿香、人參、丁香、干姜、菊花。本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)日用裝可通過增加腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和抗氧化作用進而起到改善記憶的作用[14]。而夜用裝中，百合味甘，性微寒，具有養(yǎng)陰潤肺、清心安神的功效[15-16]，百合作為中藥臨床上廣泛治療各種失眠癥狀。酸棗仁屬于中藥養(yǎng)心安神藥，為鼠李科植物酸棗的干燥成熟種子，味甘酸，性平，歸心肝經(jīng)，有養(yǎng)心益肝、安神斂汗之功效[17]，可治療虛煩不眠、驚悸多夢。酸棗仁味酸性平，有潤肺安神斂汗之效[18]；蓮子又名水芝丹，屬睡蓮科蓮屬，主要分布在福建等地[19]，蓮子性味甘寒無毒，具有安神解熱之功效[20]。黃花菜又名金針菜，古書記載“安五臟，利心志”，可治“夜少安寐”；黃花菜的乙醇提取物可通過強化小鼠大腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子系統(tǒng)和5-HT系統(tǒng)，進而表現(xiàn)為抗抑郁和促睡眠作用[21]。白果的主要成分是白果內(nèi)酯，具有改善腦動脈血流量的作用[22]。這幾種中藥組合使用，其復(fù)方制劑夜用裝可起到益氣補血、安神益腦的作用。

目前，受試藥物與巴比妥類聯(lián)合給藥檢測睡眠時間等指標是最經(jīng)典的藥理方法。通過觀察小鼠的睡眠潛伏期，睡眠時間及小鼠的入睡發(fā)生率等指標檢測實驗藥物的催眠作用。但由于戊巴比妥鈉經(jīng)過肝藥酶代謝，對肝藥酶有影響的藥物可能會延長睡眠時間等。因此還需進一步檢測戊巴比妥鈉閾下劑量實驗的動物入睡發(fā)生率，進一步確定受試藥物的催眠作用。本研究參照《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》的有關(guān)睡眠功能實驗改善后進行實驗。在戊巴比妥鈉閾上睡眠實驗中，與陰性對照亞組相比，廿一味植物藥夜用裝高、中、低各劑量亞組可明顯縮短小鼠的睡眠潛伏期，延長小鼠睡眠時間。在戊巴比妥鈉閾下催眠實驗中，與陰性對照亞組相比，廿一味植物藥夜用裝高、中劑量亞組可明顯提高小鼠的睡眠發(fā)生率，實驗證明廿一味植物藥夜用裝可起到協(xié)同戊巴比妥鈉改善睡眠的作用。并且在連續(xù)28 d的灌胃給藥后發(fā)現(xiàn)，與陰性對照亞組相比，廿一味植物藥夜用裝高、中、低各劑量亞組小鼠體質(zhì)量均無明顯變化，臟器系數(shù)、臟器毒性指標檢測并無明顯變化，且各亞組小鼠HE染色切片顯示并無明顯病理變化。

綜上所述，廿一味植物藥夜用裝具有改善睡眠的作用，并且在早期安全性評價中安全，無不良反應(yīng)，具有開發(fā)保健食品及臨床用藥的潛力。