張海燕，張賽，鄺振展，胡蓉,劉仲明 中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院，廣州5000；深圳市亞輝龍生物科技股份有限公司;華南理工大學(xué)

降鈣素原(PCT)是降鈣素的前肽物質(zhì)，廣泛應(yīng)用于感染性疾病的診斷及鑒別診斷，近年來PCT已經(jīng)成為全身性炎癥反應(yīng)、敗血癥、膿毒血癥等疾病的預(yù)警生物指標(biāo)之一[1]。目前，PCT的檢測方法主要有免疫熒光法、膠體金免疫層析法、凝膠層析法及高效液相色譜分析法等[2]，但現(xiàn)有的商品化熒光材料在高濃度或聚集狀態(tài)下通常發(fā)光會(huì)減弱甚至不發(fā)光，即聚集導(dǎo)致的熒光淬滅(ACQ)，從而嚴(yán)重影響了檢測靈敏度[3]。具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光(AIE)性能的熒光材料被證實(shí)在聚集態(tài)及固態(tài)下均具有較高的發(fā)光性能，可有效減少ACQ現(xiàn)象，廣泛應(yīng)用于檢測、成像等諸多領(lǐng)域[4]。苯并[1,2-b:4,5-b′]二噻吩(BDT)是一種重要的含硫雜環(huán)，具有較大的共軛平面等特點(diǎn)[5,6]，能賦予體系優(yōu)異的光學(xué)性能。此外，BDT是一種典型的給電子基團(tuán)，便于構(gòu)筑給-受體(D-A)型結(jié)構(gòu)，調(diào)控發(fā)光性能。2019年2～8月，本研究制備了含BDT及對BDT氧化后的苯并[1,2-b：4,5-b′]-二噻吩1,1,5,5-四氧化物(BDTO)的系列衍生物，篩選BDT和BDTO經(jīng)三苯胺(TPA)、3位連接咔唑(PcZ)、9位連接咔唑(CzP)及叔丁基(TCzP)分子結(jié)構(gòu)修飾后具有高發(fā)光性能的納米材料，并將其應(yīng)用于血清PCT的磁微球免疫熒光分析檢測。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 血清樣本：檢測確認(rèn)后的不同濃度血清PCT樣品由中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院檢驗(yàn)科提供。主要試劑：300 μm粒徑磁珠標(biāo)記的抗PCT捕獲抗體(0.1 mg/mL)、熒光微球FM02標(biāo)記的抗PCT檢測抗體(1 mg/mL)均購自深圳市亞輝龍生物科技股份有限公司，清洗液(含0.2% Tween的PBS溶液)、酶聯(lián)免疫熒光試劑均購自梅里埃診斷產(chǎn)品有限公司。主要儀器：F97熒光分光光度計(jì)購自上海棱光技術(shù)有限公司，ThermoCell MiXing Block MB-102恒溫金屬浴購自杭州博日科技有限公司，八通道磁分離架購自德國Merck Millipore公司。

1.2 BDT、BDTO的分子結(jié)構(gòu)修飾 參照Zhen等[7]的方法，對BDT、BDTO進(jìn)行TPA、PcZ、CzP及TCzP分子結(jié)構(gòu)修飾，制備TPA-BDT、TPA-BDTO、PcZ-BDT、PcZ-BDTO、CzP-BDT、CzP-BDTO、TCzP-BDT、TCzP-BDTO等8種BDT、BDTO化合物，其結(jié)構(gòu)式見圖1。以CzP-BDT及CzP-BDTO為例，CzP-BDT的制備方法：在125 mL的兩口瓶中加入604 mg(1 mmol)雙溴苯并二噻吩、1 150 mg(4 mmol)咔唑硼酸、58 mg四(三苯基膦)鈀(0.05 mmol)和553 mg碳酸鉀(4 mmol)，抽換氣3次之后加入甲苯∶乙醇∶水(體積比為8∶1∶1)150 mL，加熱反應(yīng)12 h后，冷卻至室溫；倒入蒸餾水中，二氯甲烷萃取3次，合并萃取得到的有機(jī)層溶液，飽和碳酸氫鈉洗2次、水洗3次；無水硫酸鎂干燥，過濾后將有機(jī)溶劑通過旋蒸除去；采用柱層析法進(jìn)行分離提純，最后得到黃色固體產(chǎn)物CzP-BDT。CzP-BDTO的制備方法：在125 mL的兩口瓶中加入670 mg(1 mmol)雙溴苯并氧化二噻吩、1 150 mg(4 mmol)咔唑硼酸、58 mg四(三苯基膦)鈀(0.05 mmol)和553 mg碳酸鉀(4 mmol)，其余步驟同CzP-BDT的制備，最后得到橙紅色固體產(chǎn)物CzP-BDTO。采用核磁(1H-NMR和13C-NMR)以及高分辨質(zhì)譜對8種BDT、BDTO化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征分析，結(jié)果顯示其表征數(shù)據(jù)與Zhen等[7]的研究結(jié)果一致，證實(shí)所制備的化合物與預(yù)期一致。

圖1 8種BDT、BDTO化合物的結(jié)構(gòu)式

1.3 高發(fā)光性能納米材料的篩選

1.3.1 發(fā)光性能相關(guān)指標(biāo)檢測 將1.2得到的8種化合物溶解在四氫呋喃(THF)中，分別在紫外-可見分光光度計(jì)及熒光光譜儀上分析其紫外吸收光譜以及熒光發(fā)射光譜，以此判斷其最大吸收波長(λabs)、最大發(fā)射波長(λem)及Stokes位移。Stokes位移越大表示其發(fā)射的熒光越不容易被自吸收，即發(fā)光效率越高。將1.2得到的相同濃度的8種化合物(10 μmol/L)分別溶解在THF溶液(10 μmol/L，溶液態(tài))和90%去離子水(THF∶H2O=1∶9，10 μmol/L，聚集態(tài))中，用各自的λabs作為激發(fā)光源，測試其分別在溶液態(tài)及聚集態(tài)的絕對量子產(chǎn)率。絕對量子產(chǎn)率越高表示在相同激發(fā)條件下材料的發(fā)光性能越高，信噪比越高，即檢測的靈敏度越高。

1.3.2 在水中的聚集態(tài)行為觀察 利用動(dòng)態(tài)光散射(DLS)法觀察8種納米材料在水中的分散行為。以CzP-BDT為例，將CzP-BDT分散在水中(10 μmol/L)，總體積不超過1 mL，靜置2 min排除水溶液中的氣泡，在DLS儀器上檢測其粒徑分布，平行檢測3次得到最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。以粒徑分布判斷其在水中的分散性，在水中分散較好的疏水性分子越容易制備得到納米粒子，且粒徑分布越好、穩(wěn)定性越高。其他化合物的粒徑表征均與CzP-BDT一致。

1.4 CzP-BDT納米粒子的包裝及標(biāo)記 ①CzP-BDT納米粒子的包裝：采用改進(jìn)的共沉淀技術(shù)[7]?；贒SPE-PEG-Mal聚合物作為包覆基質(zhì)，通過注入含有CzP-BDT和DSPE-PEG-Mal的THF溶液，制備CzP-BDT納米粒子，并分散于去離子水中。經(jīng)過連續(xù)超聲處理形成CzP-BDT納米粒子，DLS持續(xù)檢測，結(jié)果顯示其具有高穩(wěn)定性、良好的水分散性，此外采用的包覆基質(zhì)末端為羧基，使其表面易于功能化。將制備得到的CzP-BDT納米粒子行DLS檢測,結(jié)果顯示CzP-BDT納米粒子的水合粒徑為347 nm。②CzP-BDT納米粒子的標(biāo)記：采用酰胺縮合一步法對CzP-BDT納米粒子標(biāo)記抗PCT檢測抗體，在納米粒子水溶液中加入N-羥基琥珀酰亞胺及1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽活化納米粒子表面的羧基，攪拌30 min后，加入抗體，繼續(xù)反應(yīng)5 h。

1.5 血清PCT檢測 ①采用熒光微球FM02的磁微球免疫熒光分析法(簡稱FM02法)。用生理鹽水將濃度為75 ng/mL的血清PCT樣品分別稀釋為45、30 ng/mL。取濃度分別為45、30、<0.05 ng/mL的血清PCT樣品和生理鹽水各100 μL，分別與磁珠標(biāo)記的抗PCT捕獲抗體(0.1 mg/mL)和熒光微球FM02標(biāo)記的抗PCT檢測抗體(0.1 mg/mL)各100 μL振蕩混勻；37 ℃條件下孵育20 min，置于磁分離架靜置2 min，清洗液清洗后復(fù)溶，在470 nm激發(fā)波長下檢測其熒光發(fā)射光譜。②采用CzP-BDT的磁微球免疫熒光分析法(簡稱CzP-BDT法)。用生理鹽水將濃度為75 ng/mL的血清PCT樣品分別稀釋為45、30 ng/mL。取濃度分別為45、30、<0.05 ng/mL的血清PCT樣品和生理鹽水各100 μL，與磁珠標(biāo)記的抗PCT捕獲抗體(0.1 mg/mL)和CzP-BDT納米粒子標(biāo)記的抗PCT檢測抗體(0.1 mg/mL)各100 μL振蕩混勻；37 ℃條件下孵育20 min，置于磁分離架靜置2 min，清洗液清洗后復(fù)溶，在364 nm激發(fā)波長下檢測其熒光發(fā)射光譜。記錄兩種方法檢測時(shí)在最大發(fā)射峰處的熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 8種BDT、BDTO化合物的發(fā)光性能相關(guān)指標(biāo)檢測結(jié)果 8種化合物在聚集態(tài)均有較強(qiáng)的熒光發(fā)射，其λem均在可見光范圍內(nèi)，BDT化合物的λem為453～475 nm、BDTO化合物的λem為573～630 nm；在同種BDT或BDTO化合物中，PcZ、CzP、TCzP修飾后化合物的λabs、λem差異較小，而TPA修飾后化合物較前面三者修飾后化合物的λabs、λem均有一定程度紅移，即向長波長方向移動(dòng)；BDTO化合物的λabs、λem相較于BDT化合物均發(fā)生紅移。BDTO化合物的Stokes位移普遍大于BDT化合物，而CzP修飾化合物的Stokes位移大于TPA、TCzP和TCzP修飾化合物。CzP-BDT、TCzP-BDT和TCzP-BDTO聚集態(tài)的絕對量子產(chǎn)率高于溶液態(tài)，BDTO化合物在溶液態(tài)、聚集態(tài)中的絕對量子產(chǎn)率普遍高于BDT化合物。8種化合物中，CzP-BDT無論在溶液態(tài)還是聚集態(tài)均具有較高的發(fā)光性能。見表1。

表1 8種BDT、BDTO化合物的發(fā)光性能相關(guān)指標(biāo)檢測結(jié)果

2.2 8種BDT、BDTO化合物在水中的粒徑分布情況比較 除TCzP-BDT外，其他3種BDT化合物在水中的粒徑分布相差不大；4種BDTO化合物在水中的粒徑分布只有細(xì)微差異，并且BDTO化合物在水中的分散性較BDT化合物均有一定程度的增加。CzP-BDT在水中雖然分布不均，但在BDT化合物中，CzP-BDT在低于100 nm部分有較多的分布，綜合其較高的發(fā)光性能，選擇CzP-BDT作為進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)的納米材料。8種BDT、BDTO化合物在水中的粒徑分布情況見圖2。

圖2 8種BDT、BDTO化合物在水中的粒徑分布情況

2.3 兩種方法檢測不同濃度血清PCT的熒光光譜比較 在470 nm激發(fā)光波長下，F(xiàn)M02法檢測的發(fā)射光譜為500～650 nm，在525 nm處測得最大熒光強(qiáng)度；其中檢測45 ng/mL的血清PCT樣品時(shí)在525 nm處熒光強(qiáng)度為415.5，檢測30 ng/mL和<0.05 ng/mL的血清PCT樣品以及生理鹽水時(shí)在525 nm處熒光強(qiáng)度分別為197.5、197.5、146.8。在340 nm激發(fā)光波長下，CzP-BDT法檢測的發(fā)射光譜為500～650 nm，在525 nm處測得最大熒光強(qiáng)度；其中檢測45 ng/mL的血清PCT樣品時(shí)在525 nm處熒光強(qiáng)度為1 064.0，檢測30 ng/mL和<0.05 ng/mL的血清PCT樣品以及生理鹽水時(shí)在525 nm處熒光強(qiáng)度分別為766.2、664.0、456.9。兩種方法均能檢出45 ng/mL的血清PCT樣品，但對于30 ng/mL、<0.05 ng/mL的血清PCT樣品，只有采用CzP-BDT納米粒子進(jìn)行免疫熒光檢測能實(shí)現(xiàn)有效鑒別并與生理鹽水進(jìn)行區(qū)分。兩種方法檢測不同濃度血清PCT的熒光光譜見圖3。

3 討論

3.1 高發(fā)光性能納米材料的發(fā)光性能相關(guān)指標(biāo)

3.1.1 λemλem與給電子能力相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，8種化合物在聚集態(tài)都有較強(qiáng)的熒光發(fā)射，其λem均在可見光范圍內(nèi)；同種BDT或BDTO化合物中，PcZ、CzP、TCzP修飾后化合物的λabs、λem差異較小，而TPA修飾后化合物較前面三者修飾后化合物的λabs、λem均有一定程度紅移；說明TPA較PcZ、CzP、TCzP的給電子能力更強(qiáng)，其化合物的D-A效果更明顯。此外，BDTO化合物的λabs、λem相較于BDT化合物均發(fā)生紅移，說明將噻吩氧化以后能夠使BDTO化合物形成D-A型結(jié)構(gòu)，提高其吸電子能力。由此可見，同種類型取代基對化合物的發(fā)光性能影響不大，其發(fā)光性能主要取決于骨架結(jié)構(gòu)。

3.1.2 Stokes位移 Stokes位移大小取決于取代基給電子能力，取代基給電子能力越弱，Stokes位移就越大。由于本研究所選用的發(fā)光材料激發(fā)態(tài)構(gòu)型相較于基態(tài)變化較大，導(dǎo)致其激發(fā)態(tài)能量耗散而具有較大的Stokes位移，較大的Stokes位移可以使化合物的發(fā)射光受激發(fā)光影響小，防止自身ACQ，能量損失少，能有效提高檢測時(shí)的信噪比[8]。本研究結(jié)果顯示，這8種化合物均具有較大的Stokes位移(68～127 nm)，同時(shí)BDTO化合物的Stokes位移大于BDT化合物，而CzP修飾化合物的Stokes位移大于TPA、TCzP、TCzP修飾化合物。

注：A為FM02法；B為CzP-BDT法。

3.1.3 發(fā)光效率 本研究結(jié)果顯示，BDTO化合物的發(fā)光效率普遍高于BDT化合物，提示噻吩環(huán)的氧化能夠有效提高化合物在溶液態(tài)及聚集態(tài)的發(fā)光效率。分析原因，氧化噻吩中的硫元素(S)被氧化以后，S上面的孤對電子會(huì)消失，降低單線態(tài)到三線態(tài)之間的系間竄躍，從而提高材料的量子產(chǎn)率；此外，氧化噻吩會(huì)有效提高π-π之間的距離，降低分子之間的相互作用，進(jìn)一步提高發(fā)光效率[9]。本研究中，相對于其他7種化合物，TCzP-BDTO聚集態(tài)的發(fā)光效率最高，推測是由于叔丁基的引入會(huì)進(jìn)一步降低分子間相互作用力，降低ACQ，從而提高固態(tài)發(fā)光量子效率。此外，CzP-BDT、TCzP-BDT和TCzP-BDTO聚集態(tài)的絕對量子產(chǎn)率高于溶液態(tài)，是因?yàn)殡S著聚集體的形成，其分子內(nèi)運(yùn)動(dòng)受限，從而有效抑制激發(fā)態(tài)能量以非輻射的形式耗散，提高了聚集態(tài)及固態(tài)發(fā)光效率，表現(xiàn)出明顯的AIE性能[10]。

3.1.4 在水中的聚集態(tài)行為 本研究結(jié)果顯示，除TCzP-BDT外，其他3種BDT化合物在水中的粒徑分布相差不大，說明TCzP的引入會(huì)大大增加化合物的疏水性，從而導(dǎo)致粒徑增加。本研究BDT化合物具有較大且規(guī)整的平面結(jié)構(gòu)，能夠增加體系的電子離域能力，賦予體系良好的光學(xué)性能。推測是因?yàn)猷绶原h(huán)的氧化引入了氧原子，有效增加了BDTO化合物與水的相互作用，從而提高了BDTO化合物在水溶液中的分散性和溶解性[11]。這為制備在水環(huán)境中具有良好分散性的發(fā)光材料提供了行之有效的策略。BDTO化合物能夠提高分子內(nèi)吸電子能力，形成D-A型結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致最高占據(jù)軌道(HOMO)與最低空軌道(LUMO)分離，使其吸收及發(fā)射均向長波移動(dòng)；并且氧化噻吩會(huì)進(jìn)一步提高化合物在水溶液及生理環(huán)境下的分散性，且這類化合物在聚集態(tài)下具有較高的發(fā)光效率，使得該類材料在生物大分子檢測方面具有非常好的前景。

針對上述8種化合物的光物理性能分析結(jié)果， CzP-BDT在水中雖然分布不均，但其在低于100 nm部分有較多的分布；綜合其發(fā)光性能，CzP-BDT是一種典型的AIE材料，擁有較大的Stokes位移及良好的光穩(wěn)定性，可用于制備穩(wěn)定性好、粒徑小的納米材料用于生物檢測。因此，本研究選擇CzP-BDT作為代表，用于研究具有良好發(fā)光性能的AIE材料在生物大分子檢測中的應(yīng)用。

3.2 血清PCT的免疫熒光檢測 熒光微球在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用價(jià)值，目前幾乎所有高性能、高附加值的熒光微球材料都被國外壟斷，我國熒光微球技術(shù)的發(fā)展處于一個(gè)滯后階段，開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)且產(chǎn)業(yè)化的高性能熒光微球已迫在眉睫。AIE材料是一種由中國科學(xué)家原創(chuàng)的新型發(fā)光材料，具有固態(tài)發(fā)光效率高、光穩(wěn)定性強(qiáng)和Stokes位移大等光學(xué)特性，將其應(yīng)用于熒光微球制備的研究，有望獲得性能優(yōu)異的功能性納米熒光材料[12]。

本研究結(jié)果顯示，兩種熒光材料的發(fā)射光譜非常相似，而CzP-BDT納米粒子的激發(fā)光波長比FM02熒光微球小，表明CzP-BDT納米粒子具有更大的Stokes位移。此外，相同濃度下熒光光譜分析顯示，相同條件下CzP-BDT納米粒子的熒光強(qiáng)度高于FM02，因此CzP-BDT納米粒子具有更高的量子效率，能有效提高檢測的信噪比和靈敏度。本研究結(jié)果顯示，相比FM02熒光微球，CzP-BDT納米粒子最高峰的熒光強(qiáng)度更高，說明CzP-BDT納米粒子的檢測分辨率更高；兩種方法均能檢出45 ng/mL的血清PCT，但對于30 ng/mL、<0.05 ng/mL的血清PCT，只有采用CzP-BDT納米粒子的熒光檢測方法能實(shí)現(xiàn)有效鑒別并與生理鹽水區(qū)分，說明CzP-BDT納米粒子具有更低的檢測限及更高的靈敏度。

綜上所述，本研究對BDT、BDTO分子結(jié)構(gòu)修飾后篩選出高發(fā)光性能的CzP-BDT納米粒子，其應(yīng)用于血清PCT免疫熒光檢測的靈敏度高于FM02熒光微球，有望應(yīng)用于臨床生物分子的熒光檢測，為發(fā)展具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的新一代發(fā)光材料及發(fā)光檢測技術(shù)打下基礎(chǔ)。隨著未來對納米粒子合成技術(shù)的改進(jìn)和載體與熒光物質(zhì)作用機(jī)理的深入研究，該類新型功能性熒光微球在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域可以得到進(jìn)一步發(fā)展與應(yīng)用。